海馬のインスリンおよびマイクロインジェクション

本手順の目的は、行動試験中の海馬の代謝を測定することです。これは、十分に馴化させた動物にマイクロダイアリシス用ガイドカニューレを外科的に留置することで達成されます。試験当日にマイクロダイアリシスプローブをカニューレに挿入し、PERFUSE 8の流量を確認します。

次に、動物をコントロールチャンバーに入れた状態で、プローブを平衡化させます。最終的に、グルコースオキシダーゼ、NADP、NADP-H反応およびフルオロメトリック分析などの適切な分析法を用います。試験期間中の代謝レベルや神経化学物質の放出を示すためにグルコース測定を用いる場合、この手法で最も困難な点の一つは、マイクロダイアリシスチューブの取り扱いに細心の注意が必要なことであり、注意を怠ると動物がラインを噛んだり、絡ませたりすることが頻繁にあります。

私が行動試験中に海馬マイクロダイアリシスを初めて使用したのは大学院での研究のときでした。私たちは、既存のグルコース供給モデルが、グルコースによる記憶増強に関する既知の心理学的データと実際に整合しているかを確認したいと考えていました。この手法を用いることで、実際には脳に適用されていた既存のグルコースモデルが完全に誤っていたことを示すことができました。

標準的な手術手順に従って動物を準備し、頭蓋骨を露出させ、カニューレ設置用の孔をドリルで開けます。あらかじめ決定した座標にカニューレを挿入し、ゆっくりと目的の深さまで下げます。正しく配置されたことを確認した後、歯科用セメントでカニューレを固定します。

必要に応じて、滅菌済みの外科用縫合糸を用いて創傷を閉鎖します。最後に、カニューレの開通性を維持するためにスタイルを使用します。次に、マイクロダイアリシスに使用するPERFUSE eightを準備します。

最適な結果を得るためには、正確な溶液組成が不可欠であることに留意してください。試験当日にbovine serum albumin BSAを添加し、完全に溶解させます。調製後、PERFUSE eightを0.2 micronフィルターでろ過してください。

次に、調整したA ECFのアリコートを用いて、脳に投与する処置剤（ある場合）を調製します。ここでは、海馬への投与に向けてインスリンを調製しています。なお、新しいマイクロダイアリシスプローブとラインは、試験の前日に準備しておく必要があります。

流入用と流出用の2本の独立したラインを作成します。2本の長さ1mのFEPチューブをPE 50チューブで接続し、ライン間のデッドスペースを最小限に抑えてください。PE 50コネクタへの挿入を容易にするため、チューブの端を図のように斜めにカットしてください。

流入チューブを、滅菌ろ過済みの脱イオン水で満たした1 mLのHamiltonシリンジに接続し、もう一方の端にプローブを取り付けて、測定中に動物が自由に動けるようにします。流入ラインと流出ラインを2チャンネルスイベルに接続します。次に、流出チューブをポンプに接続し、プローブの流出チューブから脱イオン水が出てくるまで、1.5 µL/minでポンプを作動させます。

ポンプの電源を切り、流出チューブとサンプル回収チューブの間にもう一方のラインを接続します。チューブに5 mLの液体を流し、プローブを滅菌脱イオン水を入れたバイアルに一晩浸し、プローブの先端が常に濡れた状態にあるようにします。テストの24時間前に、ダミースタイルレットを抜いて、この目的専用のマイクロダイアリシスプローブを挿入し、被験体をプレロ（pre-Roe）します。

その後10分間、ダミーをスタイルし直し、ラットをケージに戻します。あるいは、この段階で新しいプローブを使用し、測定まで取り出さずにそのまま留置します。翌日。

マイクロダイアリシスを実施する日に、フィルターろ過済みのA ECFをハミルトンシリンジとシンチレーションバイアルに充填し、ポンプを1時間平衡化させます。必要に応じて、調製した治療薬を2本目のハミルトンシリンジに充填し、シリンジポンプにセットします。この手順を成功させる鍵は、冷静さを保ち、動物を十分に馴化させることです。

したがって、冷静さを保ち、ゆっくりと正確に動作させ、何よりも練習を重ねてください。平衡化が完了したら、ダミースタイレットを抜き、平衡化したマイクロダイアリシスプローブをカニューレ経由でラットの脳内にゆっくりと挿入します。ラットを、飼育時の敷材が入った透明なプラスチックボックスに入れてください。

チューブのバランスを確実に調整してください。ケージ外のチューブに、水で満たした1.6 milliliterのマイクロ遠心チューブを、重力によってマイクロダイアリシスラインが折れ曲がらず、かつ張りすぎない状態で保持するように取り付けます。プローブとラットを2時間平衡化させてください。

この期間の開始時に、Perfuse eightのフローに閉塞がないことを確認してください。確認するには、一定期間にわたってPERFUSE eightの流出液を回収し、そのサンプルを計量して、サンプルの回収を開始する前に期待される容量がシステムから排出されていることを確認します。サンプルの透析と回収の相関関係が正確に算出されていることを確認してください。

ここでは、プローブと回収点の間で30 µLの容量があり、流速は1.5 µL/minです。サンプルが脳から流出して回収されるまでに20分のラグがあります。平衡化期間の後、ラットがホームチャンバー内で安静にしている間に、少なくとも3つのサンプルを回収します。

行動テスト前に測定値の安定したベースラインを確立するため、脳への投与タイミングを慎重に計画してください。シリンジの先端から動物の脳に挿入されるプローブまでの間に 30 µL の容量があるこのセットアップでは、投与液が海馬に到達させたい時間の 20 分前に、投与用シリンジを処置溶液に変更します。

流入ラインをコントロール用PERFUSE 8シリンジから取り外し、迅速に処理用PERFUSE 8シリンジに接続します。PERFUSE 8のフローが中断されないよう、この操作は5秒以内に完了させてください。適切なタイミングで効率が低下する原因となるため、気泡が混入しないように注意してください。

処置の実施後、ラットを任意に選択した行動試験装置へと慎重に移動させます。ここでは、前腕プラス型迷路を用いて自発的交互作用を測定します。動物に迷路内を20分間自由に探索させてください。

ビデオ録画または手書きによる記録を用いて、アームAriesのシーケンスとタイミングを記録し、サンプルを回収します。この期間中、流出チューブを新しい回収チューブに移動させてください。5分ごとに、チューブが自由に動くように保持します。

ラットの動きを妨げたり、動物の前で動いて気を散らしたりしないようにし、自身の動作がラットの行動に影響を与えないよう静止していなければなりません。テスト終了後、ラットを迷路から静かに取り出し、コントロールチャンバーに戻します。タスク遂行後の回復期間をカバーするため、その後少なくとも4サンプル分、マイクロダイアリシスのサンプル採取を継続してください。

目的のサンプルを回収した後、プローブを動物の頭部からゆっくりと抜き取り、保存バイアルに入れます。動物をホームケージに戻し、実験後の健康状態や行動に変化がないか注意深く観察してください。最後に、微生物の増殖を防ぐため、catho溶液の入ったシリンジに切り替えてチューブ内をフラッシュします。

この例は、タスクに関連した海馬ECFグルコースの低下を示しています。グレーのボックスは動物が迷路にいた時間を表しています。紫色の線は迷路テストを行わなかった動物の海馬グルコースを示し、赤色の線は前肢自発的交互行動タスクを行った動物を表しています。

オレンジ色の線は、本タスクのより簡易的な3アームバージョンを実施した動物における測定値を示しています。ここでは、インスリン投与後の海馬におけるグルコースおよび乳酸の変化が示されています。これらの変化は行動試験なしに観察されており、したがってベースライン条件下でのインスリン単独の影響を反映していることに留意してください。

この手順を行う際は、冷静さを保つことが非常に重要です。ラットは実験者のストレスを察知して興奮することがあり、そうなると手技が非常に困難になるだけでなく、結果に影響を及ぼす可能性があります。これらの手法を組み合わせることで、行動プロセスの正確な神経化学的調査が可能になります。

同様の手法は現在、ヒトの患者にも適用されています。例えば、てんかんの焦点特定のために電極を留置している患者において、代謝測定を可能にするためにマイクロダイアリシス・カニューレを留置させる場合があります。