Name: マイクロ流体文化·プラットフォーム（MCP）ベースの神経軸索とグリア共培養系におけるグリア相互作用へのニューロンのイメージング解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 学ぶマイクロ流体文化プラットフォームを用いた神経軸索とアストロサイトの共培養法。共焦点免疫蛍光顕微鏡による時系列イメージングで、ニューロンとグリア細胞の相互作用を詳細に解析する手法です。

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我々は、BAC GLT1たeGFPマウスとGLT1抗体を提供するための博士ジェフリー·ロススタインに感謝したいと思います。貴重なコア機能を提供するため、脳科学研究のためのタフツセンター（PI、ロブ·ジャクソンNIH P30 NS047243）;新教員採用助成金（NIH P30 5P30NS069254-02 ;タフツ神経科学部門のPI、フィル·ヘイドン）。

1。マイクロ流体培養チャンバー（MCP）の組立<ol><li> MCP（ 図1）はセル4の異なる種類の区画文化のために設計されたオープン室である。これは、典型的には、中央のチャネル（直径3μm）を介して接続されている2つの区画を持っています。ガラス底皿とMCPの組み立ては、文化やその後の画像解析を準備するために必要です。 </li><li>まず、オルニチン（Sigma-Aldrich社、1 mg / ml）を持つコート無菌のガラス底皿は四ホウ酸ナトリウム（Sigma-Aldrich社、10mMのpH8.5）に溶解し、37℃で一晩インキュベートした。 </li><li>次の日に、コーティングされたガラス底皿をddH 2 Oで3回洗浄し、滅菌ヒュームフードの下で乾燥させた。ガラス底皿はその後さらにラミニン（シグマアルドリッチは、1 mg / ml）をコーティングし、1時間UV光下で乾燥した。コー​​ティングされた料理は、使用する準備ができているか、使用するまで-20℃で保存することができます。これらのコーティング共培養におけるめっきニューロンおよびアストロサイトのために必要な再。 </li><li>文化プラットフォームを組み立てるために、マイクロ流体文化プラットフォームはタイトなシールを形成するために、その下側の中央の接続チャネルでコーティングされたガラス底皿の上に置かれた。定期的なニューロンやアストロサイトの培養培地を組み立てMCPに両側（ 図1）（細胞播種領域から）を添加し、37℃で2-4時間インキュベートし、MCPとガラスの間に漏れがないことを確認したボトムディッシュ。私たちには漏れがないことを確認するために細胞をプレーティングする前に培地をテストしている。ガラスボトムディッシュにMCPの組み立てが新たに使用する前に準備する必要があります。 </li></ol> 2。組立てMCPの神経軸索の神経文化と誘導の準備<ol><li>大脳皮質の神経細胞培養物は、新鮮胚の14から16日齢マウスの脳から調製した。神経細胞培養培地をNeurobasal培地、2％B27 neurobasaから構成されている100xのグルタマックスの1％、1％ペニシリン - streptomysinを追加することで、リットルサプリメント、2mMグルタミン。マウスの脳の解剖の後、髄膜を解剖顕微鏡下で皮質から削除されました。組織は、トリプシンにさらされる表面積を増やすために、小さな組織ブロックを作るためにかみそりの刃でミン​​チにしました。組織ブロックはファイアーポリッシュパスツールピペットで粉砕して穏やかに解離した後、37℃の水浴中で10分間（Sigma-Aldrich社、0.05％トリプシン）トリプシン処理し、及びました。解離された細胞は、明確な神経細胞懸濁液を収集するために70μmのストレーナーを通して濾過した。 </li><li>そのニューロンは細胞保持領域（ 図1）に接続できるような神経細胞（2-3×10 6個 / ml、150μl）を組み立てたMCPの右側のセルメッキ領域（ 図1）上にプレーティングした。作りたてのニューロンは、レギュレーションに5％ウシ胎児血清（Hyclone）を補充しているニューロンメッキ培地で播種したRニューロン培養培地。細胞保持領域にアタッチのみニューロンが中央のチャネルを介して組み立てられたMCPの反対側に軸索を成長することができるので、それだけでは十分ではニューロンが接続されるように細胞播種面積のニューロンのプレートに高密度に重要である細胞保持領域。神経軸索の高密度の代表画像を図2Aに示されています。 </li><li>翌日、ニューロンメッキ媒体はレギュラーニューロン培養培地と交換した。変化媒体は慎重に細胞保持​​エリアと中央の接続チャネル内の気泡を避けるために、チャンバーの細胞播種エリアからではなく、組み立てたMCPの細胞保持領域から培地を吸引することによって達成された。気泡が厳しく軸索伸長とMCPにおいて中心的なチャネルに次のエントリを阻害するであろう。グリア細胞由来神経栄養因子（GDNF、10〜20 ng / mlの）も、他の側（左側）に追加されました組み立てられたMCP（ 図2A）の中央チャンネルを通じて神経側と十字架から軸索伸長5の誘導を容易にするために同じ日にチャンバーの。 GDNFをせずに自発的な神経突起伸長のかなりの量はまた組み立てられたMCPの中央チャンネルを通じて神経側とクロスから観察される。中央のチャンネルに入力した軸索は、多くの場合2〜3日、めっき後に観察される。軸索は中央のチャンネルに入ると、彼らは通常、1日以内にもう一方の側を入力します。軸索は、反対側を入力した後、少なくとも1週間は正常に変更されていない。 </li></ol> 3。コンパートメント化された共培養系を確立するために、MCPに培養アストロサイトの追加プライマリアストロサイトの培養は、P1-3マウス子犬脳から調製した。脳解離手順は、上記の神経細胞の単離操作に似ています。アストロサイトは、まず事前た10cmの皿に播種したオルニチン（シグマアルドリッチは、1 mg / ml）でコーティングした。星状膠細胞培養培地（DMEM、10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン - streptomysin）破片を除去するために次の2日間、毎日変更されました。その後、培地を3日ごとに変更されました。 <ol><li>アストロサイトは、90％コンフルエントになると7日後に単分子膜を形成します。コンフルエントアストロサイトをトリプシン処理し、軸索が入ろうとしている、または単にの左側に入力したときに再懸濁した星状細胞（1×10 6個 / ml）150μlを組み立てたMCPの左側のセルメッキ面積に再播種したMCPの組み立て。アストロサイトは、通常、神経細胞が播種した4-5日後に播種した。 GDNFは最初MCPの左側にアストロサイトの再メッキ前に削除されました。 GFAPの免疫染色（ 図1）で示されるように、再メッキアストロサイトは、細胞保持領域に付着させた。チャンバーの両側の間の媒質の唯一の最小流量（蛍光dによって決定はい）は、以前に4,6に示すように 、MCPに発見された。 </li><li>アストロサイトは、90％コンフルエントになると7日後に単分子膜を形成します。コンフルエントアストロサイトをトリプシン処理し、軸索が左に先ほど入力を入力するか、または持ってしようとしているときに再懸濁した星状細胞（1×10 6個 / ml）150μlを組み立てたMCPの左側のセルメッキ面積に再播種した組み立てられたMCPの側。アストロサイトは、通常、神経細胞が播種した4-5日後に播種した。 GDNFは最初MCPの左側にアストロサイトの再メッキ前に削除されました。 GFAPの免疫染色（ 図1）で示されるように、再メッキアストロサイトは、細胞保持領域に付着させた。以前に4,6に示すようにチャンバーの両側の間の媒質の唯一の最小流量は、（蛍光色素によって決定される）は、MCPで発見された。 </li><li>アストロサイトの再めっき後、組み立てられたMCPの左側に入った軸索は、直接astrと対話可溶性因子の直接の軸索の接触またはreleaseによってocytes。アストログリア細胞膜のグルタミン酸トランスポーターと神経GLT1βIII-チューブリンの免疫染色すると、 図2D-Fに示すように、軸索とアストロサイトとの間の相互作用を可視化するために行われた。 </li></ol>

<ol><li>Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-astrocyte+signaling+in+the+development+and+plasticity+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Signals%22%5BJournal%5D)">Neuron-astrocyte signaling in the development and plasticity of neural circuits.</a> Neuro-Signals. 16, 278-288 (2008).</li>
<li>Paixao, S., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-astrocyte+communication+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Neuron-astrocyte communication and synaptic plasticity.</a> Current opinion in neurobiology. 20, 466-473 (2010).</li>
<li>Fields, R. D., Stevens-Graham, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+neuron-glia+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">New insights into neuron-glia communication.</a> Science. 298, 556-562 (2002).</li>
<li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature. 1, 2128-2136 (2006).</li>
<li>Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neuromuscular+synapse+development+by+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+and+neurturin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of neuromuscular synapse development by glial cell line-derived neurotrophic factor and neurturin.</a> The Journal of biological chemistry. 277, 10614-10625 (2002).</li>
<li>Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+regulation+of+astroglial+excitatory+neurotransmitter+transporter+GLT1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Presynaptic regulation of astroglial excitatory neurotransmitter transporter GLT1.</a> Neuron. 61, 880-894 (2009).</li>
<li>Regan, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variations+in+promoter+activity+reveal+a+differential+expression+and+physiology+of+glutamate+transporters+by+glia+in+the+developing+and+mature+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Variations in promoter activity reveal a differential expression and physiology of glutamate transporters by glia in the developing and mature CNS.</a> The Journal of neuroscience. 27, 6607-6619 (2007).</li>
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<li>Schlag, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+glial+Na%2B-dependent+glutamate+transporters+by+cyclic+AMP+analogs+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Regulation of the glial Na+-dependent glutamate transporters by cyclic AMP analogs and neurons.</a> Molecular pharmacology. 53, 355-369 (1998).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+culture+system+that+supports+adult+microglial+cell+proliferation+and+maintenance+in+the+resting+state%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological%22%5BJournal%5D)">Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state.</a> Journal of immunological. 300, 32-46 (2005).</li>
<li>Espinosa-Jeffrey, A., Wakeman, D. R., Kim, S. U., Snyder, E. Y., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+system+for+rodent+and+human+oligodendrocyte+specification%2C+lineage+progression%2C+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+stem+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Culture system for rodent and human oligodendrocyte specification, lineage progression, and maturation.</a> Current protocols in stem cell biology. Chapter 2, (2009).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+and+magic+of+glia%3A+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60, 430-440 (2008).</li>
<li>Debanne, D., Rama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+shape+axonal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science+signaling%22%5BJournal%5D)">Astrocytes shape axonal signaling.</a> Science signaling. 4, pe11(2011).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

MCPベースのニューロンとアストロサイトの共培養系は、軸索のみが中央のチャンネルを通過できるようにし、星状膠細胞と相互作用することにより、星状膠細胞シグナル伝達経路の詳細な神経細胞の解剖を可能にします。この共培養系は、便利な、従来のニューロンとアストロサイトの培養の手順で設定することができます。我々はまた、アストロサイトにおける軸索依存GLT1プロモーター活性化を実証するためのeGFPベースのレポーターを用いることにより、この共培養系の実用化を説明した。 このMCPベースのニューロンとアストログリア共培養系は、従来の共培養の方法に比べていくつかの利点が提供：1）リアルタイムでの単一軸索およびアストロサイト間の明示的な形態学的相互作用を視覚化し、識別する能力の高解像度顕微鏡下2）もプロモーター活性化の細胞特異的効果3の薬理学的操作を適用するための制御された独立した微小環境）分析およびタンパク質の発現は、排他的に誘発さ/軸索の接触によって変調されるアストロサイトにおいてアップレギュレート。プライマリーミクログリア10およびオリゴデンドロサイト11</s...

<table border="1"><tbody><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td> Hyclone社</td><td> SH30070.03 </td><td>ニューロンcutlure媒体のニューロンをメッキする</td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> F4135 </td><td>アストロ培地の</td></tr><tr><td>グリア細胞由来神経因子</td><td> R＆Dシステム</td><td> 212-GD </td><td>チャンバーのニューロン側に10から20 ng / mLを適用</td></tr><tr><td>ダルベッコ改変イーグル培地高グルコース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 11995 </td><td></td></tr><tr><td> 70ミリメートルのセルストレーナー</td><td> BDファルコン</td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td>無菌のガラスボトムディッシュ</td><td>マテック株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロ流体文化プラットフォーム</td><td>ゾナマイクロフルイディクスLLC </td><td> SND150 </td><td></td></tr><tr><td>培養プレートの6ウェル</TD&gt; <td> Cellstar </td><td> 657 160 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ニューロン培養培地 <ul><li> Neurobasal培地</li><li> 2パーセントB27 Neurobasalサプリメント</li><li> 100xのグルタマックス1％を追加することにより、2 mMのグルタミン酸</li><li> 1％ペニシリン - streptomysin </li></ul></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> めっきセルのためのニューロン培養培地 <ul><li> Neurobasal培地</li><li> 2パーセントB27 Neurobasalサプリメント</li><li> 100xのグルタマックス1％を追加することにより、2 mMのグルタミン酸</li><li> 1％ペニシリン - streptomysin </li><li> 5％ウシ胎児血清SH30070.03 </li></ul></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> アストロ培地 <ul><li>ダルベッコ改変EAGLE高グルコース培地</li><li> 10％ウシ胎児血清F4135 </li><li> 1％ペニシリン - streptomysin </li></ul></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表1マイクロ流体文化プラットフォームベースの神経軸索とグリア共培養系で使用される材料。 </td></tr></tbody></table>

マイクロ流体文化·プラットフォーム（mcp）ベースの神経軸索とグリア共培養系におけるグリア相互作用へのニューロンのイメージング解析

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

グリア相互作用への適切なニューロンは、中枢神経系（CNS）の生理機能に重要である。この双方向通信は高度にニューロンとグリア1,2の間の特定のシグナル伝達経路によって媒介される。これらのシグナル伝達経路の同定および特徴は、グリア相互作用の形中枢神経生理学にどのニューロンの理解に不可欠である。以前は、ニューロンとグリア細胞混合培養が広くニューロンとグリア細胞間のシグナル伝達経路をテストおよび特性評価に利用されてきた。我々 は 、in vivo のツールで 、これらの製剤と他から学んだことは、しかし、ニューロンとグリア細胞間の相互シグナリングがしばしばニューロン（ すなわち 、軸索、樹状突起、またはソーマ）3内の特定の区画で発生したことを示唆している。これは、重要な神経区画の分離を可能にする新しい培養システムを開発することができ、具体的にはグリア細胞と神経の間の相互作用を調べNAL軸索/樹状突起。加えて、従来の混合培養系は、可溶性因子とニューロンとグリア細胞間の直接メンブレン接点信号を区別することができるではありません。さらに、従来の共培養系におけるニューロンとグリア細胞の大量は、単一の軸索とグリア細胞間の相互作用を観察するために必要な決議を欠いている。 そこで本研究では、マイクロ流体文化プラットフォーム（MCP）を用いた新規軸索とグリア共培養系を記述します。この共培養系では、神経細胞とグリア細胞は、複数の中央のチャネルで接続されている2つの別々の室で培養される。このマイクロ流体文化のプラットフォームでは、唯一の神経プロセス（特に軸索）は、中央のチャネルを介してグリア側を入力することができます。強力な蛍光タンパク質の標識との組み合わせでは、このシステムはそのような、軸索/樹状細胞およびグリア相互作用の間のシグナル伝達経路を直接検査することができます神経端末におけるグリア、グリア媒介受容体の輸送、およびグリア媒介軸索成長のs軸索を介した転写調節。チャンバーの狭い直径も大きく軸索/樹状突起とグリアの表面との間の直接の膜タンパク質相互作用のプロービングを容易にして、グリアチャンバー内にニューロンに富んだ媒体の流れを禁止しています。

アストロサイトにおける軸索誘導のGLT1プロモーター活性化のタイムラプスイメージング解析コンパートメントニューロンとアストロサイトの共培養システムは、特に唯一の神経突起、軸索は、選択的にアストロサイトと対話することができます。組み立てMCPにおける軸索と星状膠細胞（または他のグリア細胞）の共培養の成功確立に続いて、軸索·グリア相互作用の異なる種類は、次のような研究することができる、アストログリア遺伝子プロモーターの活性化アストロサイト誘導性の軸索ガイダンスの軸索誘導活性化を、オリゴデンドロサイトにおける軸索誘導のアストログリアのCa 2 +応答、および軸索誘導のミエリン合成。これらすべてのアプリケーションは、グリア細胞またはこれらの細胞にロード染料に使用できる強力な蛍光レポーターの可用性を活用しています。 ここでは、細菌人工染色体を用いてアストログリア型グルタミン酸トランスポーター1（GLT1）プロモーターの軸索誘導の転写活性化を記述するいくつかの（BAC）GLT1のeGFPトランスジェニックマウスおよびこのコ...

この研究では、神経細胞の軸索と小説（ASTRO）グリア共培養プラットフォームをセットアップする手順について説明します。この共培養系では、単一の軸索（と単一神経膠細胞）との間の直接的な相互作用の操作は、グリアシグナリング相互ニューロンのメカニズム解析を可能にすることが可能となる。

マイクロ流体文化·プラットフォーム（MCP）ベースの神経軸索とグリア共培養系におけるグリア相互作用へのニューロンのイメージング解析

適切なニューロンとグリア細胞の相互作用は、中枢神経系（CNS）の生理学的機能にとって極めて重要である。この双方向のコミュニケーションは...

本プロトコールでは、高解像度イメージングを用いてニューロンとグリア細胞の相互作用を解析するための、新しいニューロン軸索およびアストログリア共培養プラットフォームを構築します。まず、マイクロ流体培養チャンバーを組み立て、ニューロン培養物を調製し、MCPの反対側へニューロン軸索を伸展させます。次に、培養アストロサイトを添加してコンパートメント化された共共培養系を構築します。共焦点免疫蛍光顕微鏡を用いたタイムラプスイメージングなどの結果から、軸索、アストログリア、およびニューロン軸索間の相互作用を理解することが可能になります。この手法を考案したきっかけは、GT1の調節に対する神経突起の影響と神経分泌の影響を分離して検討しようとしたことでした。通常、この手法に慣れていない方は、軸索を細胞コンパートメントの別の領域へと誘導させることに苦労します。そのため、神経細胞側のプレートにおいて、中央チャネルの付近に健康な神経細胞を高密度に播種する必要があります。MCPオープンチャンバーは、異なる種類の細胞を区画化して培養するように設計されており、共培養でニューロンおよびアストロサイトを播種するには、ポリウレタンおよびラミニンのコーティングが必要です。まず、1 mg/mLのポリウレタン溶液を滅菌済みのガラスボトムディッシュに塗布し、37 °Cで一晩インキュベートします。コーティングしたガラスボトムディッシュを二回蒸留水で3回洗浄し、その後、滅菌済みドラフトチャンバー内で乾燥させます。次に、1 mg/mLのラミニンでディッシュをコーティングし、UVライトの下で1時間乾燥させます。ガラスボトムディッシュ上へのMCPの組み立ては、使用直前に行う必要があります。中央の接続チャネルが底面になるようにマイクロ流体培養プラットフォームを配置し、コーティングしたガラスと密閉させます。ボトムディッシュ。組み立てたMCPの両側に、通常のニューロンまたはアストロサイト培養培地を加えます。チャンバーを37 °Cで2～4時間インキュベートし、MCPとガラスの間に漏れがないことを確認します。下層ディッシュ。皮質ニューロン細胞培養は、胚齢14日から16日のマウス脳から新鮮に調製します。マウス脳の解剖後、解剖顕微鏡下で皮質から髄膜を除去します。カミソリの刃を用いて組織を細かく刻み、遠心分離後に刻んだ組織ブロックをチューブに入れます。ペレット上の培地を除去し、0.05% Trypsinを加えて37 °Cのウォーターバスで10分間処理します。火炎研磨したパステールピペットで穏やかに撹拌し、細胞を解離させます。70 µmのストレーナーにサンプルを通し、ニューロン播種用培地（5% FBS添加）を用いて、透明な神経細胞懸濁液を回収します。組み立て済みMCPプレートの右側に、150 µLのニューロンを播種します。細胞保持領域に付着したニューロンのみが、組み立てられたMCPの中央チャネルを通って反対側まで軸索を伸展させることができるため、高密度のニューロンが必要です。翌日、チャンバーの細胞播種領域から培地を慎重に吸引し、ニューロン播種用培地を通常のニューロン培養培地と交換します。培地に20 nanograms per milliliterのグリア細胞株由来神経栄養因子（GDNF）を加え、チャンバーのアストロサイト側に添加します。これにより化学的勾配が形成され、組み立てられたMCPの中央チャネルを介して、ニューロン側からの軸索伸展が誘導されます。2日後、中央チャネルに進入した軸索がないか観察します。軸索が中央チャネルに進入すると、通常は1日以内に反対側に到達します。軸索は、反対側に到達した後、少なくとも1週間は正常な状態を維持します。P1〜3のマウスから脳を分離した後、アストロサイトをポリウレタンコーティングされた10 cmディッシュに播種します。細胞をオーバーナイトで培養し、その後2日間は毎日アストロサイト培養液を補充し、7日後以降はアストロサイトが90%コンフルエントな単層を形成するまで3日ごとに補充します。その後、トリプシンを用いて細胞を回収します。ニューロンを播種してから約5日後に、GDNFを吸引除去します。次に、再懸濁したアストロサイト 150 µLを、組み立てたMCPの左側に播種します。アストロサイトの再播種後、軸索がMCPの左側に進入し始めるか、あるいは進入した直後の時点で、進入した軸索は、直接的な接触または可溶性因子の放出を通じてアストロサイトと直接相互作用します。アストロサイトが細胞保持領域に接着したかを確認します。区画化された共培養システム内の細胞を免疫染色し、軸索とアストロサイトの相互作用に関与するタンパク質などの特異的タンパク質を可視化します。この区画化されたニューロンおよびアストロサイト共培養システムにより、ニューロン突起、特に軸索のみが選択的にアストロサイトと相互作用することが可能になります。ここでは、軸索によって誘導されるアストログリアグルタミン酸輸送体の転写活性化について記述します。これらの研究では、GT1ゲノムプロモーターの制御下でEGF蛍光レポーターを発現するトランスジェニックマウスを使用しています。組み立てられたMCPAの細胞保持領域に高密度のニューロンを培養させます。拡大図では、軸索が中央チャネルを横切り、反対側へ進入している様子が示されており、β3-tubulin染色によって軸索の成長円錐が明らかになっています。MCPシステムを用いることで、軸索束が中央チャネルを通って成長し、反対側へ進入する様子をモニタリングすることが可能です。GLT1の免疫染色により、MCPシステムのグリア側に現れたアストロサイトが特定されます。画像には、軸索とGLT1陽性アストロサイトとの接触部位が示されています。EGFPリポーターの発現は、内因性GT oneプロモーターの活性化、タンパク質発現、および機能的活性と相関しています。C twoにおける単一アストロサイトのGT oneプロモーター活性の評価では、コンパートメント化共培養システムにおいてGLT one免疫反応性が有意に増加していることが示されました。重要な点として、MCPシステムではタイムラプス画像による動的な変化のモニタリングが可能です。例えば、これらのデータは、アストロサイトの播種から1日後、GT1 EGFPアストロサイトと野生型ニューロンにおいて、軸索がGT1プロモーターの活性化を誘導したことを示しています。この時点では、EGFP蛍光はごくわずかしか観察されません。共培養から48時間後、軸索がアストロサイト側に十分に伸展し、ここでアストロサイトと直接的に接触・相互作用すると、EGFP強度は著しく増加します。組み立てられたMCPのニューロン側にキニーネ処理を施すと、ニューロンの細胞死が誘導されました。興味深いことに、軸索の退縮と変性に加え、軸索におけるEGFP蛍光の減少も促進されました。軸索に応答したEGFP蛍光強度のこれらの動的な変化は、Astroglia GT oneプロモーター活性が軸索との相互作用によって調節されることを明確に示しています。このビデオを視聴することで、マイクロ流体培養プラットフォームを用いたコア培養システムの構築方法について十分に理解できるはずです。この技術を習得すれば、数日で適切に実施できるようになります。

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バイオMEMS：生物学者とエンジニアの間の新しいコラボレーションを鍛造

この記事では、新規プロトコルと試薬の高いコンテンツの分析を用いてニューロンとアストロサイトの共培養での化合物および治療の神経毒性効果の感度測定のために設計されたセットを説明します。結果は、高含有量の分析は、神経毒性評価のためのエキサイティングな新技術を表すことを示している。...

神経毒性の高いコンテンツ分析のための神経とアストロサイト共培養アッセイ

マルチコンパートメントのCNSニューロングリア共培養マイクロ流体プラットフォーム

このビデオは、多電極アレイを備えたマイクロ流体デバイスを使用して、hiPSC由来の皮質グルタミン酸作動性ニューロンと神経膠腫細胞の共培養におけるニューロンの電気的活動の評価を示しています。...

共培養におけるグルタミン酸作動性ニューロンと神経膠腫細胞の相互作用の評価

このプロトコルは、ニューロン - グリア相互作用の区画化分析のための間接的なニューロン、星状細胞共培養を説明します。...

間接ニューロン、星状細胞共培養アッセイ：<em&gt;インビトロ</em&gt;ニューロングリアの相互作用の詳細な調査のためのセットアップ

このプロトコルを目指す活動電位神経文化伝達を研究するためのマイクロ流体デバイスと体外電極アレイを結合する方法を示します。データ分析、すなわち検出と、活動電位伝搬の特性は新しい高度なを使用して実行されるまだユーザーフレンドリーおよび自由に利用できる計算ツール。...

神経細胞のコミュニケーションと軸索の信号伝搬特性を研究するためマイクロ電極アレイとのインタ フェース

ここでは、高収率と再現性を持つ、胚性皮質由来のニューロンおよびアストロサイトエンリッチ培養、またはニューロングリア培養を確立できる特定の培養培地を用いた簡単なアプローチを提示する。...

虚血におけるニューロングリア相互作用の役割を研究するための細胞培養モデル

最近の研究では、高等度の小児神経膠腫(pHGG)細胞とそれらの相互相互作用に対する神経細胞の影響を明らかにする。本研究は、イン ビトロ...

グルタミン酸ニューロンと小児の高品位グリオーマ細胞の微小流体デバイスへの共培養による電気的相互作用の評価

このプロトコルは、胚の日15-16でマウスの胚から単離された初代ニューロン細胞から確立されたミクログリア-ニューロン共培養と、出生後1-2日に新生児マウスの脳から生成された初代ミクログリアを説明しています。...

マウス初代ミクログリアと皮質ニューロンの作製と共培養

このプロトコルは、軸索損傷後のニューロン代謝ダイナミクスをモデル化するマイクロ流体システムを記述し、内因性代謝リモデリングのイメージング、マルチオミクス分析、およびメカニズム研究を可能にします。...

軸索損傷モデル用マイクロ流体チップの構築とマルチオミクス解析の実現

学ぶマイクロ流体文化プラットフォームを用いた神経軸索とアストロサイトの共培養法。共焦点免疫蛍光顕微鏡による時系列イメージングで、ニューロンとグリア細胞の相互作用を詳細に解析する手法です。

マイクロ流体文化·プラットフォーム（MCP）ベースの神経軸索とグリア共培養系におけるグリア相互作用へのニューロンのイメージング解析

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