の長期、高分解能共焦点タイムラプスイメージングシロイヌナズナ子葉表皮
December 31st, 2012
我々は、気孔の分化を文書化、開発の数日間にわたって表皮の共焦点イメージングのための植物の子葉を固定化するためにチャンバースライドやメディアを使用してプロトコルを記述します。フルオロフォアタグ付きタンパク質は、細胞分裂や細胞型分化の過程でそれらの可能な役割の理解を深め、表現と細胞内局在によって動的に追跡することができます。
次の実験の目的は、種子発芽後の表皮発達の初期イベントを細胞レベルで視覚化することです。これは、最初に種皮を取り除き、2番目のステップとしてコーシンがはっきりと見えるようにすることで達成されます。コシンは、寒天培地の層の下にマウントされ、固定化され、次回のタイムラプスイメージングが数日間にわたって行われ、生体内での表皮細胞の成長と分裂を観察します。
可視蛍光に基づく動的な遺伝子発現とタンパク質局在を示す結果が得られました。この手法は、Gus染色やGFP融合の静止画などの既存の方法と比較した場合の主な利点として、細胞分裂や分化中のタンパク質のダイナミックな動きを示すことができます。この実験のためのシロイヌナズナの種子は、33%家庭用漂白剤および0.1%トリトン×100の種子からなる種子滅菌溶液で滅菌され、所望の蛍光レポーターコンストラクトおよび遺伝子型を1.7ミリリットルのチューブに入れ、1ミリリットルの滅菌溶液を適用し、ミューテーター上で15分間インキュベートする。
滅菌フードで、ピペットを使用して滅菌溶液をチューブから取り出し、種子を残します。1ミリリットルの滅菌水ですすいでください。4回目のすすぎ後、4回繰り返します。
摂氏4度で2日以上インキュベートします。チャンバースライド培地を調製するには、200ミリリットルのフラスコとマイクロ波で水に寒天に0.5%の液体の20ミリリットルを混合し、溶解するまで電子レンジで加熱します。溶液を沸騰させるときは注意してください。
解を摂氏約60度に呼び出します。溶液が熱すぎる、または塗布が速すぎると、接着剤が溶けたり、チャンバースライドのガラスにひびが入ったりする可能性があります。寒天溶液が十分に冷えたら、ピペットで1ミリリットルを採取し、すぐにチャンバースライド内のカバーガラスにゆっくりと塗布します。
2ミリリットルの寒天溶液を追加します。これで、寒天培地がチャンバースライドの底部を完全に覆うはずです。この最小限の培地は、水分を維持し、ガスの拡散を可能にすることにより、4〜5日間貯蔵された栄養素を含む植物オレインの発達をサポートするのに十分です。
チャンバーをベンチトップに覆った状態でスライドを呼び出します。この手順を開始するには、無菌種子のチューブを摂氏4度の保管から取り出します。解剖顕微鏡のステージにペーパーティッシュを置き、水で湿らせて調整すると表面が滑らかになります。
この組織は、解剖中に種子を安定させるために使用されます。チューブから20〜30個のシードを組織にピペットで固定し、解剖スコープの視野内に配置するように注意します。コリードインの解剖は、この手順の最も困難な側面です。
低倍率と鋭い鉗子を使用し、細心の注意を払うことで、鋭い鉗子を使用して解剖を成功させることができます。内側の苗から種皮を慎重に取り除き、外側と内側の両方の外皮を取り除く必要があります。次に、メスを使用して、ハイパーコトルとラジカルからコットのリードインをスライスします。
イメージングのためにハイパーコットとラジカルを取り外すと、ハイパーコットがまっすぐになり、劇的に長くなるため、有益です。Koss Leadinをタイムラプスの視野から外し、解剖したcos leadinを水に浸したままにします。オレアンの所望の数に達するまで、種子の解剖を繰り返す。
チャンバースライドにオレーンを取り付ける前に、15〜20回の解剖が成功することをお勧めします。コタンを取り付けるためのチャンバースライドを準備するには、小さなカバースリップを使用して寒天培地を切断し、チャンバーのガラスベースから層全体を持ち上げます。スライドピペットは、保持チューブからチャンバーへの最小限の水でコタンを解剖しました。
持ち上げた寒天層の下に滑り込ませます。寒天をセディンの上にそっと下げます。余分な水分が存在する場合は、ティッシュで洗い流してください。
取り付け完了時にセディンを邪魔しないように注意してください。標本が簡単に動かなくなるはずです。カバーをチャンバースライドに置き、スライドを顕微鏡ステージに移します。
イメージングの前に、倒立共焦点顕微鏡をセットアップして、目的の蛍光をイメージングします。LSM 700のパラメータは、488ナノメートルのGFP励起と収集用です。440〜530ナノメートルのバンドパスフィルターと、555ナノメートルのRFP励起と収集用。
570〜610ナノメートルのバンドパスフィルター付きで、対物レンズは20倍です。ACOのリードインに注目し、対物レンズをチャンバーの中央に移動します。取得モードでスライドし、ズームを0.5に、フレームサイズを48 x 48ピクセルに変更します。
位置チェックボックスを選択し、オーバービュー画像をスキャンしてから、水平方向と垂直方向のタイル番号を30〜35に増やします。スキャンボタンをクリックしてスキャンを開始します。スキャンが完了したら、寸法タブの下にある位置ボタンをクリックし、観察する各ベビーベッドのリード線に十字線を配置します。
マウントされた試験片に損傷がないか検査します。損傷したcossリードインに対応する位置を削除して、イメージングに適した標本のみを残します。次に、すべてのサンプルのcoss leadin表皮を包含するZシリーズを設定します。
「Zack」チェックボックスをクリックします。position listで各ポジションを選択し、move toボタンをクリックします。表皮のcosリードの最上面に焦点を合わせ、Zackの下の最初のセットボタンをクリックします。
表皮が便利に見える最も低い位置に焦点を合わせます。そして、最後に設定ボタンをクリックします。「optimal」の横にあるボタンをクリックすると、設定する最適なZスライスの厚さが表示されます。
各 kos リードインをチェックして、これらの設定がすべてのサンプルを網羅していることを確認します。Zパラメータは、個々のポジションに設定することはできません。ここで使用しているZen 2009ソフトウェアでは、表皮細胞分裂におけるタンパク質動態に15分から30分、3日間という望ましい分解能と長さの時系列を設定することが有効ですが、必要に応じて間隔を変更することができます。
テキストフィールドに間隔を30に設定して、必要な画像数の時系列サイクル設定の下の時系列チェックボックスをクリックし、プルダウンメニューを使用してMINを選択し、XYを開始する、ZTマルチポジションスキャンフレームサイズを目的の解像度に変更し、実験を開始します。位置の数はスキャン仕様によって制限する必要があることに注意してください。合計スキャン時間が目的の間隔よりも長い場合、タイムポイントは正しくありません。
このシステムを使用すると、30分間隔で59 ZスライスでGFPとRFPをイメージングする場合、最大6つの同時位置が可能です。この方法で収集された情報ポイントのセットの例を次に示します。細胞膜はRFPで標識され、GFPはその天然プロモーターの下で極性タンパク質を融合させています。
シリーズAの画像は、極性GFPが最初に均等に分布しているように見え、その後、矢印で示される非対称分割の約2時間前に現れることを示しています。Polar GFPは、47時間後に矢印で示された最初の非対称分裂に続いて、シリーズBの初期マイスターOIDの部位から分離します。Polar GFPが両方のセルで消えます。
これは、メリスイドによるガード母細胞状態への急速な移行を意味し、アスタリスクで示されるガード母細胞は対称的に分裂して分化して気孔ガード細胞を形成する一方、膀胱細胞はおそらく後の非対称分裂に先立って極性GFP発現を回復する。ここに示されているのは、1つの気孔前駆細胞の増幅および間隔調整中の極性GFP局在の合理化された登録ビデオです。最初は、極性GFPは発芽後39時間までに細胞内に均一に現れます。
それは40時間で分裂する直前に強く分極し、細胞の反対側の端に小さなメイドを配置します。右側の大きい方のセルも気孔系統の同一性を取り戻し、45時間後にはPolar GFPの局在化が気孔前駆体に隣接して移動します。47時間での分割は、最初の私スタモイドから左側の既存の私スタモイドから離れて向き付けられた右側に新しいステロイドを生成します。
その結果、2つのストーマが1つの細胞で分離されます。このビデオを見れば、発芽中のコリードインの長期タイムラプスを使用して、発生中の表皮における遺伝子発現とタンパク質の局在を評価する方法について十分に理解できるはずです。
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概要
この研究では、コンフォカルイメージングのためにチャンバースライドとアガー培地を使用して植物の胚軸葉を固定するプロトコルを提示します。この方法により、細胞分裂中の気孔分化と蛍光標識タンパク質の動的な追跡の観察が可能になります。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 植物生物学
- 細胞発達
- イメージング技術
背景
- 表皮の発達の理解は植物生物学にとって重要です。
- 気孔分化は植物のガス交換において重要な役割を果たします。
- 動的なイメージング技術は静的な観察以上の洞察を提供します。
- 蛍光標識タンパク質はリアルタイムで細胞プロセスを明らかにできます。
研究の目的
- 種子の発芽後の初期の表皮発達を視覚化する。
- 数日間にわたる気孔分化を記録する。
- タンパク質の局在化と発現を動的に追跡する。
使用した方法
- 明確なイメージングのために種皮の除去。
- 固定のためにアガー培地の下に胚軸葉を載せる。
- 数日間にわたるタイムラプスイメージング。
- タンパク質の追跡のための蛍光報告子コンストラクトの使用。
主要な結果
- 動的な遺伝子発現とタンパク質の局在化が観察されました。
- この技術は従来の方法に比べて利点を示しました。
- リアルタイムのイメージングは細胞分裂中の動きを明らかにしました。
- 結果は細胞タイプの分化の理解に貢献します。
結論
- このプロトコルは表皮発達の研究を強化します。
- 動的なイメージングは細胞プロセスへのより深い洞察を提供します。
- この方法は他の植物発達研究にも適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Long-term, high-resolution confocal time-lapse imaging of plant epidermal development enables mechanistic de-risking of target validation in plant-based biopharma discovery. By capturing dynamic protein localization and cell fate decisions over several days, the method supports predictive confidence in early-stage hypothesis testing. This approach addresses the need for longitudinal, quantitative data in systems where cellular events unfold slowly, improving translational continuity from discovery to preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through real-time observation of protein dynamics during asymmetric cell division and differentiation.
- Operational Value: Supports biological de-risking by visualizing spatiotemporal protein localization patterns linked to stem-cell fate decisions.
- Predictive Value: Enhances target confidence by linking fluorophore-tagged protein behavior to functional outcomes in epidermal patterning.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing reproducible, long-term imaging conditions.
- Quantitative Outputs: Enables measurement of protein polarization kinetics and division timing as dependent variables for compound screening.
- Platform Reuse: Facilitates scalable, standardized workflows for evaluating genetic or chemical perturbations in epidermal development.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage epidermal dynamics to preclinical validation through conserved mechanisms of stomatal lineage progression.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing quantitative thresholds for protein polarization preceding asymmetric division.
- Disease-Relevant System: Uses Arabidopsis epidermis as a model for signaling pathways relevant to plant-derived biopharmaceutical production.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification by providing dynamic, quantitative readouts of cellular behavior in a disease-relevant system.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by tracking protein localization during stem-cell division and differentiation events.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility through immobilized sample preparation and configurable time-lapse intervals.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements such as protein polarization timing, subcellular localization shifts, and division symmetry outcomes.
- Translational Research: Connects epidermal development dynamics to preclinical continuity via conserved asymmetric division mechanisms in stomatal lineage.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for longitudinal studies of protein dynamics in plant-based expression systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct observation of protein dynamics during cell fate decisions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of long-term imaging across multiple samples and time points.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in epidermal development pathways.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on quantitative protein localization thresholds linked to functional differentiation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant dissection, confocal microscopy, and fluorescent protein handling.
- Dependent on inverted confocal systems with Z-stack and time-lapse capabilities, such as LSM 700 with appropriate filter sets.
- Necessitates standardization of agar media preparation, temperature control, and sample mounting to prevent developmental artifacts.
- Adaptation considerations include species-specific tissue integrity and fluorescence signal depth in varying epidermal thicknesses.
- Practical limitations include phototoxicity risks over extended imaging and the need for environmental control to maintain sample viability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:00
Seed Sterilization
1:57
Preparation of Chamber Slide
3:11
Seed Dissection
4:47
Mounting Cotyledons in the Chamber Slide
5:40
Time Lapse Imaging
9:29
Results: Changes in Localization of POLAR Protein during Proliferation Stage of Stomatal-lineage Cells in the Cotyledon Epidermis
11:40
Conclusion
