用いたDNA損傷チェックポイントの研究

この手順の全体的な目的は、xip卵抽出液をモデルシステムとして用いて、DNA損傷チェックポイントを調査することです。まず、xip卵から低速抽出液を調製します。次に、MMSやUV照射などのDNA損傷手法を用いて、損傷した精子クロマチンを調製します。

また、DNA損傷模倣構造を準備します。損傷した精子クロマチンまたはa T 70を用いて、LSEにおけるDNA損傷チェックポイントを誘発させるためにa T 70を添加します。最終的に、ブロットの結果から、ゼノプスの卵抽出液におけるa TR check one介在性のDNA損傷チェックポイントに関する知見を得ることができます。

こんにちは。UNCシャーロット大学生物学科のCH Yです。本日は、ダメージテックポイントシグナリングを調査するためのモデルシステムとして、膿抽出液をどのように使用するかについて説明します。

この手法は、DNA損傷チェックポイントがどのように活性化されるかなど、ダイナミック不安定性分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本プロトコルでは、opus卵抽出液およびDNA損傷チェックポイント誘導試薬の調製と、DNA損傷チェックポイントおよびxapの解析について説明します。これらの手法は、4NQOやエトポシドを含むさまざまなDNA損傷アプローチに適応可能です。

DNA損傷チェックポイントの研究を開始しましょう。メスのアフリカツメガエルを皮下プライミングするために、背側リンパ嚢にPMSG 100 unitsを注射します。プライミングから最低2日間待機した後、プライミング済みの各カエルにヒト絨毛性ゴナドトロピン500 unitsを背側リンパ嚢に皮下注射して産卵を誘導します。注射後のカエルは、2リットルのMarx modified ringer solutionを入れた個別のバケツの中で14～20時間インキュベートしてください。

バケツからカエルを取り出し、MMR溶液を約100 milliliters残して捨てます。次に、卵をバケツから250 milliliterビーカーに移し、2%cysteine (pH 7.8) を約30秒ごとに100 millilitersずつ加えて、卵のゼリー層を除去します。直径0.7 centimetersの逆さまにしたガラスパステールピペットで卵を静かに撹拌し、システイン液をデカンテーションで取り除いて新しいシステイン液と交換する操作を2回繰り返します。

脱包膜（de-detailing）プロセスは約5分から15分で完了します。卵がビーカーの底に凝縮した層を形成したら、システイン溶液を捨て、0.25 XMMR溶液で卵を3回洗浄してください。ガラスピペットで卵をかき混ぜ、ビーカーの中央に集まりやすい、白く膨らんだ不良卵がないか確認します。

パスチャーピペットを使用して、不良卵を除去します。次に、卵を卵溶解バッファーで3回洗浄します。さらに不良卵があれば除去し、卵を14 mLファルコンチューブに注ぎます。

188 ×gで55秒間遠心分離し、卵を凝集させます。スイングバケットローターを備えた臨床用卓上遠心機を用いて、卵の層の上にある余分な緩衝液を除去します。次に、凝集した卵1 mLあたり、10 mg/mLのaprotinin、leptinまたはALを0.5 µL、および5 mg/mLのcytokine B（cyto B）を0.5 µL添加します。Sarva RC 6+ super speed centrifuge（HB 6スイングバケットローター使用）を用い、4 °Cで15分間、16,500 ×gで遠心分離します。遠心分離後、卵はチューブ内で上から順に脂質抽出画分、抽出画分、および卵黄色素の3層に分かれます。21Gの針を用いて、ファルコンチューブの中間抽出層の下部側面を穿刺します。

穿刺針がプラスチックによって遮られている可能性があるため、慎重に針を取り除きます。抽出液を回収するため、1 mLシリンジに取り付けた新しい21ゲージの針を穿刺部位に挿入します。

脂質層や卵黄色素層による汚染および気泡の混入に注意しながら、抽出液をゆっくりと吸引します。抽出液を冷却した1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに移します。卵抽出液1 milliliterにつき、10 milligrams per milliliterの溶液を10 microliters加えます。

シクロヘキシミド（10 mg/mL）を1 µL、プロニンレプチン（5 mg/mL）を1 µL、サイトカインB（1 M DTT）を1 µL、および（10 mg/mL）を0.33 µL加えます。卵抽出液を少なくとも10回、緩やかに転倒混和します。ただし、LSEの品質が低下するため、低速抽出液は4時間以内に使用する必要があります。

4時間後の自然解凍後、2種類の合成オリゴヌクレオチドを2 µg/µLの濃度になるよう水で溶解します。各オリゴヌクレオチドを100 µLずつ1.5 mLマイクロ遠心チューブに加え、95 °Cのヒートブロックで5分間インキュベートします。オリゴヌクレオチド混合物が入ったチューブをドライバスブロックから取り出し、室温まで冷却させます。その後、10 µLずつ分注し、-20 °Cで保存します。

ALサンプルは、最終濃度2 µg/µLのA T 70デュプレックスになります。TudorおよびWalterの記述に従い、0.5 mLのクロマチンを用いて正常な精子クロマチンを調製します。そこに9.1 MのMMSを5.5 µL加えます。

IE CCL two 臨床遠心機（スイングバケットローターおよびチューブアダプター使用）を用い、サンプルチューブを室温で30分間回転機に設置します。サンプルを室温で686 ×gにて10分間遠心分離します。上清を廃棄し、B-S-A-D-T-T-A proinおよびleptinを含む0.5 mLのバッファーXでペレットを洗浄します。

この工程を3回繰り返し、ペレットを0.5 millilitersのBuffer xで再懸濁します。ヘモサイトメーターを用いて精子クロマチンの濃度を測定します。

次に、サンプルを1 µLあたり100,000精子の濃度に希釈し、5 µLずつ分注して-80 °Cで保存します。パラフィルムの断片の上に、必要量の正常な精子クロマチンを添加し、サンプルをUVクロスリンカーに入れます。所定のエネルギーパラメータを設定し、UV光を用いて精子クロマチンに損傷を与えます。

UV処理した精子クロマチンを直ちに使用し、調製した低速抽出液（LSE）においてDNA損傷チェックポイントを誘導します。50 µLのLSE、1 µLのエネルギー混合液、および2 µLの損傷精子クロマチンを混合します。反応液を室温で90分間インキュベートし、少なくとも30分経過した後は、10分おきにチューブを軽く叩いて（フリックして）混ぜ合わせてください。

インキュベーション後、1 µLの反応混合液を顕微鏡スライドグラス上に分注し、1 µLの核ダイス溶液を加えます。カバーガラスを被せ、蛍光顕微鏡で核の形成を確認します。通常、30分間のインキュベーション後に円形の核が形成され、これはDNA複製が開始されたことを示します。

また、抗check one抗体を用いた免疫ブロッティングにより、反応混合液10 µLを評価します。マイクロ遠心チューブに、LSE 50 µL、energy mixture 1 µL、およびtoto mycinストック溶液1.6 µLを混合します。次に、2 µg/µLのT 70 DNA二本鎖DNA 1.25 µLを添加するか、陰性対照として水を1.25 µL添加します。

反応液を室温で90分間インキュベートし、10分ごとに反応チューブを軽く叩いて混ぜ合わせます。次に、Chk1タンパク質のウェスタンブロット分析のため、反応混合液10 µLを90 µLのサンプルバッファーに加えます。対照群のMMS誘導と比較して、損傷した精子クロマチンまたはDNA損傷模倣構造は、Xenopus卵抽出系においてChk1を介したDNA損傷チェックポイントを効果的に活性化します。

TRキナーゼ活性化の指標となる、Ser344のチェック1リン酸化を確認します。同様に、DNA損傷模倣構造であるT70もチェック1リン酸化を誘導します。習得すれば、LSEの調製は約1時間で完了できます。

抽出物の品質は約4時間後に低下するため、迅速かつ効率的な操作が不可欠です。これらの手法を他のアプローチと組み合わせることで、DNA損傷チェックポイントシグナリングに関する重要な疑問を明らかにすることができます。例えば、免疫枯渇法を用いて、標的タンパク質がDNA損傷チェックポイントに必要であるかどうかを検証することが可能です。

このビデオを視聴することで、出芽酵母抽出物を用いたモデルシステムでのDダメージチェックポイントの研究方法について、十分な理解が得られたはずです。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験が成功することを願っております。