Name: 海馬のインスリンおよびマイクロインジェクションマイクロダイアリシス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-11T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 学ぶ海馬のマイクロダイアリシスとマイクロインジェクションによる代謝測定法。行動課題中の神経化学変化をリアルタイムに解析し、空間作動記憶と代謝の関連を解明する技術です。

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<ol><li>McNay, E. C., Fries, T. M., Gold, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreases+in+rat+extracellular+hippocampal+glucose+concentration+associated+with+cognitive+demand+during+a+spatial+task%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Decreases in rat extracellular hippocampal glucose concentration associated with cognitive demand during a spatial task.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (6), 2881(2000).</li>
<li>McNay, E. C., Gold, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+differences+in+hippocampal+extracellular+fluid+glucose+concentration+during+behavioral+testing+and+following+systemic+glucose+administration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gerontol.+A.+Biol.+Sci.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Age-related differences in hippocampal extracellular fluid glucose concentration during behavioral testing and following systemic glucose administration.</a> J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 56 (2), 66(2001).</li>
<li>McNay, E. C., McCarty, R. C., Gold, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+in+brain+glucose+concentration+during+behavioral+testing%3A+dissociations+between+brain+areas+and+between+brain+and+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">Fluctuations in brain glucose concentration during behavioral testing: dissociations between brain areas and between brain and blood.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 75 (3), 325(2001).</li>
<li>McNay, E. C., Gold, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+glucose+concentrations+in+the+rat+hippocampus+measured+by+zero-net-flux%3A+effects+of+microdialysis+flow+rate%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Extracellular glucose concentrations in the rat hippocampus measured by zero-net-flux: effects of microdialysis flow rate.</a> 72 (2), 785(1999).</li>
<li>McNay, E. C., Sherwin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+recurrent+hypoglycemia+on+spatial+cognition+and+cognitive+metabolism+in+normal+and+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Effect of recurrent hypoglycemia on spatial cognition and cognitive metabolism in normal and diabetic rats.</a> Diabetes. 53 (2), 418(2004).</li>
<li>McNay, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+memory+processes+are+modulated+by+insulin+and+high-fat-induced+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 93 (4), 546(2010).</li>
<li>McNay, E. C., McCarty, R. C., Gold, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+in+brain+glucose+concentration+during+behavioral+testing%3A+dissociations+between+brain+areas+and+between+brain+and+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+%26+Memory%22%5BJournal%5D)">Fluctuations in brain glucose concentration during behavioral testing: dissociations between brain areas and between brain and blood.</a> Neurobiology of Learning & Memory. 75 (3), 325(2001).</li>
<li>McNay, E. C., Williamson, A., McCrimmon, R. J., Sherwin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+and+neural+hippocampal+effects+of+long-term+moderate+recurrent+hypoglycemia%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Cognitive and neural hippocampal effects of long-term moderate recurrent hypoglycemia.</a> Diabetes. 55 (4), 1088(2006).</li>
<li>McNay, E. C., Sherwin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+artificial+cerebro-spinal+fluid+%28aCSF%29+to+artificial+extracellular+fluid+%28aECF%29%3A+microdialysis+perfusate+composition+effects+on+in+vivo+brain+ECF+glucose+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">From artificial cerebro-spinal fluid (aCSF) to artificial extracellular fluid (aECF): microdialysis perfusate composition effects on in vivo brain ECF glucose measurements.</a> Journal of Neuroscience Methods. 132 (1), 35(2004).</li>
<li>McNay, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+memory+processes+are+modulated+by+insulin+and+high-fat-induced+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 93 (4), 546(2010).</li>
<li>Benveniste, H., Drejer, J., Schousboe, A., Diemer, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+cerebral+glucose+phosphorylation+and+blood+flow+after+insertion+of+a+microdialysis+fiber+through+the+dorsal+hippocampus+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Regional cerebral glucose phosphorylation and blood flow after insertion of a microdialysis fiber through the dorsal hippocampus in the rat.</a> Journal of Neurochemistry. 49 (3), 729(1987).</li>
<li>Benveniste, H., Diemer, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+reactions+to+implantation+of+a+microdialysis+tube+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Cellular reactions to implantation of a microdialysis tube in the rat hippocampus.</a> Acta Neuropathologica. 74 (3), 234(1987).</li>
<li>McNay, E. C., Fries, T. M., Gold, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreases+in+rat+extracellular+hippocampal+glucose+concentration+associated+with+cognitive+demand+during+a+spatial+task%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Decreases in rat extracellular hippocampal glucose concentration associated with cognitive demand during a spatial task.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2881(2000).</li>
<li>McNay, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+memory+processes+are+modulated+by+insulin+and+high-fat-induced+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance.</a> Neurobiol. Learn Mem. 93 (4), 546(2010).</li>
<li>Lonnroth, P., Jansson, P. -A., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microdialysis+method+allowing+characterization+of+intercellular+water+space+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">A microdialysis method allowing characterization of intercellular water space in humans.</a> American Journal of Physiology. 1987, E228(1987).</li>
<li>McNay, E. C., Gold, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+glucose+concentrations+in+the+rat+hippocampus+measured+by+zero-net-flux%3A+effects+of+microdialysis+flow+rate%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Extracellular glucose concentrations in the rat hippocampus measured by zero-net-flux: effects of microdialysis flow rate.</a> 72 (2), 785(1999).</li>
<li>Lalonde, R. obert <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurobiological+basis+of+spontaneous+alternation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+%26+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">The neurobiological basis of spontaneous alternation.</a> Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 26 (1), 91(2002).</li>
<li>Richman, C., Dember, W., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+alternation+behavior+in+animals%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Psychology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous alternation behavior in animals: A review.</a> Current Psychology. 5 (4), 358(1986).</li>
<li>McNay, E. C., Canal, C. E., Sherwin, R. S., Gold, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+memory+with+septal+injections+of+morphine+and+glucose%3A+effects+on+extracellular+glucose+levels+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Modulation of memory with septal injections of morphine and glucose: effects on extracellular glucose levels in the hippocampus.</a> Physiol. Behav. 87 (2), 298(2006).</li>
<li>McNay, E. C., Gold, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+modulation+across+neural+systems%3A+intra-amygdala+glucose+reverses+deficits+caused+by+intraseptal+morphine+on+a+spatial+task+but+not+on+an+aversive+task%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Memory modulation across neural systems: intra-amygdala glucose reverses deficits caused by intraseptal morphine on a spatial task but not on an aversive task.</a> Journal of Neuroscience. 18 (10), 3853(1998).</li>
<li>Rex, A., Bert, B., Fink, H., Voigt, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-dependent+changes+of+extracellular+glucose+in+the+rat+hippocampus+determined+by+in+vivo+microdialysis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Stimulus-dependent changes of extracellular glucose in the rat hippocampus determined by in vivo microdialysis.</a> Physiol. Behav. 98 (4), 467(2009).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

微小透析で使用されるすべてのソリューションは、0.2μmのフィルターを用いて、直ちに使用前にフィルタリングする必要があります。ガイドカニューレにプローブを挿入した後、その流れが妨げられており、サンプル採取が行われていることを確認するために守ってください。流れが挿入後に停止した場合、最も可能性の高い原因は、挿入時に不十分なケアによって生じるプローブ膜への損傷であり、新鮮なプローブは、置換されている必要があります。 上述しましたように、これらのメソッドへの鍵となる利点が目を覚まして、自由に移動する動物での行動と神経化学的両方の対策を可能にして、混乱させるの欠如である：これを活用するために、試験前に大規模な処理は動物が中に強調されていないすべきことを命ずることが不可欠である測定。平衡期間は一般的に安定した代謝のベースラインを提供するのに十分であるが、動物全体で均一な血糖値を確保するために必要に応じて食品は試験前に1〜2時間のために削除されることがあります。 木曜日電子サンプリング手法としてMDの2つの最も重要な制限は、（i）制限検体...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td>試薬の大半は標準的な実験用グレードであり、選択肢のサプライヤーから入手することができます。同様に、このようなシリンジポンプと配管などの機器は、複数のメーカーのいずれかから使用することができます。詳細は重要であるためここでは、特定の項目が含まれます： </td></tr><tr><td> CMAは12マイクロダイアリシスプローブ</td><td> CMA /マイクロダイアリシス</td><td> CMA-12-XXX </td><td>これらは中に特定のコードが示す各種膜の長さとカットオフでご利用いただけます &quot;XXX&quot;。 </td></tr><tr><td>ヒトインスリン（ヒュー） </td><td>イーライリリー</td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td>液体スイベル</td><td>インステック</td><td> 375/D/22QM </td><td>この特定のスイベルは、非常に低トルクと内部容積ならびにnonreaを持つctive石英ライニング。 </td></tr></tbody></table>

海馬のインスリンおよびマイクロインジェクション<emインビボ&gt;</em空間記憶テスト中&gt;マイクロダイアリシス

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

グルコース代謝には、2 - デオキシグルコースと機能的磁気共鳴画像法などの方法の基礎を形成し、局所神経活動のための有用なマーカーである。しかし、動物モデルでのそのような方法を使用します。麻酔を必要とし、それ故に両方が脳の状態を変化させ、行動措置を防ぎます。代替の方法は目を覚まし、気ままな動物におけるグルコース、乳酸、及び関連代謝産物の脳細胞外液濃度の連続測定を取るために生体内微小透析での使用です。特定の脳領域および/または急性薬理操作に依存するように設計タスクと組み合わせる場合は、この方法は特に有用であり、例えば、空間的ワーキングメモリタスク（自発的交替）時の海馬の測定値である乳酸の細胞外グルコースと立ち上がりで泳ぎを見せる強化された糖の1,2の挑発、そして海馬内インスリン投与は、メモリを向上させ、海馬グリコールを増加させ、両方のysis 3。インスリンなどの物質は、代謝物を測定するために使用されるのと同じマイクロダイアリシスプローブを介して海馬に送達することができる。海馬機能の尺度としての自発的交替の使用は、ストレスの多い動機（ 例えばフットショック）、拘束、またはタスクのパフォーマンスと代謝の両方を変更することができるすべては報酬（ 例えば食品）から任意の混同を避けるために設計されており、この作業も提供しています治療の非特異的な影響のための制御を可能にする運動活性の尺度。組み合わせることで、これらの方法は、行動を規制する神経化学的および代謝の変数の直接測定を可能にします。

ラットは手術から急速に回復し、麻酔の中止後30分以内に、アラート運動性とアクティブになっているはずです。手術がきれいに行われ、最小限の歯科用セメントが使用されている場合はカニューレのキャップの影響は最小限であるべきです。感染の兆候は、手術後の監視中に気づいた、またはラットは苦痛や不快感の兆候を示してどのような方法でもあり、すぐに実験を終了している場合、これは非常にまれであるはずです。試験前に処理中に、動物は、アラート自由に運動し、フレンドリーで好奇心旺盛であるべきである。よく取り扱う動物は、基本的に手術、手術後の回復、あるいは実験者の存在から残りの観察可能なストレスを持つべきではない;プラズマストレスホルモンを測定することにより必要に応じてこれを確認することができます（エピネフリン、グルココルチコイド）、および/ ​​またはグルコース2,4 、5。 脳ECFのグルコースは、範囲、典型的には0.5 - 1.5 mMの、脳の領域によって変化する、高い値であるが糖尿病動物で見られるかもしれません;海馬で、ベースラインのグルコース濃度は1.25 mMの6...

直接海馬内マイクロインジェクションによってhippocampally依存空間ワーキングメモリの変調は、同行と続く<em生体内で&gt;</em意識、行動、動物における代謝産物の&gt;マイクロダイアリ。

グルコース代謝は局所的な神経活動の有用なマーカーであり、2-デオキシグルコース法や機能的磁気共鳴画像法（fMRI）などの手法の基礎となっています。

本手順の目的は、行動試験中の海馬の代謝を測定することです。これは、十分に馴化させた動物にマイクロダイアリシス用ガイドカニューレを外科的に留置することで達成されます。試験当日にマイクロダイアリシスプローブをカニューレに挿入し、PERFUSE 8の流量を確認します。次に、動物をコントロールチャンバーに入れた状態で、プローブを平衡化させます。最終的に、グルコースオキシダーゼ、NADP、NADP-H反応およびフルオロメトリック分析などの適切な分析法を用います。試験期間中の代謝レベルや神経化学物質の放出を示すためにグルコース測定を用いる場合、この手法で最も困難な点の一つは、マイクロダイアリシスチューブの取り扱いに細心の注意が必要なことであり、注意を怠ると動物がラインを噛んだり、絡ませたりすることが頻繁にあります。私が行動試験中に海馬マイクロダイアリシスを初めて使用したのは大学院での研究のときでした。私たちは、既存のグルコース供給モデルが、グルコースによる記憶増強に関する既知の心理学的データと実際に整合しているかを確認したいと考えていました。この手法を用いることで、実際には脳に適用されていた既存のグルコースモデルが完全に誤っていたことを示すことができました。標準的な手術手順に従って動物を準備し、頭蓋骨を露出させ、カニューレ設置用の孔をドリルで開けます。あらかじめ決定した座標にカニューレを挿入し、ゆっくりと目的の深さまで下げます。正しく配置されたことを確認した後、歯科用セメントでカニューレを固定します。必要に応じて、滅菌済みの外科用縫合糸を用いて創傷を閉鎖します。最後に、カニューレの開通性を維持するためにスタイルを使用します。次に、マイクロダイアリシスに使用するPERFUSE eightを準備します。最適な結果を得るためには、正確な溶液組成が不可欠であることに留意してください。試験当日にbovine serum albumin BSAを添加し、完全に溶解させます。調製後、PERFUSE eightを0.2 micronフィルターでろ過してください。次に、調整したA ECFのアリコートを用いて、脳に投与する処置剤（ある場合）を調製します。ここでは、海馬への投与に向けてインスリンを調製しています。なお、新しいマイクロダイアリシスプローブとラインは、試験の前日に準備しておく必要があります。流入用と流出用の2本の独立したラインを作成します。2本の長さ1mのFEPチューブをPE 50チューブで接続し、ライン間のデッドスペースを最小限に抑えてください。PE 50コネクタへの挿入を容易にするため、チューブの端を図のように斜めにカットしてください。流入チューブを、滅菌ろ過済みの脱イオン水で満たした1 mLのHamiltonシリンジに接続し、もう一方の端にプローブを取り付けて、測定中に動物

hippocampal-insulin-microinjection-vivo-microdialysis-during-spatial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

出典:Provenzano, G., et al. Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity after Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders.J. Vis. Exp.

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インビボ マウス海馬におけるミクログリアの慢性二光子イメージング

学ぶ海馬のマイクロダイアリシスとマイクロインジェクションによる代謝測定法。行動課題中の神経化学変化をリアルタイムに解析し、空間作動記憶と代謝の関連を解明する技術です。

海馬のインスリンおよびマイクロインジェクション

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