マイクロ流体文化·プラットフォーム（MCP）ベースの神経軸索とグリア共培養系におけるグリア相互作用へのニューロンのイメージング解析

本プロトコールでは、高解像度イメージングを用いてニューロンとグリア細胞の相互作用を解析するための、新しいニューロン軸索およびアストログリア共培養プラットフォームを構築します。まず、マイクロ流体培養チャンバーを組み立て、ニューロン培養物を調製し、MCPの反対側へニューロン軸索を伸展させます。次に、培養アストロサイトを添加してコンパートメント化された共共培養系を構築します。共焦点免疫蛍光顕微鏡を用いたタイムラプスイメージングなどの結果から、軸索、アストログリア、およびニューロン軸索間の相互作用を理解することが可能になります。

この手法を考案したきっかけは、GT1の調節に対する神経突起の影響と神経分泌の影響を分離して検討しようとしたことでした。通常、この手法に慣れていない方は、軸索を細胞コンパートメントの別の領域へと誘導させることに苦労します。そのため、神経細胞側のプレートにおいて、中央チャネルの付近に健康な神経細胞を高密度に播種する必要があります。

MCPオープンチャンバーは、異なる種類の細胞を区画化して培養するように設計されており、共培養でニューロンおよびアストロサイトを播種するには、ポリウレタンおよびラミニンのコーティングが必要です。まず、1 mg/mLのポリウレタン溶液を滅菌済みのガラスボトムディッシュに塗布し、37 °Cで一晩インキュベートします。コーティングしたガラスボトムディッシュを二回蒸留水で3回洗浄し、その後、滅菌済みドラフトチャンバー内で乾燥させます。

次に、1 mg/mLのラミニンでディッシュをコーティングし、UVライトの下で1時間乾燥させます。ガラスボトムディッシュ上へのMCPの組み立ては、使用直前に行う必要があります。中央の接続チャネルが底面になるようにマイクロ流体培養プラットフォームを配置し、コーティングしたガラスと密閉させます。

ボトムディッシュ。組み立てたMCPの両側に、通常のニューロンまたはアストロサイト培養培地を加えます。チャンバーを37 °Cで2～4時間インキュベートし、MCPとガラスの間に漏れがないことを確認します。

下層ディッシュ。皮質ニューロン細胞培養は、胚齢14日から16日のマウス脳から新鮮に調製します。マウス脳の解剖後、解剖顕微鏡下で皮質から髄膜を除去します。

カミソリの刃を用いて組織を細かく刻み、遠心分離後に刻んだ組織ブロックをチューブに入れます。ペレット上の培地を除去し、0.05% Trypsinを加えて37 °Cのウォーターバスで10分間処理します。火炎研磨したパステールピペットで穏やかに撹拌し、細胞を解離させます。

70 µmのストレーナーにサンプルを通し、ニューロン播種用培地（5% FBS添加）を用いて、透明な神経細胞懸濁液を回収します。組み立て済みMCPプレートの右側に、150 µLのニューロンを播種します。

細胞保持領域に付着したニューロンのみが、組み立てられたMCPの中央チャネルを通って反対側まで軸索を伸展させることができるため、高密度のニューロンが必要です。翌日、チャンバーの細胞播種領域から培地を慎重に吸引し、ニューロン播種用培地を通常のニューロン培養培地と交換します。

培地に20 nanograms per milliliterのグリア細胞株由来神経栄養因子（GDNF）を加え、チャンバーのアストロサイト側に添加します。これにより化学的勾配が形成され、組み立てられたMCPの中央チャネルを介して、ニューロン側からの軸索伸展が誘導されます。2日後、中央チャネルに進入した軸索がないか観察します。

軸索が中央チャネルに進入すると、通常は1日以内に反対側に到達します。軸索は、反対側に到達した後、少なくとも1週間は正常な状態を維持します。P1〜3のマウスから脳を分離した後、アストロサイトをポリウレタンコーティングされた10 cmディッシュに播種します。

細胞をオーバーナイトで培養し、その後2日間は毎日アストロサイト培養液を補充し、7日後以降はアストロサイトが90%コンフルエントな単層を形成するまで3日ごとに補充します。その後、トリプシンを用いて細胞を回収します。ニューロンを播種してから約5日後に、GDNFを吸引除去します。次に、再懸濁したアストロサイト 150 µLを、組み立てたMCPの左側に播種します。アストロサイトの再播種後、軸索がMCPの左側に進入し始めるか、あるいは進入した直後の時点で、進入した軸索は、直接的な接触または可溶性因子の放出を通じてアストロサイトと直接相互作用します。

アストロサイトが細胞保持領域に接着したかを確認します。区画化された共培養システム内の細胞を免疫染色し、軸索とアストロサイトの相互作用に関与するタンパク質などの特異的タンパク質を可視化します。この区画化されたニューロンおよびアストロサイト共培養システムにより、ニューロン突起、特に軸索のみが選択的にアストロサイトと相互作用することが可能になります。

ここでは、軸索によって誘導されるアストログリアグルタミン酸輸送体の転写活性化について記述します。これらの研究では、GT1ゲノムプロモーターの制御下でEGF蛍光レポーターを発現するトランスジェニックマウスを使用しています。組み立てられたMCPAの細胞保持領域に高密度のニューロンを培養させます。拡大図では、軸索が中央チャネルを横切り、反対側へ進入している様子が示されており、β3-tubulin染色によって軸索の成長円錐が明らかになっています。

MCPシステムを用いることで、軸索束が中央チャネルを通って成長し、反対側へ進入する様子をモニタリングすることが可能です。GLT1の免疫染色により、MCPシステムのグリア側に現れたアストロサイトが特定されます。画像には、軸索とGLT1陽性アストロサイトとの接触部位が示されています。

EGFPリポーターの発現は、内因性GT oneプロモーターの活性化、タンパク質発現、および機能的活性と相関しています。C twoにおける単一アストロサイトのGT oneプロモーター活性の評価では、コンパートメント化共培養システムにおいてGLT one免疫反応性が有意に増加していることが示されました。重要な点として、MCPシステムではタイムラプス画像による動的な変化のモニタリングが可能です。

例えば、これらのデータは、アストロサイトの播種から1日後、GT1 EGFPアストロサイトと野生型ニューロンにおいて、軸索がGT1プロモーターの活性化を誘導したことを示しています。この時点では、EGFP蛍光はごくわずかしか観察されません。共培養から48時間後、軸索がアストロサイト側に十分に伸展し、ここでアストロサイトと直接的に接触・相互作用すると、EGFP強度は著しく増加します。

組み立てられたMCPのニューロン側にキニーネ処理を施すと、ニューロンの細胞死が誘導されました。興味深いことに、軸索の退縮と変性に加え、軸索におけるEGFP蛍光の減少も促進されました。軸索に応答したEGFP蛍光強度のこれらの動的な変化は、Astroglia GT oneプロモーター活性が軸索との相互作用によって調節されることを明確に示しています。

このビデオを視聴することで、マイクロ流体培養プラットフォームを用いたコア培養システムの構築方法について十分に理解できるはずです。この技術を習得すれば、数日で適切に実施できるようになります。