Name: ウサギモデルにおける軟骨欠陥の改造と修理のためのマトリックス支援自家軟骨細胞移植 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 学ぶウサギ膝関節の軟骨欠陥治療法。自家軟骨細胞をマトリックスに播種して移植するMACT技術を詳しく解説。12週後の修復組織は均一で質が良く、再生医療の応用に期待が持てる画期的な手法です。

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このプロジェクトは、ドイツ研究協会（DFG、HE 4578/3-1）によって賄われていた。

A.軟骨生検（手術室、非滅菌準備室の手順1-5） <ol><li>適切に用量薬することができるように、手術後の体重を監視するために、ウサギ（ニュージーランドホワイトウサギ、女性、3.5〜4.0キロの体重、生後6ヶ月）の最終重量の制御を行う。 </li><li> 10 mg / kgをプロポフォールの静脈内注射によりウサギに麻酔を誘導する。 </li><li>挿管後、静脈内に1.5 mg / kg体重/分プロポフォール及び0.05 mg / kgでフェンタニルで麻酔を維持します。カプノグラフィ、パルスオキシメトリと脈拍数を用いて麻酔を監視する。 </li><li>電気クリッパー、真空毛皮でログオン操作する膝を剃る。 </li><li>徹底的に剃っているd膝を消毒、滅菌ドレッシングで​​ウサギの残りの部分をカバーしています。 </li><li>膝蓋骨を触診し、膝蓋骨の内側に皮膚切開を行います。 </li><li>無菌条件下で内側parapatellar関節切開による膝関節を開きます。どんな小さなSUを切断回避しようperficial血管。 </li><li>横方向に膝蓋骨を置換。 </li><li>任意の異常や巨視的軟骨病変に対する膝関節を点検。 </li><li>慎重に滅菌メス（ 図1）と滑 ​​車骨大腿の外に小さな軟骨片（2-3 mm）の皮をむく。 </li><li>使用直後の体外培養右を続行する完全培地（DMEM + 10％ウシ胎児血清（FCS）+ 1％ペニシリン/ストレプトマイシン（ペニシリン/ストレプトマイシン））で50 mlチューブにこれらの軟骨生検を配置。 </li><li>欠陥をきれいにし、滅菌生理食塩水でそれらを洗い流してください。 </li><li>滑車の溝内に膝蓋骨の位置を変更。 </li><li>シングルボタンの縫合（4-0 VICRYL）、継続皮膚縫合（4-0モノクリル）と層における創傷閉鎖。吸収性縫合糸の素材を使用しています。 </li><li>最後に、水蒸気透過性ドレッシングスプレーで傷を封印。 </li></ol> 体外培養における B. <ol><li>生検Cを処理無菌層流の組織培養フード内操作後できるだけ早くartilageはピース。 </li><li>室温で3分間、500×gで遠心分離し、後続とのPBS中の滅菌収穫軟骨2倍を洗ってください。 </li><li> 30分間1ミリメートル3、50ミリリットルファルコンへの転送部分で軟骨をカットし、10ミリリットルトリプシン-EDTA（0.25％）および10 mlのPBSで30分間シェーカーでそれらを消化</li><li> 30分後、完全培地を添加することにより、トリプシン処理を停止する。その後、無血清培地（DMEM + 1％ペニシリン/ストレプトマイシン）のコラゲナーゼ（0.21 U / mg）を、12時間のために別のために軟骨の部分を横に振る。 </li><li>室温で3分間、170×gで得られた溶液を遠心分離。 </li><li> 5ミリリットル完全培地中で細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>シード5ミリリットル完全培地で25cm 2の組織培養フラスコに上の孤立した軟骨細胞と37℃加湿組織培養インキュベーター中で保つ℃、5％CO 2。 </li><li> 80％の密度に軟骨細胞を成長させる。 </li><li>細胞fを放し3分間0.05％トリプシン-EDTAにさらす前に、PBS 2倍で洗浄することによりROMフラスコ。軟骨は切り離したら、10μlの完全培地の添加によりトリプシン処理を停止します。 </li><li>完全培地中300 XG（3分）とペレットを再懸濁しでサスペンションを遠心分離。 </li><li>種子組織培養フラスコ中の細胞（75cm 2の ）と1:3（〜5,000細胞/ cm 2）ごとに5 日目または80％コンフルエント時で分割。 </li><li>トリパンブルー染色により細胞数と生存率を決定します。 </li></ol>マトリックスのC.の細胞播種<ol><li>上述したように、注入洗浄および剥離細胞に先立っ。細胞数を実行し、1.5 mlのマイクロチューブに5×10 4個の細胞を移す。その後、室温で5分間、500×gで遠心。 </li><li>行列の完全な飽和状態のために15μlの完全培地中でペレットを再懸濁します。 </li><li>無菌の生検によって滑車欠陥の正確な寸法に重層コラーゲン足場をカットパンチ。 </li><li>適切な大きさの組織培養皿（ 例えば、24ウェルプレート）に、プレース行列。 </li><li>マトリックスの多孔質、細胞接着面への種子の細胞。これは離れてマトリックスから細胞遊走を阻止。 </li><li>軟骨細胞の完全な遵守を可能にするために1時間インキュベーター内でさらに細胞培養培地なしで細胞播種行列をしておきます。 </li><li>新鮮な完全培地で培養容器（ 例えば 、24ウェルプレート）に続いて、場所細胞-マトリックス構築物。強力な遵守が期待されるにもかかわらず行列オフ任意の細胞を洗い流すないように注意してください。 </li><li>現在、細胞 - マトリックス構築物は、再移植のための手術室に取り出すことができる。 </li></ol> D.マトリックス支援自家軟骨細胞移植<ol><li> （A. 1-8）上記のように反対側の膝にparapatellar関節切開を行います。 </li><li>無菌の空気のoperatinと滑車溝に2つの孤立した軟骨欠損を作成Gパワードリル（直径3.6ミリメートル）。 </li><li>欠陥をきれいにし、滅菌生理食塩水で洗い流してください。 </li><li>注目はいつでも骨髄腔を開くために支払われるべきではない。必要であれば、出血に対する電気焼灼と欠陥の底部をシールします。 </li><li>多孔質の側面下に（ 図2）で培養軟骨細胞を播種行列を植え込む。その後、ドリル穴に圧入し、周囲の表面を洗い流す。 </li><li>安全な固定を保証するためにフィブリン糊を少し（TissucolデュオS）を移植した行列を封印。 </li><li>数回凝固した後、滑車溝内膝蓋骨を再配置し、膝関節への動きの完全な範囲を適用する。 </li><li>もう一度横膝蓋骨を置換し、不安定な固定のいずれかのイベントやサインを確認してください。行列は場所ではまだ開催されている必要があります。 </li><li>再び膝蓋骨を交換して、上記のようにドレッシング層とスプレーで創傷閉鎖して操作を終了します。 </li></ol>

<ol><li>Albrecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+and+cell+differentiation+in+matrix-associated+chondrocyte+transplantation+grafts%3A+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Gene expression and cell differentiation in matrix-associated chondrocyte transplantation grafts: a comparative study.</a> Osteoarthritis Cartilage. 19, 1219-1227 (2011).</li>
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<li>Kon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-generation+autologous+chondrocyte+implantation%3A+results+in+patients+older+than+40+years%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Second-generation autologous chondrocyte implantation: results in patients older than 40 years.</a> Am. J. Sports Med. 39, 1668-1675 (2011).</li>
<li>Gavenis, K., Schmidt-Rohlfing, B., Mueller-Rath, R., Andereya, S., Schneider, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+comparison+of+six+different+matrix+systems+for+the+cultivation+of+human+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">In vitro comparison of six different matrix systems for the cultivation of human chondrocytes.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 42, 159-167 (2006).</li>
<li>Niemeyer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristic+complications+after+autologous+chondrocyte+implantation+for+cartilage+defects+of+the+knee+joint%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Characteristic complications after autologous chondrocyte implantation for cartilage defects of the knee joint.</a> Am. J. Sports Med. 36, 2091-2099 (2008).</li>
<li>Tay, L. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+outcomes+of+alginate-embedded+allogenic+mesenchymal+stem+cells+versus+autologous+chondrocytes+for+the+repair+of+focal+articular+cartilage+defects+in+a+rabbit+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Treatment outcomes of alginate-embedded allogenic mesenchymal stem cells versus autologous chondrocytes for the repair of focal articular cartilage defects in a rabbit model.</a> The American Journal of Sports Medicine. 40, 83-90 (2012).</li>
<li>Brittberg, M., Nilsson, A., Lindahl, A., Ohlsson, C., Peterson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabbit+articular+cartilage+defects+treated+with+autologous+cultured+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Rabbit articular cartilage defects treated with autologous cultured chondrocytes.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. , 270-283 (1996).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

提示プロトコルは、ウサギのひざで人工的に作成された軟骨欠損へのその後の増殖および再移植のため自家軟骨細胞を単離する9,12,13を設立し、簡単に再現可能な技術を提供する。関節軟骨損傷のリモデリングおよび修復のための自家軟骨細胞の使用は満足な長期的結果を提供すること6臨床既に使用されている。 骨膜肥大や石灰化などのような主要な問題は、移植片が剥離またはドナー部位の罹患率は、自家軟骨細胞移植14の第一および第二世代で発生。したがって、研究者は、欠陥部位に軟骨細胞を提供する外因性生体吸収性材料を用いた手法を開発しました。アガロース15を使用する際に軟骨の特性を維持する上で三次元培養系の正の効果を繰り返し、例えば、実証されている、ポリ- dioxanonとポリグラクチン16、ポリエステル、ポリ（L-ラクチド）（PLLA）とポリ（D、L-ラクチド-コグリコリド）（PLGA）17、フィブリン12、ヒアルロン酸1...

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;試薬/器具名&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;メーカー&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;カタログ番号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;備考&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biochrom AG</td><td>F 0415</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ A</td><td>Roche</td><td>10 103 586 001</td><td>0.21 U/mg</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FCS)</td><td>PAN Biotech GmbH</td><td>3702-P103009</td><td></td></tr><tr><td>プロポフォール</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Biochrom AG</td><td>A 2213</td><td>10,000 U/ml/10,000 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>ダルベッコ PBS (1X)</td><td>Biochrom AG</td><td>L1815</td><td></td></tr><tr><td>エタノール (70%)</td><td>Merck KgaA</td><td>410230</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA 0.25 %/0.02 %</td><td>Biochrom AG</td><td>L2163</td><td>Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;およびMg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;不含PBS</td></tr><tr><td>フェンタニル</td><td>Delta Select GmBH</td><td>1819340</td><td></td></tr><tr><td>NaCl溶液 (0.9%)</td><td>Bbraun</td><td>8333A193</td><td></td></tr><tr><td>組織培養ディッシュ 100 mm/150 mm</td><td>TPP AG</td><td>93100/93150</td><td>培養面積 60.1 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;/147.8 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>組織培養フラスコ 25/75 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>TPP AG</td><td>90025/90075</td><td>25 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;, 75 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>遠心チューブ (50 ml)</td><td>TPP AG</td><td>91050</td><td>ガンマ線滅菌済み</td></tr><tr><td>血球計数器</td><td>Brand GmbH+Co KG</td><td>717810</td><td>ノイバウアー型</td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液 0.4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8154</td><td></td></tr><tr><td>スプレー ड्रेसिंग (OpSite)</td><td>Smith&amp;amp;Nephew</td><td>66004978</td><td>水蒸気透過性</td></tr><tr><td>Chondro-Gide&amp;Ograve;</td><td>Geistlich Pharma AG</td><td>30915.5</td><td></td></tr><tr><td>バイオプシーパンチ</td><td>pfm medical ag</td><td>48351</td><td></td></tr><tr><td>Tissucol Duo S</td><td>Baxter</td><td>3419627</td><td>0.5 ml</td></tr></tbody></table>

ウサギモデルにおける軟骨欠陥の改造と修理のためのマトリックス支援自家軟骨細胞移植

Matrix-assisted Autologous Chondrocyte Transplantation for Remodeling and Repair of Chondral Defects in a Rabbit Model

関節軟骨は自己再生1限られた容量を有するので、関節軟骨の欠陥が重大な健康問題と考えられている。未処理の軟骨病変は進行中の痛みにつながる、否定的に生活の質に影響を与えると変形性関節症のためにやすく。過去数十年の間に、いくつかの外科技術は、このような病変を治療するために開発されてきた。しかし、今まで、硝子関節軟骨を有する欠陥を覆う又は十分な長期の回復2-4を提供するという点で完全な修復を達成することは不可能であった。したがって、関節軟骨の損傷は、そのような組織工学などの再生技術のための主な目標のまま。多くの場合、繊維状または線維軟骨組織の形成をもたらす他の外科技術とは対照的に、組織工学は、完全に移植された細胞の軟骨産生能を使用して、元の関節軟骨複合体の構造および特性を回復することを目的とする。 Recent発展は再生軟骨の治療のための有望な可能性を開いた。 全層軟骨や骨軟骨病変の治療のための最初のセルベースのアプローチは、臨床自家軟骨細胞移植（ACI）5を開拓ラース·ピーターソンとマットBrittbergによって1994年に行われた。今日では、技術は臨床的にも、10〜20年後に移植6良好な臨床結果を維持し、膝の大硝子軟骨欠損の治療のために十分に確立されています。近年では、自家軟骨細胞の移植は、急速な進行を受けた。その後、細胞を植え替えされた人工的な三次元コラーゲンマトリックスの使用は、ますます人気7-9となった。 MACTが2つの外科的処置を含む：軟骨細胞を収集するために、まず、軟骨生検は、tの非体重を支える軟骨領域から行う必要がある彼は膝関節を。その後、軟骨細胞は、抽出、精製し、 インビトロで十分な細胞数に拡張されている。軟骨細胞は、その後、三次元マトリックス上に播種され、その後、再移植することができる。組織工学インプラントを調製する場合、増殖速度および分化能力が成功した組織再生10にとって極めて重要である。細胞担体としての三次元マトリクスの使用は、これらの細胞の特性11を支持すると考えられる。 以下のプロトコルは、3Dマトリックス（ 軟骨·ジッド 、Geistlichバイオマテリアル、Wollhusen、スイス）の上に軟骨生検、in vitroでのそれらの増殖とその播種から軟骨細胞を単離するための手法を要約し、デモンストレーションを行います。最終的に、ウサギの膝関節の人工的に作成された軟骨細胞の欠陥にマトリクス構築物の注入について説明する。この技術は、実験的な設定として使用することができる軟骨修復のさらなる実験のために。

記載外科技術は、人工軟骨欠損部に自家軟骨細胞の正常な分離と移植を可能にします。実験装置は、周囲の軟骨にインプラント統合の成功をもたらした。 in vivoでの 12週間後、軟骨欠損は、インプラント（ 図4）にせん断応力及び損傷を低減均一で無傷の表面で修復組織によって充填した。また、インプラントのない肥大や石灰化が見られなかった。修復組織は健全な周囲の軟骨組織と同等であった、硬いと固体品質を示した。インプラントの不十分な生体力学的特性のために隣接した軟骨に負荷の増加は時期尚早変性のリスクになるので、これは重要な側面であった。また、層間剥離グラフトは発生していない。術前に欠陥の同じサイズ、任意のfissuに膜をカットしたインプラントと周囲の軟骨の間にリングや裂け目は避けた。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4422/4422fig1.jpg" /> ...

ウサギの膝関節内の軟骨欠損の治療のための実験技術が記載されている。マトリックス上に播種自家軟骨細胞の移植は、満足の長期的な結果を提供する関節軟骨病変の改造や修理のために広く受け入れ方法です。マトリックス支援自家軟骨細胞移植（MACT）が標準化され、臨床的に確立された注入方法を提供しています。

関節軟骨は自己再生能力が限定的であるため、関節軟骨欠損は重大な健康問題と考えられています[1]。未治療の...

この手順の目的は、ウサギの膝関節における軟骨欠損の治療のための実験的手法について記述することです。まず、膝関節から軟骨生検を行い、自家軟骨細胞を採取します。次に、採取した軟骨細胞をin vitroで抽出し、精製して、十分な細胞数まで増殖させます。次に、軟骨細胞を三次元マトリックスに播種します。最終ステップとして、この三次元マトリックスを、ウサギの対側膝に作成した軟骨欠損部に移植します。最終的に、in vivoで12週間経過後、移植物を肉眼的に評価すると、修復組織は均質で完全な表面を有し、良好な質を示します。この手法は、関節軟骨修復の分野における重要な疑問の解決に寄与し、成長因子療法、遺伝子導入、および力学的特性の変化に関する実験的解析を促進する可能性があります。ウサギを麻酔した後、手術予定の膝を電気バリカンで剃毛します。次に、被毛を掃除機で吸引し、剃毛した膝を十分に消毒した後、動物の残りの部位を滅菌ドレッシング材で覆います。次に、膝蓋骨を触診します。膝蓋骨の内側に皮膚切開を加え、無菌条件下で膝蓋骨内側切開術により膝関節を開きます。膝蓋骨を外側に寄せ、滅菌されたメスを用いて、大腿骨滑車から2〜3 mm程度の小さな軟骨片を慎重に剥離します。軟骨生検組織を速やかに完全培地を含む50 milliliterチューブに入れ、その後、欠損部を滅菌生理食塩水で洗浄します。鉗子を用いて、残っている軟骨片を除去します。次に、膝蓋骨を滑車溝内に再配置し、シングルボタン縫合と吸収性皮膚連続縫合を用いて、創傷を層別に閉鎖します。最後に、水蒸気透過性のあるスプレー剤で創傷部を密封します。まず、採取した滅菌軟骨をPBSで2回洗浄し、その後、室温で500 ×gにて3分間遠心分離します。次に、軟骨を1 mm³の大きさに細切にします。それらを新しい50 milliliterのコニカルチューブに移し、10 millilitersのtrypsin、EDTA、および10 millilitersのPBSを用いて、シェーカー上で組織片を消化します。30分後、10 millilitersの完全培地を加えてトリプシン処理を停止させます。遠心分離後、上清を除去し、collagenase Aを含む無血清培地を加えます。その後、さらに12時間、組織片を振盪させます。得られた溶液を遠心分離し、細胞ペレットを5 mLの完全培地で再懸濁します。単離した細胞を25 cm²の組織培養フラスコに5 mLの完全培地で播種し、37 °C、5% CO2の加湿組織培養インキュベーターで培養します。細胞密度が80%に達したら、細胞をPBSで2回洗浄します。その後、0.05%トリプシン-EDTAに3分間さらします。細胞が剥離した後、完全培地5 mLを加えてトリプシン処理を停止させます。細胞を遠心分離した後、ペレットを完全培地で再懸濁し、75 cm²の組織培養フラスコに播種します。前述のようにin vitro培養から細胞を回収した後、細胞数をカウントし、5 × 10⁴個の細胞を1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。細胞懸濁液を遠心分離した後、マトリックスを完全に飽和させるため、ペレットを15 microlitersの完全培地で再懸濁します。次に、滑車切痕の欠損部位と同じ寸法に二層コラーゲン足場を切り出し、マトリックスを24ウェルプレートに配置します。そして、細胞がマトリックスから遊離するのを防ぐため、マトリックスの多孔性細胞接着側に軟骨細胞を播種します。その後、細胞を播種したマトリックスを、細胞の完全な接着を促すため、さらなる細胞培養用培地の中で1時間インキュベートします。最後に、細胞マトリックス構築物を、新鮮な完全培地が入った新しい24ウェルプレートに移します。デモンストレーションした通り、対側膝に膝蓋骨傍関節切開を行った後、滅菌エア駆動式パワードリルを使用して、滑車溝に直径 3.6 millimeter の独立した軟骨欠損を2箇所作成し、移植を開始します。次に、骨髄腔を開かないように注意しながら、欠損部を滅菌生理食塩水で洗浄します。次に、軟骨細胞を播種したマトリックスを、多孔質側を下にして移植し、少量のフィブリン糊を用いて移植したマトリックスを封止し、確実に固定します。膝蓋骨を滑車溝内に戻し、膝関節を数回、全可動範囲で動かします。その後、マトリックスを固定したまま、再び膝蓋骨を外側にずらして、固定に問題がないかを確認します。膝蓋骨を再設置した後、先ほど示した通り、層状の創閉鎖とスプレー創傷被覆材で手術を終了します。in vivoで12週間後、軟骨欠損部は均質で完全な表面を持つ修復組織で充填され、これによりインプラントへの剪断応力と損傷が軽減されました。さらに、インプラントの肥大や石灰化は見られませんでした。修復組織は、周囲の健全な軟骨組織に匹敵する、硬く緻密な質を示しました。さらに、移植片の剥離は認められませんでした。赤色の矢印は、自家軟骨細胞の播種から12週間後の、あらかじめ穿孔された軟骨欠損部を示しています。このビデオを視聴することで、in vitroでの増殖を目的とした自家軟骨細胞の単離方法、およびウサギ膝関節に人工的に作製した軟骨欠損部へ再植するための3Dマトリックスへの播種方法について、十分に理解することができます。異なる実験モデルにおける軟骨欠損技術の詳細については、関連するJoVE記事「フィブリン凝固物内同種間葉系幹細胞の移植によるウサギ膝関節の骨軟骨欠損の治療」も併せてご覧ください。

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フィブリン塊における同種間葉系幹細胞の注入によってウサギの膝関節における骨軟骨欠損の治療

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自己 Microfractured と距骨骨軟骨損傷の鏡視下手術の管理のための精製脂肪組織

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変形性膝関節症のウサギモデルにおける推拿介入

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全層骨軟骨欠損の羊モデルの確立と評価

学ぶウサギ膝関節の軟骨欠陥治療法。自家軟骨細胞をマトリックスに播種して移植するMACT技術を詳しく解説。12週後の修復組織は均一で質が良く、再生医療の応用に期待が持てる画期的な手法です。

ウサギモデルにおける軟骨欠陥の改造と修理のためのマトリックス支援自家軟骨細胞移植

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