Name: フィブリン塊における同種間葉系幹細胞の注入によってウサギの膝関節における骨軟骨欠損の治療 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 学ぶウサギ膝関節の骨軟骨欠損治療法。同種間葉系幹細胞をフィブリン塊に注入し、12週間後の組織修復を評価する標準化された実験手法です。再生医療の応用可能性を示します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

このプロジェクトは、ドイツ研究協会（助成HE 4578/3-1）で、部分的にFP7 EU-プロジェクト &quot;GAMBA&quot; NMP3-SL-2010から245993によって賄われていた。

間葉系幹細胞の単離のためのドナーウサギのA.準備（手術室） <ol><li>細胞はオス4ヶ月歳の時にニュージーランドホワイト（NZW）ウサギ、約3キロ体重から分離されています。 </li><li>プロポフォールで麻酔（10 mg / kg体重体重IV）を誘導し、ペントバルビタールナトリウム（100 mg / kg体重体重IV）を生け贄に捧げる。 </li><li>電気クリッパー、真空毛皮で後肢、背中と腹から毛皮を剃る。 </li><li> 70％エタノールで完全に剃毛した領域を消毒する。 </li><li>鈍鉗子、鋭いハサミ（またはメス）と組織や靭帯のための骨のカッターを使用してください。 </li><li>足とふくらはぎの頭蓋の表面に沿って切開を行います。 </li><li>どちら鋭いまたは鈍的切開によって皮膚や皮下組織を反映しています。 </li><li>脛骨と大腿骨とは別の筋肉や靭帯。きれいな解剖を行うことが可能のような骨の近くにカットしてください。この時点で脛骨から大腿骨を分離しないでください。 </li><li> THRをカットウワーッ寛骨臼から大腿骨頭を分離する股関節。 </li><li>脛骨 - 大腿骨複合体を昇格。 </li><li>骨から残りの軟部組織を掻きまたは滅菌布の組織と骨をこするように手術用メスの刃を使用します。この時点で、大腿骨および脛骨はまだ接続されている。 </li><li>切断することにより膝蓋骨を外し、その後最終的に独立した骨に膝関節の靭帯を切った。 </li><li>スプレーは、空気が乾燥させ、70％エタノールで骨を分離し、それらの潤いを保つために、細胞培養培地（DMEM + 1％ペニシリン/ストレプトマイシン（ペニシリン/ストレプトマイシン））で50 ml遠心チューブに各ボーンを配置。 </li><li>今無菌細胞培養層流フードの下に切り替える。 </li></ol>骨と拡張からウサギMSCのフラッシュB.（細胞培養フッド） <ol><li>チューブからの骨を収集し、滅菌ピンセットを使用して150ミリメートル皿にそれらを配置します。 </li><li>両方の骨を取り除き、新しい150ミリメートル皿に無菌のこぎり、移動部分で終わる。 </li><li>メディとを10mlの注射器を埋めるUM（DMEM）、18ゲージの針を取り付け、骨髄の開口部に挿入します。 </li><li>その後、皿に骨髄をフラッシュする媒体と骨髄腔をすすいでください。可能であればその後、もう一方の端からすすいでください。必要に応じて、両端から多くを見送った。骨が壊れるべき場合は、単に骨の内部をすすいでください。 </li><li>シリンジに細胞培地懸濁液を吸引除去し、サスペンションは骨髄腔と骨髄血栓が表示されない、さらに骨を通して自由に浮遊するまで繰り返し骨髄をすすいでください。 </li><li>一度骨髄はすべて骨から収集された、18ゲージの針を通過することによって骨髄塊を乱す：針付属とシリンジを記入し、培地中に追い出す。 </li><li>その後、50ミリリットルチューブに細胞フィルターを通してサスペンションをフィルタリング。セル損失を防止するために10mlの培地で培養皿の2倍を洗浄し、同様にこむ。 </li><li>室温で5分間、500×gでサスペンションを遠心分離。 </li><li>清と再懸セルペルを削除らを10mlの培地（DMEM + 1％ペニシリン/ストレプトマイシン）であった。 </li><li> Biocoll分離ソリューションを使用して、末梢血単核細胞（PBMC）及び間葉系幹細胞（MSC）から独立した血液細胞。 </li><li>を15mlチューブにBiocoll分離溶液5mlを記入し、慎重に室温で20分（ブレーキなし）のために800 xgで上部と遠心分離機に細胞懸濁液を5ミリリットルを追加します。 </li><li> PBMCと間葉系幹細胞は、界面でのままBiocoll、底まで赤血球堆積物よりも高密度であること：可能な結果は、 図1を参照してください。 </li><li>慎重を15mlチューブにインターフェイスを削除し、5 mlのPBSで洗浄する。 </li><li>ステップ22で説明したように、遠心5ミリリットルのPBSに再懸と2〜3倍を繰り返す。 </li><li>その後、室温で10分（ブレーキ付）、350 xgで再び遠心。 </li><li>を10mlの培地に再懸濁し、血球のセルを数える。 </li><li> 150ミリメートルの皿で約5×10 6の初期の播種密度でプレート細胞。 </li><li> 2-3日後、再非接着細胞を移動します。あなたは、細胞の破片を除去するためにPBS最初ですすぎが必要になる場合があります。その後、新鮮な完全培地（DMEM + 10％ウシ胎児血清（FCS）+ 1％ペニシリン/ストレプトマイシン）を追加する。 </li><li> 3〜4日ごとに（ 図2）の細胞を養う。 </li><li> 5-10日後、経過初めて細胞。 </li></ol> in vitroでフィブリン塊のC.の準備<ol><li>移植の日には、0.25％トリプシン-EDTAに3分露出でフラスコ/皿から接着細胞を解放。完全培地を追加することで、トリプシン処理を停止します。 </li><li> 50ミリリットルファルコンチューブで細胞を配布し、PBSで2回、それらを洗ってください。 </li><li>トリパンブルー染色により細胞の生存と数字を決定します。 </li><li> 50,000細胞/マイクロ遠心チューブを追加し、室温で5分間、500×gで遠心分離によりペレットを収集します。必要に応じて、少なくとももう1つの塊のためにマスターミックスを準備します。 </li><li> 17μlのPBSで細胞ペレットを再懸濁し、TISSUのフィブリノゲン成分を25μlのを混ぜてこの17μlのMSCサスペンションとCOL-キット。 </li><li> in vivoでのドリル穴（ 図3）に基づき、事前ドリル穴（3x3.6ミリ）で滅菌プレートを取る。 </li><li>まず、一番上に42μlのフィブリノゲン - 細胞懸濁し、再び4μl​​のトロンビン溶液の即時加え、続いて一つの穴の中に4μlのトロンビン溶液（500 IU / ml）を接種。ピペットチップ内凝固を避けるために、サスペンションを混在させないでください。まず、分取フィブリノーゲン細胞懸濁液50μlの体積は、表面張力により溶融せずにプレドリル穴の縁に突出します。しかし、完全に凝固した後（60分後）血栓は縮小していると事前ドリル穴に収まります。 </li><li> PBSでマイクロ遠心チューブに鈍鉗子と場所を使用して慎重に血栓を削除します。 2血栓/動物を準備します。 </li><li>手術室に血栓を取る。 </li></ol>フィブリン塊における同種間葉系幹細胞のD.の移植<ol><li>プロポフォールの静脈注射（10 mg / kg体重）でウサギ（NZW、男性、3.5〜4.0キロの体重、5-6ヶ月）に麻酔を誘導する。 </li><li>電気クリッパー、真空毛皮でログオン操作する膝を剃る。前に指定されたすべての手順は、手術室の無菌環境の汚染を避けるために手術の準備室で行われる。 </li><li>挿管後、静脈内に1.5 mg / kg体重/分プロポフォール及び0.05 mg / kg体重/分フェンタニルで麻酔を維持します。カプノグラフィ、パルスオキシメトリと脈拍数を用いて麻酔を監視する。 </li><li>徹底的に剃っているd膝を消毒、滅菌ドレッシングで​​ウサギの残りの部分をカバーしています。 </li><li>膝蓋骨を触診し、膝蓋骨に内側の皮膚切開を行います。 </li><li>無菌条件下で内側parapatellar関節切開による膝関節を開きます。どんな小さな表在血管を切断しないようにしてください。 </li><li> （ 図4）横方向に膝蓋骨を置換。 </li><li> inspe後に任意の付随軟骨病変や関節の異常のために膝関節のctionは、ストップデバイスと無菌空気オペレーティングパワードリルと滑車溝に2つの骨軟骨欠損（ディープ3ミリメートル、8字型の図）（直径3.6ミリメートル）を作成（ 図5）。 </li><li>欠陥をきれいにし、滅菌生理食塩水でそれらを洗い流してください。 </li><li>移植の前に、欠陥にフィブリン糊の20μLを記入し、欠陥の底に均等に分配する。 </li><li>その後血栓フィギュア8字型欠陥に圧入植え込む。 </li><li>凝固後、滑車溝内膝蓋骨を再配置し、数回曲げると膝を伸ばす。 </li><li>もう一度横膝蓋骨を置換し、フィブリノーゲン細胞塊の場所に残っているかどうかを確認します。 </li><li>再び膝蓋骨を交換し、（両方吸収性縫合糸を持つ単一のボタン縫合（4-0 VICRYL）および連続皮膚縫合（4-0モノクリル）と層における創傷閉鎖で動作を終える材料）。 </li><li>最後に、水蒸気透過性ドレッシングスプレーで傷を封印。 </li><li>術後ケアのため、傷は7日間毎日チェックされます。ウサギは術後鎮痛カルプロフェン4 mg / kgを皮下毎24時間（4日間）とブプレノルフィン0.03 mg / kgを皮下毎12時間（2.5日間）のために受け取る。膝の安定化（ 例えばドレッシング）は必要ありません。 </li></ol>

<ol><li>Kon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+nano-composite+multilayered+biomaterial+for+osteochondral+regeneration%3A+a+pilot+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Novel nano-composite multilayered biomaterial for osteochondral regeneration: a pilot clinical trial.</a> The American Journal of Sports Medicine. 39, 1180-1190 (2011).</li>
<li>Kon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orderly+osteochondral+regeneration+in+a+sheep+model+using+a+novel+nano-composite+multilayered+biomaterial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%3A+Official+Publication+of+the+Orthopaedic+Research+Society%22%5BJournal%5D)">Orderly osteochondral regeneration in a sheep model using a novel nano-composite multilayered biomaterial.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 28, 116-124 (2010).</li>
<li>Hangody, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+osteochondral+grafting--technique+and+long-term+results%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">Autologous osteochondral grafting--technique and long-term results.</a> Injury. 39, 32-39 (2008).</li>
<li>Marcacci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arthroscopic+autologous+osteochondral+grafting+for+cartilage+defects+of+the+knee%3A+prospective+study+results+at+a+minimum+7-year+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Arthroscopic autologous osteochondral grafting for cartilage defects of the knee: prospective study results at a minimum 7-year follow-up.</a> The American Journal of Sports Medicine. 35, 2014-2021 (2007).</li>
<li>Ochs, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+articular+cartilage+and+subchondral+bone+after+bone+grafting+and+matrix-associated+autologous+chondrocyte+implantation+for+osteochondritis+dissecans+of+the+knee%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Remodeling of articular cartilage and subchondral bone after bone grafting and matrix-associated autologous chondrocyte implantation for osteochondritis dissecans of the knee.</a> The American Journal of Sports Medicine. 39, 764-773 (2011).</li>
<li>Aurich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+chondrocyte+transplantation+by+the+sandwich+technique.+A+salvage+procedure+for+osteochondritis+dissecans+of+the+knee%5BTitle%5D)+AND+%22Unfallchirurg%22%5BJournal%5D)">Autologous chondrocyte transplantation by the sandwich technique. A salvage procedure for osteochondritis dissecans of the knee.</a> Unfallchirurg. 110, 176-179 (2007).</li>
<li>Williams, R. J. 3rd, Ranawat, A. S., Potter, H. G., Carter, T., Warren, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fresh+stored+allografts+for+the+treatment+of+osteochondral+defects+of+the+knee%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Bone+and+Joint+Surgery.+American+Volume%22%5BJournal%5D)">Fresh stored allografts for the treatment of osteochondral defects of the knee.</a> The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 89, 718-726 (2007).</li>
<li>Szerb, I., Hangody, L., Duska, Z., Kaposi, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaicplasty%3A+long-term+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+Hosp.+Jt.+Dis%22%5BJournal%5D)">Mosaicplasty: long-term follow-up.</a> Bull. Hosp. Jt. Dis. 63, 54-62 (2005).</li>
<li>Brittberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+deep+cartilage+defects+in+the+knee+with+autologous+chondrocyte+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation.</a> N. Engl. J. Med. 331, 889-895 (1994).</li>
<li>Peterson, L., Vasiliadis, H. S., Brittberg, M., Lindahl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+chondrocyte+implantation%3A+a+long-term+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Autologous chondrocyte implantation: a long-term follow-up.</a> Am. J. Sports Med. 38, 1117-1124 (2010).</li>
<li>Gomoll, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subchondral+bone+in+articular+cartilage+repair%3A+current+problems+in+the+surgical+management%5BTitle%5D)+AND+%22Knee+Surg.+Sports+Traumatol.+Arthrosc%22%5BJournal%5D)">The subchondral bone in articular cartilage repair: current problems in the surgical management.</a> Knee Surg. Sports Traumatol. Arthrosc. 18, 434-447 (2010).</li>
<li>Steinhagen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+osteochondritis+dissecans+of+the+femoral+condyle+with+autologous+bone+grafts+and+matrix-supported+autologous+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Orthop%22%5BJournal%5D)">Treatment of osteochondritis dissecans of the femoral condyle with autologous bone grafts and matrix-supported autologous chondrocytes.</a> Int. Orthop. 34, 819-825 (2010).</li>
<li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+large+articular+cartilage+defects+with+implants+of+autologous+mesenchymal+stem+cells+seeded+into+beta-tricalcium+phosphate+in+a+sheep+model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Repair of large articular cartilage defects with implants of autologous mesenchymal stem cells seeded into beta-tricalcium phosphate in a sheep model.</a> Tissue Eng. 10, 1818-1829 (2004).</li>
<li>Centeno, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+knee+cartilage+volume+in+degenerative+joint+disease+using+percutaneously+implanted%2C+autologous+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pain+Physician%22%5BJournal%5D)">Increased knee cartilage volume in degenerative joint disease using percutaneously implanted, autologous mesenchymal stem cells.</a> Pain Physician. 11, 343-353 (2008).</li>
<li>Niederauer, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+multiphase+implants+for+repair+of+focal+osteochondral+defects+in+goats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Evaluation of multiphase implants for repair of focal osteochondral defects in goats.</a> Biomaterials. 21, 2561-2574 (2000).</li>
<li>Nagura, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+osteochondral+defects+with+a+new+porous+synthetic+polymer+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone.+Joint+Surg.+Br%22%5BJournal%5D)">Repair of osteochondral defects with a new porous synthetic polymer scaffold.</a> J. Bone. Joint Surg. Br. 89, 258-264 (2007).</li>
<li>Schlichting, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+scaffold+stiffness+on+subchondral+bone+and+subsequent+cartilage+regeneration+in+an+ovine+model+of+osteochondral+defect+healing%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Influence of scaffold stiffness on subchondral bone and subsequent cartilage regeneration in an ovine model of osteochondral defect healing.</a> The American Journal of Sports Medicine. 36, 2379-2391 (2008).</li>
<li>Schagemann, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-laden+and+cell-free+biopolymer+hydrogel+for+the+treatment+of+osteochondral+defects+in+a+sheep+model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cell-laden and cell-free biopolymer hydrogel for the treatment of osteochondral defects in a sheep model.</a> Tissue Engineering. Part A. 15, 75-82 (2009).</li>
<li>Vogt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+the+stable+expression+of+BMP2+in+fibrin+clots+on+the+remodelling+and+repair+of+osteochondral+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of the stable expression of BMP2 in fibrin clots on the remodelling and repair of osteochondral defects.</a> Biomaterials. 30, 2385-2392 (2009).</li>
<li>Schillinger, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fibrin+glue+composition+as+carrier+for+nucleic+acid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">A fibrin glue composition as carrier for nucleic acid vectors.</a> Pharm. Res. 25, 2946-2962 (2008).</li>
<li>Ahmed, T. A., Giulivi, A., Griffith, M., Hincke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+glues+in+combination+with+mesenchymal+stem+cells+to+develop+a+tissue-engineered+cartilage+substitute%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Fibrin glues in combination with mesenchymal stem cells to develop a tissue-engineered cartilage substitute.</a> Tissue Engineering. Part A. 17, 323-335 (2011).</li>
<li>Haleem, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Clinical+Use+of+Human+Culture-Expanded+Autologous+Bone+Marrow+Mesenchymal+Stem+Cells+Transplanted+on+Platelet-Rich+Fibrin+Glue+in+the+Treatment+of+Articular+Cartilage+Defects%3A+A+Pilot+Study+and+Preliminary+Results%5BTitle%5D)+AND+%22Cartilage%22%5BJournal%5D)">The Clinical Use of Human Culture-Expanded Autologous Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Transplanted on Platelet-Rich Fibrin Glue in the Treatment of Articular Cartilage Defects: A Pilot Study and Preliminary Results.</a> Cartilage. 1, 253-261 (2010).</li>
<li>Pape, D., Filardo, G., Kon, E., van Dijk, C. N., Madry, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+clinical+problems+associated+with+the+subchondral+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Knee+Surg+Sports+Traumatol.+Arthrosc%22%5BJournal%5D)">Disease-specific clinical problems associated with the subchondral bone.</a> Knee Surg Sports Traumatol. Arthrosc. 18, 448-462 (2010).</li>
<li>Shirazi, R., Shirazi-Adl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+biomechanics+of+articular+cartilage+of+human+knee+joint%3A+effect+of+osteochondral+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Computational biomechanics of articular cartilage of human knee joint: effect of osteochondral defects.</a> Journal of Biomechanics. 42, 2458-2465 (2009).</li>
<li>Jorgensen, C., Gordeladze, J., Noel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Engineering+through+autologous+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Tissue Engineering through autologous mesenchymal stem cells.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 15, 406-410 (2004).</li>
<li>Chen, F. H., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+arthritic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res.+Ther%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in arthritic diseases.</a> Arthritis Res. Ther. 10, 223(2008).</li>
<li>Le Blanc, K., Tammik, C., Rosendahl, K., Zetterberg, E., Ringden, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+expression+and+immunologic+properties+of+differentiated+and+undifferentiated+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells.</a> Exp. Hematol. 31, 890-896 (2003).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

近年では、複雑な関節骨軟骨欠損治療の可能性 - そのような骨軟骨炎の離断、骨壊死や外傷に起因するものなどを - 組織工学的アプローチでは、ますます魅力的になりました。前述した病的なエンティティでは、組織の損傷は軟骨下骨に延びており、別の本質的な癒しの容量1によって特徴付けられる2組織が ​​含まれます。骨軟骨関節損傷11,23の病原性プロセスの軟骨下骨の役割に関心が高まっている。関節軟骨とそのサポート骨の機能的条件がしっかり接続されています。どちらの組織の損傷は機械的な環境だけでなく、全体のジョイント24の恒常性のバランスに悪影響を及ぼす。関節運動の機械的破壊、緩い体形成、関与コンパートメント内機械的摩耗や消耗を通じて骨軟骨単位の変化対向面には変形性関節症1,11以前の発症と発展につながる可能性があります。したがって、骨軟骨欠損の再生のための組織工学アプローチは、宿主組織2を包囲して効果的な組合を向上させるために、下地軟骨下骨の適切な修復を添付しなければならない。間葉系幹細胞は、骨軟骨修復、これらの特定の要件を提供するための理想...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Biochrom AG</td><td>F 0415</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAN Biotech GmbH</td><td>0401</td><td></td></tr><tr><td>プロポフォール</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Biochrom AG</td><td>A 2210</td><td>0.9% NaCl中 1,000 units/10 &amp;mu;g/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>PBS Dulbecco (1X)</td><td>Biochrom AG</td><td>L1815</td><td></td></tr><tr><td>エタノール (70%)</td><td>Merck KGaA</td><td>410230</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液 (0.4%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Biocoll 分離溶液</td><td>Biochrom AG</td><td>L6115</td><td>等張溶液 密度: 1,077 g/ml</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA 0.05%</td><td>Invitrogen GmbH</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>フェンタニル</td><td>DeltaSelectGmBH</td><td>1819340</td><td></td></tr><tr><td>NaCl溶液 (0.9%)</td><td>BBraun</td><td>8333A193</td><td></td></tr><tr><td>注射器 (Injekt)</td><td>BBraun</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>注射針 (Sterican)</td><td>BBraun</td><td>4657519</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット (鈍的/鋭的)</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>はさみ</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メス</td><td>Feather Safety Razor Co</td><td>02.001.30.022</td><td></td></tr><tr><td>研究用ピペット</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>骨切断鉗子</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>組織培養皿 100 mm/150 mm</td><td>TPP AG</td><td>93100/93150</td><td>培養面積 60.1 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;/147.8 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>組織培養フラスコ 25/75 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>TPP AG</td><td>90025/90075</td><td>25 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;, 75 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>遠心管 (50 ml)</td><td>TPP AG</td><td>91050</td><td>ガンマ線滅菌済み</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; インキュベーター</td><td>Forma Scientific Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞培養用ラミナーフローフード Hera Safe</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌鋸</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 Megafuge 2.0 R</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血球計数器</td><td>Brand GmbH+Co KG</td><td>717810</td><td>ノイバウアー</td></tr><tr><td>エア駆動式電動ドリル</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TISSUCOL-Kit 1.0 ml Immuno</td><td>Baxter</td><td>2546648</td><td></td></tr><tr><td>縫合糸 (4-0 Monocryl, 4-0 Vicryl)</td><td>Ethicon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スプレー処置材 (OpSite)</td><td>Smith&amp;amp;Nephew</td><td>66004978</td><td>水蒸気透過性</td></tr></tbody></table>

フィブリン塊における同種間葉系幹細胞の注入によってウサギの膝関節における骨軟骨欠損の治療

Treatment of Osteochondral Defects in the Rabbit's Knee Joint by Implantation of Allogeneic Mesenchymal Stem Cells in Fibrin Clots

骨軟骨関節欠損の治療は、長年医師にとって困難な課題となってきました。近年、関節軟骨と軟骨下骨の相互作用への理解が深まったことで、骨軟骨ユニット全体の修復に注目が集まっています。軟骨病変と比較して、骨軟骨欠損の再生ははるかに複雑であり、外科的および治療的なハードルが非常に高くなります。損傷組織には、表層の軟骨層だけでなく、軟骨下骨も含まれるためです。例えば剥離性骨軟骨炎などで見られるような深い骨軟骨損傷の場合、関節表面を復元するには欠損部の全層を置換する必要があります 1。適切な治療法を選択するには、固有の治癒能力が異なるこれら2つの組織を考慮しなければなりません 2。ここ数十年の間に、いくつかの外科的治療オプションが登場し、すでに臨床的に確立されています 3-6。
自家または同種骨軟骨移植は、関節軟骨と軟骨下骨で構成されており、骨軟骨ユニット全体の置換を可能にする。欠損部は円柱状の骨軟骨移植片で充填され、これにより適合性の高い硝子軟骨で覆われた表面を提供することを目的とする 3,7,8。欠点は、利用可能な移植片の量が限られていること、ドナー部位の罹患（自家移植の場合）、および表面の不適合性であり、そのため、この手法の適用は特に大きな欠損部においては制限される。
組織工学分野における新しいアプローチは、再生骨軟骨治療に有望な可能性を切り拓きました。自家軟骨細胞の移植は、全層軟骨損傷治療のための初の細胞ベースの生物学的アプローチとなり、現在では移植後10年から20年が経過しても良好な臨床結果が得られる手法として世界的に確立されています9,10。しかしながら、現在まで、この手法は軟骨下骨を含む深い欠損などのあらゆる種類の損傷の治療に適しているわけではありません11。
定冠詞（The） サンドイッチ法 骨移植を組織工学における最新のアプローチと組み合わせる 5,6この組み合わせは、骨軟骨移植単独で見られる限界を克服できると考えられています。軟骨下欠損部への自家骨移植の後、自家軟骨細胞を播種したメンブレンをその上に縫合することで、移植片の形態を損傷部位に適合させることが容易になります。当然ながら、事前の骨再建には追加の手術時間が必要となり、多くの場合、さらなる手術が必要となります。さらに、現在まで長期的なデータが不足しています。 12.
追加の骨移植を行わない組織工学は、移植細胞の軟骨形成能および骨形成能により、天然の関節軟骨の複雑な構造と特性を回復させることを目的としています。しかしながら、一般的に再生されるのは多かれ少なかれ軟骨組織のみにとどまります。さらに骨軟骨損傷がある場合は、別途、特定の治療が必要です。骨軟骨欠損の多層構造の再生を実現するためには、自家または同種細胞を播種した三次元組織工学製品が、優れた再生能力を提供し得る可能性があります11。
自家軟骨細胞に加えて、間葉系幹細胞（MSC）は全層軟骨組織を構築するための魅力的な代替手段であると考えられています。数多くの前臨床in vitroおよびin vivo研究において、間葉系幹細胞は優れた組織再生能を示しています13,14。特に骨軟骨欠損の治療において間葉系幹細胞が持つ重要な利点は、骨細胞および軟骨細胞の両方に分化する能力を備えていることです。したがって、欠損部位の多層的な再生を可能にする可能性があります。
そのため、近年、骨軟骨再生能を有するいくつかのスキャフォールドが開発され、有望な予備的結果とともに評価されています 1,15-18。さらに、細胞キャリアとしてのフィブリン糊は、実験的な軟骨修復における好ましい手法の一つとなり、すでにいくつかの動物研究 19-21 や、さらには初期のヒト臨床試験 22 においても成功を収めています。
以下のプロトコルでは、ウサギの骨髄から間葉系幹細胞を単離し、その後、細胞培養で増殖させ、フィブリン細胞凝集塊の標準的なin vitroモデルを調製するための実験手法を実演します。最後に、あらかじめ作製したフィブリン細胞凝集塊をウサギ膝関節の人工骨軟骨欠損部へ移植する手法について解説します。

記載の外科技術は、人工骨軟骨欠損部に同種間葉系幹細胞の単離及び移植の成功を可能にする。実験装置は、周囲の軟骨にインプラント統合の成功をもたらした。 欠陥が周囲の軟骨に比べて類似の生体力学的特性と類似した耐久性と修復組織で充填した。フィブリン血餅細胞が骨軟骨欠損（ 図3）と同じサイズを有していた事前ドリル穴を有する滅菌プレート上にインビトロで調製した。結果として、注入フィブリン塊、早期変性または層間剥離（ 図6）の危険因子であろう周囲の軟骨との間に裂け目はなかった。軟骨下骨を貫通し、したがって、せん断に対して働いていたので修復組織の基底治癒が確保されました。もう一つの重要な側面は、STIFだったその上に負荷が増大し、可能時期尚早変性を避けるために、健康な周囲の軟骨組織と一致している必要があり修復組織のfness。我々の予備実験（データは示していない）においては、12週間後に十分な剛性がすでに達成され得ることを示した。また、移植の無傷で均質表面をせん断応力と可能な注入損傷（ 図6）を<...

ウサギの膝関節における骨軟骨欠損の治療のための実験技術が記載されている。骨軟骨欠損に同種間葉系幹細胞の移植は、組織工学の分野で有望な開発を提供しています。フィブリン細胞塊の準備<em&gt; in vitroで</em&gt;移植のための標準化された方法を提供しています。

骨軟骨関節欠損の治療は、長年にわたり医師にとって困難な課題となってきました。関節の相互作用に関する理解が深まることで……

本手順の全体的な目的は、骨軟骨修復分野における幹細胞研究のための標準化された実験手法を提示することです。まず、ウサギの骨髄から間葉系幹細胞を単離します。次に、単離した幹細胞を培養して増殖を促進させます。次に、フィブリン細胞凝集塊をin vitroで作製します。最後に、あらかじめ作製したフィブリン細胞凝集塊を、ウサギ膝関節の人工的な骨軟骨欠損部に移植します。最終的に、in vivoで12週間後、膝の肉眼的な解析を行うことができ、修復組織は均質で完全な表面と強固な質感を示します。この手法は、軟骨損傷の治療における同種間葉系幹細胞の生体内での統合および再生能の解析を可能にするため、実験動物における軟骨病変の治療への応用が期待されます。手術室にて、安楽死させたウサギの後肢背面および腹部の被毛をバリカンで剃り、70% ethanolで剃毛部位を十分に消毒しながら、同時に被毛を吸引します。脚およびふくらはぎの頭側表面に沿って切開を加え、鋭的に剥離して皮膚および皮下組織を翻転させます。次に、正確な解剖を行うため、可能な限り骨に沿って切断しながら、脛骨と大腿骨から筋肉と靭帯を分離します。その後、股関節を切断して大腿骨頭を寛骨臼から切り離し、脛骨大腿骨複合体を取り出します。最後に、メスを用いて骨に残っている軟組織を掻き取ります。次に、膝蓋骨と膝関節靭帯を切除し、最終的に肢骨を分離させます。分離した骨を風乾させた後、70% ethanolで噴霧します。滅菌された細胞培養条件下で湿潤状態を維持するため、各骨を細胞培養液の入った個別の50 milliliter遠心チューブに入れます。ラミナーフローフード内での操作。滅菌済みピンセットを使用して、遠心管から回収した骨を150 mmディッシュに移します。次に、滅菌済みノコギリを使用して骨の両端を切り落とし、切り出した断片を新しい150 mmディッシュに移動させます。次に、10 mLのシリンジに培地を満たします。これに18ゲージの針を取り付け、針先を骨の一端から骨髄へと挿入します。そして、培地で骨髄腔を洗浄し、骨髄をディッシュ内に洗い出します。次に、細胞懸濁液をシリンジで吸引し、懸濁液が骨髄腔内を自由に浮遊し、骨髄の凝集塊が見られなくなるまで、骨髄を繰り返し洗浄します。すべての骨から骨髄を採取した後、針を通してシリンジに骨髄懸濁液を満たし、培地中に骨髄懸濁液を強制的に押し出して骨髄の塊を分散させます。その後、細胞の損失を防ぐため、懸濁液をセルフィルターに通して50 milliliterチューブに移します。培養皿を10 mLの培地で2回洗浄し、その都度洗浄液をフィルターに通します。懸濁液を500 ×g、室温で5分間遠心分離します。その後、上清を除去し、細胞ペレットを10 mLの培地で再懸濁します。次に、15 mLチューブに5 mLのBicoll分離溶液を加え、その上に5 mLの細胞懸濁液を慎重に重層します。重層した溶液を遠心分離すると、赤血球は底に沈降し、PBMCと間葉系幹細胞は界面に留まります。界面の細胞を15 mLコニカルチューブに移し、5 mLのPBSを用いて回収したPBMCおよび間葉系幹細胞を2〜3回洗浄します。その後、細胞をもう一度遠心分離し、ペレットを10 millilitersの培地で再懸濁します。最後に、ヘモサイトメーターで細胞数をカウントし、150 millimeterディッシュに初期播種密度約5 × 10⁶で播種します。2〜3日後、非接着細胞を除去して培養を維持します。移植当日、PBSでプレートを洗浄して細胞残渣を除去し、新鮮な完全培地を細胞に添加します。まず、接着細胞を0.25%trypsin EDTAに3分間さらします。完全培地を加えてトリプシン処理を停止させます。次に、剥離させた間葉系幹細胞を50 mLのコニカルチューブに移し、PBSで2回洗浄します。トリパンブルー染色により細胞数と生存率を算出した後、n = 4に必要となる数だけ（少なくとももう1つ分以上の凝固塊分）マスターミックスを調製します。200,000個の細胞をマイクロ遠心チューブで遠心分離し、沈殿したペレットを68 µLのPBSおよび100 µLの組織凝固キットのフィブリノゲン成分で再懸濁します。次に、あらかじめ穴を開けた滅菌プレートの1つの穴に、トロンビン溶液を4 µL接種します。直ちにフィブリノゲン細胞懸濁液42 µLすべてを加え、さらにその上にトロンビン溶液を4 µL加えます。このとき、ピペッティングしたフィブリノゲン細胞懸濁液50 µLの液量は、表面張力によってあらかじめ開けた穴の縁から盛り上がります。しかし、1時間後には混合物が完全に凝固し、あらかじめ開けておいた穴に適合するように収縮します。ここで、鈍端鑷子を用いて凝固物を慎重に取り出し、PBSを含むマイクロ遠心チューブに入れます。除毛した膝を消毒した後、膝蓋骨を十分に触診し、膝蓋骨の内側で皮膚切開を行います。次に、無菌条件下で内側パラパテラ関節切開を行い、膝関節を開き、その後、膝蓋骨を外側に転位させます。次に、直径 3.6 millimeter のドリルビットとストッパーを備えた滅菌空気圧電動ドリルの使用し、滑車溝に深さ 3 millimeter の8の字型の骨軟骨欠損を2箇所作成します。その後、欠損部を滅菌生理食塩水で洗浄し、フィブリン糊が乾燥する前に、20 microliters のフィブリン糊を欠損部の底に迅速かつ均等に注入します。プレスフィットさせた凝血塊を、8字型の欠損部に植え込みます。凝固後、膝蓋骨を滑車溝内に戻し、膝の屈曲と伸展を数回行います。その後、再び膝蓋骨を外側にずらし、フィブリノゲン細胞凝血塊が定位置にあるかを確認します。再び膝蓋骨を戻した後、単結紮の4-0 Vicryl縫合で層状に創を閉じ、さらに連続縫合の4-0 Monocrylで皮膚を縫合します。最後に、水蒸気透過性のあるスプレー ड्रेसingで創部を密閉します。本実験において、欠損部は周囲の軟骨と同等の生物力学的特性および耐久性を有する修復組織によって充填されました。このフィブリン細胞凝固塊は、骨軟骨欠損と同じサイズの穴があらかじめ開けられた滅菌プレートを用いて、in vitroで調製されました。その結果、移植したフィブリン凝固塊と周囲の軟骨との間に隙間が生じませんでした。このような隙間は、早期の変性や剥離のリスク要因となります。また、軟骨下骨まで貫通させて固定したため、修復組織の基底部の固定が確保され、せん断力に対する耐性が得られました。もう一つの重要な側面は、修復組織の剛性であり、関節への負荷増加や早期変性の可能性を避けるために、周囲の健全な軟骨組織と一致させる必要があります。さらに、移植片の表面に欠損がなく均質であることが確認され、これによりせん断応力と作製後のインプラント損傷の可能性が低減しました。本手法は、整形外科領域の幹細胞研究における研究者が、骨軟骨欠損に対する治療法の選択肢や実験動物モデルを探索するための道を開く可能性があります。一部の動物の準備および膝手術の手法についてのより詳細な実演については、こちらの関連JoVE記事「ウサギモデルにおける軟骨欠損の再構築および修復のための基質補助自己軟骨細胞移植」を必ず併せてご視聴ください。

treatment-osteochondral-defects-rabbit-s-knee-joint-implantation

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

プレゼンテーションの目的は、MRイメージングで可視化することができます軟骨欠損におけるマトリックス関連する幹細胞移植を、生成するために高度に再現可能な方法を示すことです。幹細胞は、アガロースと混合のFDA承認されたFerumoxides、、軟骨欠損に移植し、7T...

軟骨欠損のヒト間葉系幹細胞を標識Ferumoxidesの注入

人間の血管幹細胞（PSCの）間葉系幹細胞（MSC）に似た骨格組織再生のための新しい幹細胞のクラスです。...

骨再生のための人間の血管周囲の幹細胞の使用

ウサギの膝関節内の軟骨欠損の治療のための実験技術が記載されている。マトリックス上に播種自家軟骨細胞の移植は、満足の長期的な結果を提供する関節軟骨病変の改造や修理のために広く受け入れ方法です。マトリックス支援自家軟骨細胞移植（MACT）が標準化され、臨床的に確立された注入方法を提供しています。...

ウサギモデルにおける軟骨欠陥の改造と修理のためのマトリックス支援自家軟骨細胞移植

動物モデルは、組織改変された移植片を評価するための重要なツールです。この論文では、前十字靭帯組織工学で使用するためのエレクトロスピニング生分解性ポリマーグラフトを調製するためのプロトコルと、ラットモデルに移植するための外科的プロトコルを示します。...

エンジニアード前十字靭帯移植片の評価のための無胸腺ラットモデル

本研究の目的は、microfractured...

自己 Microfractured と距骨骨軟骨損傷の鏡視下手術の管理のための精製脂肪組織

準備とラットの両側膝蓋腱欠損モデル臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞スフェロイドの評価について述べる。このモデルは、未処理と処理の腱との間の違いを検出する発見だったし、2...

ラットの両側膝蓋腱損傷モデルの幹細胞療法の評価

この記事では、簡単な分離そしてニュージーランド白ウサギ滑液からの間葉系幹細胞の浄化のためのシンプルで経済的プロトコルを示します。...

磁気活性化細胞を分離し、滑膜液由来間葉系幹細胞が家兎モデルからの浄化戦略を並べ替え

ここでは、脂肪組織由来の間質血管分数と変形性関節症の軟骨様組織の再生によって膝機能の改善への応用を生成するプロトコルを提案する.

潜在的な軟骨再生のための脂肪組織由来間質血管分数の生産の臨床プロトコル

間葉系幹細胞から作製した人工軟骨組織を移植して軟骨内骨化術を行う骨治療は、従来の治療法の欠点を回避できる可能性があります。ヒアルロン酸ハイドロゲルは、均一に分化した軟骨移植片のスケールアップや、 in...

間葉系幹細胞を用いた In vivo 軟骨内骨化による統合骨形成

提案されたプロトコルは、マルチモーダル分析を使用して骨再生の文脈で骨形成を評価するためのグローバルなアプローチを伴います。これは、新しい骨形成に関する定性的および定量的な情報を提供し、基本的および前臨床研究の厳密性と妥当性を高めることを目的としています。...

Ex Vivoモデルにおける組織石灰化の包括的な特性評価

ここでは、羊の膝における制御された骨軟骨病変を生成する統合プロトコルを提示し、骨および軟骨組織再生研究に適した実験モデルを構築します。プロトコルは、動物福祉への影響と結果のばらつきを最小限に抑える技術を用いて、大腿骨頭に全層骨軟骨欠損を誘発する方法を示しています。...

全層骨軟骨欠損の羊モデルの確立と評価

学ぶウサギ膝関節の骨軟骨欠損治療法。同種間葉系幹細胞をフィブリン塊に注入し、12週間後の組織修復を評価する標準化された実験手法です。再生医療の応用可能性を示します。

フィブリン塊における同種間葉系幹細胞の注入によってウサギの膝関節における骨軟骨欠損の治療

さらに動画を探す