Name: シーケンシャル神経筋接合部におけるシングルシュワン細胞の輪郭を描くのにフォトブリーチング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: 学ぶシーケンシャルフォトブリーチング法による神経筋接合部のシングルシュワン細胞可視化技術。GFP発現トランスジェニックマウスを用いて、個々の細胞形態を明らかにし、神経再生研究に応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

私たちは、優れた技術支援にマヌエラBudak、Ljiljana MarinkoviとクリスティーナWullimannに感謝したいと思います。我々は、PLP-GFPマウスを提供するためのW·マックリンに感謝します。アレクサンダー·フォン·フンボルト財団、国家助成機関（ &quot;エリーゼのためBundesministerium Bildung undのForschung&quot;により、TMはドイツ学術振興（Sonderforschungsbereich SFB 596 DFG）による高等研究所（ミュンヘン工科大学）によってサポートされています）ERA-Netのニューロン &quot;iPSoALS&quot;と &quot;2光子イメージング&quot;の枠インチTMとMBが統合蛋白質科学研究センター（ミュンヘン）によってサポートされています。 PMは、ミュンヘン工科大学（TUM-GS）の大学院によってサポートされていました。

1。オトガイ三角胸骨外植片（ 図1） タイミング：15分。 <ol><li>鉗子の2ペア、はさみの1ペア、春のはさみの1ペア、1組織培養皿（10センチ）：手術器具を準備します。 （15分間以上）事前バブリング冷却（4℃）を5％CO 2/95％O 2でリンゲル液。氷で15cmの組織培養皿を記入し、金属板とそれをカバーしています。解剖顕微鏡を準備し、解剖時に外植片を冷却するために、解剖用スコープの下に氷で15 cmの皿を置きます。 </li><li>致死量のイソフルラン過剰摂取（または犠牲の他の承認された方法）によって、マウスを麻酔。外植片の毛皮の汚染を防止するために、70％エタノールでマウスを吹き付けます。 SCは漂白のために、我々は軸索の同時可視化のためTHY1-OFP3またはTHY1-Membow13には交雑可能PLP-GFPマウスを使用していました。 </li><li>大きなはさみのペアを使用して、の正中切開を作る胸骨と肋骨の下縁に平行な2つの切開の上の皮膚。 </li><li>大きなはさみのペアを使用すると、皮膚を除去腹壁を開き、脊柱に戻ってすべての道を胸郭に切開が平行する。その後、胸骨の筋肉の挿入に近い切開を行うことで、胸筋を切っ解剖。 </li><li>ただ剣状軟骨下オープン横隔膜をカットし、その沿岸に沿って挿入ダイアフラムをオフに解剖する。 </li><li>鉗子のセットと剣状突起によって胸郭を保持し、できるだけ近い彼らの挿入を可能な限り、脊柱から肋骨を切断開始。左と右のカットは胸骨柄に向かって心臓より収束する必要があります。主要な血管（特に鎖骨下静脈）切断避けるようにしてください。優れた視認性を鉗子で剣状突起上に保持しながら優しく準備を持ち上げることによって達成されます。 </li><li>ちょうど胸骨柄下に横カットを行うそして冷却した5％CO 2/95％O 2バブリングリンゲル液と10cmの皿に植片を移す。氷で満たされた15cmの組織培養皿を覆う金属板の上に10cmの皿を置きます。すべてのさらなるステップは、解剖顕微鏡下で行われるべきである。 </li><li>小さ ​​な春のはさみを使用すると、胸腺、胸膜、横隔膜（内側）と胸筋（; 図1B-Dの外側）の残骸を削除。 </li><li> 3.5 cmのシャーレに植に合わせて、胸骨に挿入しないで全てのリブをオフに解剖する。これは、最高の小さな春のはさみを使用して、肋骨（ 図1E）の間に組織を切断する実行されます。 </li><li> minutienピンを使用して、シルガードコーティングされた3.5 cmの組織培養皿（; 図1G &lt;4ミリメートルに短縮）にオトガイ三角胸骨神経筋外植片をピン。 2つのピンは、胸骨の軟骨（白）部分を介して行く必要があります。両方の目の左側と右側の肋骨を介して、少なくとも2つのピンを挿入しますeの外植片は、柔らかい軟骨部分を狙ってと下の肋骨を回避またはオトガイ三角筋の近隣にあります。以上のピンが使用されている、より良い（我々は一般的に8月10日を使用します）。あなたが準備を突き止めるように、わずかに伸ばした位置に筋肉を固定し、リブがやや広がっていることを確認してください。 </li><li> オプション：Alexa色素（5％CO 2/95％O 2バブリングリンゲル液では0.8μg/ mlの濃度）に結合ブンガロトキシンを追加することにより、アセチルコリン受容体を含有するシナプス部位を視覚化します。室温で15〜20分間シルガードコーティングされた皿の中で固定された外植片を培養するには、次いで、5％CO 2/95％O 2バブリングリンゲル液で数回洗浄する。 </li></ol> 2。漂白SCとオプションタイムラプス顕微鏡（ 図2） タイミング：30から45分+オプション1 - 経過時間は5時間。 <ol><li>共焦点顕微鏡装備ウィットへの転送3.5-CMシルガードコーティングされた料理をhのアルゴンレーザー（488nmの波長）と水浸対物レンズ（4倍、0.13 NA; 20倍、0.5のNAと100倍、1.0 NAまたは60倍、0.9 NA）。 </li><li> タイムラプス顕微鏡用オプション ：インサート加熱リングに3.5 cmのシルガードコーティングされた皿、灌流システムおよび温度プローブ（ 図2A）をインストールします 。それらのどれもが植、皿またはシルガードコーティングのリムに触れないことを確認します。 ℃、33から35に試料を加熱細胞は漂白ステップ間の少ないダイナミクスを示すようにSCは時間経過せずに漂白するため、室温では、優れています。 </li><li> 4倍の空気を目的とオトガイ三角胸骨筋の神経支配のパターンを観察し、オトガイ三角胸骨終板帯を見つける。 20Xディッピングコーン客観的に切り替えて、終板帯（領域を覆うリブは良い候補である）内の表在領域を探し始める。個々NMJsをチェックするために100倍以上60倍ディッピングコーン目標に目的を変更します。理想的には、いくつかのSCで覆われていると非常にsuperfic位置していますNMJですially（ 図2B）。あなたが漂白後タイムラプスイメージングを実行する場合は、相対的に収量を増やすために一緒に閉じている3 NMJsまで選択。 </li><li>光退色、個々のSC（ 図2B）の前に、NMJの共焦点画像を取得する。 （フル分解能イメージング、オリンパスFV1000顕微鏡上などでは、100倍、1.0 NA対物およびピクセルあたり〜0.1μmのナイキスト限られたサンプリングをもたらす2.5ズームを使用しています。） </li><li> &quot;パーク&quot;集中5秒（あるいはそのようなオリンパスの顕微鏡の &quot;竜巻スキャン&quot;機能として使用することができます興味のある小さな領域での効率的なスキャンパターンのために最大限の電力を使用して、SCの核に488 nmのレーザービーム;我々は共焦点顕微鏡を使用するように、レーザーは1.0のNAを目的とし、488nmで、故に画像共役面に焦点を当てたとされる、直径&lt;0.5μm）である。セルと裁判官漂白結果に再フォーカス。 GFPのレベルが削減されるまで、必要に応じて繰り返し、再びステップを漂白する場合近いバックグラウンドレベルにd。 （ 図2C）漂白後の画像を取得する。それは漂白地域は、2つのセルのオーバラップの外側にあることを確認することが重要である - オーバーラップがある場合、2番目のセルに漂白することは明らかであろう。 </li><li>すべてが1つのSCが（ 図2D-E）が漂白されるまで、上記の手順を繰り返します。最後の &quot;無漂白&quot; SCは、共焦点タイムラプス顕微鏡観察に適しています。画像の減算により単一細胞を再構築する、 例えば 、単一のSC形態および領土（ 図2F）を記述するために、Photoshopソフトウェアを使用しています。 2メイジを減算すると、ノイズ（Photoshopでの連続した&quot;層&quot;でインポートしてから、チャンネルタブの上部にあるドロップダウンメニューで&quot; 差 &quot;を最チャンネルを設定することによって、 例えば ）が追加されますので注意してください。これは減算前のチャンネルで&quot; 輪郭以外をぼかす &quot;機能を使用して、明らかに由来しない任意のバックグラウンドを離れてトリミングすることによって回避できます漂白された細胞。コントラストを最適化するためには、 &quot; レベル &quot;ウィンドウには2つのチャンネルの明るさを調整する必要がある場合があります。漂白された細胞の結果のイメージは、シナプスの元の画像に重畳ユニーク色相の擬似色とすべての漂白、最後にこれをやってから元の画像（漂白におけるセルの領域を着色するために透明になります、無漂白の細胞図2F結果に示された画像）。 </li><li> オプション：すべてが1つのSCを漂白した後、共焦点タイムラプス顕微鏡スタート。一定の間隔（例えば、5〜10分）で画像を取る。できるだけ少ないレーザーパワーとして使用します。最大3 NMJsは、同じセッションで撮像することができる。 </li><li>その後、ズームなしで100倍で20倍、4倍の目標を（ 図2G-I）を用いて地域の画像を画像を撮影して、時間経過NMJsの地図を作る。この &quot;地図&quot;は、固定筋の免疫組織化学に続くNMJsを見つけるために必要とされる。 </li><li>イメージ用処理、最大強度の予測に個々の画像を変換してTIFF形式で保存します。スタックにすべてのz投影された時間のポイントを組み合わせるとxyに合わせ、 例えばフィジーの&quot;stackreg&quot;プラグイン10（オープンソースソフトウェアImageJのに基づいて、パッケージ、国立衛生研究所）を用いて行った。 </li></ol> 3。固定および免疫組織化学（ 図3） タイミング：宿泊。 <ol><li>慎重にピンを除去することにより、少なくとも15ミリリットル4％PFAを含む50mlの反応管に外植片を転送します。氷上で1時間オトガイ三角胸骨筋を含む前胸壁をポストフィックス。少なくとも10分間PBS中の0.1 Mグリシン（残留固定液を急冷し、それ故にバックグラウンドを減らすため）で固定した組織を洗浄します。サンプルはこの時点で保存され、後で処理することができます。 </li><li> 0.01MのPBSで満たされた10cmのシルガードコート組織培養皿に固定された外植片を転送します。 1 Siと台形形状を切り出す胸骨、骨と軟骨の遷移を介して他のデパラレル - これは、その表面上にオトガイ三角筋を含んでいます。水平方向（ すなわちトランス胸骨）オトガイ三角筋の尾側端は自由にアクセスできるようにカットして下部肋骨を取り外します（ 図3A-D）。 </li><li>台形の上部（ 図3E）にピンとして皮下注射針を挿入します。優しく筋肉の尾コーナーに保持し、マイクロメスと針を用いて表面にオトガイ三角筋を削除するには、1mlシリンジと鉗子に添付皮下注射針を使用します。カットは胸壁の面に平行に作られていることを確認してください。筋肉の尾の部分がリリースされたら、胸壁を通して筋肉以下のピンのような別の皮下注射針を挿入します-これは準備を固定し、鉗子（ 図3F）を使用して筋肉に優しいプルを発揮することができます。あなたは、コネTISSを切っているように、UEの挿入、 &quot;ピール&quot;離れて胸部の筋肉。春のはさみで最後尾添付ファイルをカットします。ピンセットを用いて、脂肪や血管の残骸を削除。神経を離れてリッピングしないように注意してください注：ライブと固定された組織で作業するためのツールや食器のセットを別々に使用してください。 </li><li>室温でシェーカーで1時間ブロッキング溶液中に組織サンプルを転送することによって、免疫組織化学（標準のプロトコルを使用して）を起動します。染色のための可能な限り最小の容積は、96ウェルプレートを用いて200μlです。 </li><li> 4℃で一晩ブロッキング溶液を1ウェルあたり200μlの、°シェーカー上でCで希釈した一次抗体を適用します。 </li><li> 0.01MのPBS中で10分間、3回洗浄します。 </li><li>ブロッキング溶液で希釈し、室温で1〜2時間に適した二次抗体を適用します。 </li><li> 0.01MのPBS中で10分間、3回洗浄します。 </li><li>退色防止媒体（ 例えば Vectashield）とカバースリップでマウントします。 </li><li>磁性金属板の上に置いてスライド上に場所の磁石4℃で数時間または一晩のために平らにするために、サンプルのマニキュアでシール。 </li></ol>

<ol><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolipid+promoter+activity+distinguishes+two+populations+of+NG2-positive+cells+throughout+neonatal+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development.</a> J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).</li>
<li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li>
<li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li>
<li>Thompson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+with+photoswitchable+GFP+in+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells.</a> Society for Neuroscience. Program 241, (2008).</li>
<li>Williams, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+development+of+outer+retinal+synapses+in+the+absence+of+glial+contact%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact.</a> J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).</li>
<li>Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+imaging+of+motor+axon+dynamics+in+murine+triangularis+sterni+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants.</a> Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).</li>
<li>McArdle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+the+triangularis+sterni+muscle+of+the+mouse+for+investigations+of+synaptic+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena.</a> J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).</li>
<li>Marinkovi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).</li>
<li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li>
<li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+expressed+in+mouse+transgenic+lines+mark+subsets+of+glia%2C+neurons%2C+macrophages%2C+and+dendritic+cells+for+vital+examination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination.</a> J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

ここに提示され、SC漂白方法は、簡単で高速かつ汎用性があります：（i）はそれは、単一の導入遺伝子をもとに共焦点顕微鏡によって、単一のSC形態とダイナミクスを明らかにすることができます-追加の対立を必要とする疾患モデルとアプローチなどを組み合わせたときに重要な利点である。解剖から固定には半日で行うことができるように（ii）の方法は、迅速である。それはこのような細胞切除、イメージング小器官、電気生理学や免疫組織化学などの他の方法と組み合わせることができますように（ⅲ）出願件数は、広いです。さらに、ネズミNMJsでSCにここに提示されたアプローチは、他の細胞、組織、または種に一般化することができる - ゼブラフィッシュにおける関連技術の応用の一例は、参考文献6に示されている。また、GFP以外の蛍光タンパク質は、例えばYFP又はCFPのために、漂白とタイムラプス顕微鏡に使用することができます。我々は、SCS、bleachiでこれらの蛍光タンパク質を使用していないものの軸索のngは、この設定ではあまり安定した蛍光タンパク質（ 例えば CFP）が有利で ​​あることを示しています。しかし、漂白効...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社（例） </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> 70％（vol / vol）のエタノール溶液</td><td>ロート</td><td> T913.1 </td><td>スプレーボトルで</td></tr><tr><td>イソフルレン</td><td> Forene、アボット</td><td></td><td>他の承認された麻酔薬を致死量の麻酔に使用することができます</td></tr><tr><td>トランスジェニックマウス（PLP-GFP） </td><td></td><td></td><td>引用した情報源から得られる</td></tr><tr><td>冷光照明を用いた解剖顕微鏡</td><td>オリンパスSZ51 </td><td></td><td> Schott社KL 1500液晶搭載</td></tr><tr><td>鉗子＃2 </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11233から20 </td><td></td></tr><tr><td>鉗子＃5 </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11295から00 </td><td></td></tr><tr><td>はさみ、大規模な医療</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 14108から09 </td><td></td></tr><tr><td>はさみ、小さな角度の春</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 15033から09 </td><td></td></tr><tr><td>インラインヒーター</td><td>ワーナー·インスツルメンツ</td><td> SF-28 </td><td></td></tr><tr><td> 3.5 cmの皿のために加熱リング</td><td>ワーナー·インスツルメンツ</td><td> 64から0110のDH-35 </td><td></td></tr><tr><td> 2チャネルの温度制御システム</td><td>ワーナー·インスツルメンツ</td><td> TC-344B </td><td></td&gt; </tr><tr><td>灌流ポンプシステム</td><td></td><td></td><td>特注の</td></tr><tr><td> 15cmの組織培養皿</td><td>ザルスタット</td><td> 83.1803.003 </td><td>氷で満たされて、金属板で覆われて</td></tr><tr><td> 10cmの組織培養皿</td><td>ザルスタット</td><td> 83.1802.003 </td><td>酸素化リンゲル液と</td></tr><tr><td> 3.5 cmの組織培養皿</td><td>ザルスタット</td><td> 83.1800.003 </td><td>シルガードポリマーを充填</td></tr><tr><td>シルガードポリマー</td><td>ダウコーニング</td><td>シルガード184シリコーンエラストマーキット</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> FV1000 </td><td>アルゴンレーザーと</td></tr><tr><td> 50mlの反応管</td><td>ザルスタット</td><td> 62.547.254 PP </td><td></td></tr><tr><td> PBS中4％PFA </td><td>シグマ</td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td>カニューレ0.5ミリメートルX 25ミリメートル</td><td> Neolab </td><td> E-1510 </td><td></td></tr><tr><td>注射器1ミリリットル</td><td> Neolab </td><td> E-1496 </td><td></td></tr><tr><td>シナプトフィジン抗体</td><td>インビトロジェン</td><td> 18から0130 </td><td>ウサギ</td></tr><tr><td>二次抗体</td><td>インビトロジェン</td><td> - 11012 </td><td>アレクサ594 </td></tr><tr><td> 24ウェルプレート</td><td>ザルスタット</td><td> 83.1836 </td><td></td></tr><tr><td> 0.01MのPBS </td><td>シグマ</td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> PBS中の0.1 Mグリシン</td><td>ロート</td><td> 3790.1 </td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td> Neolab </td><td> E-4132 </td><td></td></tr><tr><td>スライド</td><td> Neolab </td><td> E-4121 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td>ベクトルラボ</td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> minutienピン×10 </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 26002から20 </td><td> &lt;4 mmに短縮</td></tr><tr><td> α-ブンガロトキシンアレクサ594に結合された</td><td> Invitrogen社（Molecular Probes社） </td><td> B-13423 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ブロッキング溶液 </td></tr><tr><td> 0。01 M PBS </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.2％トリトン-X100 </td><td>ロート</td><td> 3051.3 </td><td></td></tr><tr><td> 10％正常ヤギ血清</td><td>アブカム</td><td> ab7481 </td><td></td></tr><tr><td> 1％ウシ血清アルブミン</td><td>シグマ</td><td> A7030 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> リンガー 95％O 2/5％CO 2でバブリング</td></tr><tr><td> 125 mMのNaCl </td><td>シグマ</td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> 2.5mMのKClを</td><td>シグマ</td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> 1.25mMののNaH 2 PO 4 </td><td>シグマ</td><td> S8282 </td><td></td></tr><tr><td> 26 MMのNaHCO 3 </td><td>シグマ</td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> 2mMのCaCl 2 </td><td>シグマ</td><td> 21114 </td><td></td></tr><tr><td> 1mMのMgCl 2 </td><td>シグマ</td><td> 63020 </td><td></td></tr><tr><td> 20mMグルコース</td><td>シグマ</td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表1に特異的な試薬や機器。 </td></tr></tbody></table>

シーケンシャル神経筋接合部におけるシングルシュワン細胞の輪郭を描くのにフォトブリーチング

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

光退色シーケンシャルNMJで個々のSCにラベルを非侵襲的な方法を提供します。 NMJは、哺乳動物の中枢神経系の最大のシナプスで、シナプスの構造と機能を研究するためのモデルを導く務めている。マウスNMJsモーター軸索末端の筋肉の繊維とプレッツェル状の接触部位を形成する。モーター軸索とその端子は、SCSによって覆われている。過去数十年にわたって、いくつかのトランスジェニックマウスは、それぞれTHY1-XFP 1、PLP-GFPマウス2例えば、運動ニューロンおよびSCを可視化するために生成されています。 運動軸索に沿って、軸索のミエリンSCは跳躍活動電位の伝播を可能にするために、ランヴィエ絞輪で区切られた、非重複節間に配置されている。これとは対照的に、シナプスの端末SCは監視と神経伝達を促進し、破片やガイド再生軸索を消化する特殊なグリア細胞である。 NMJsはしっかり半ダース非myelまでで覆われているターミナルSCをinating -彼らが直接膜接触3にあるように、これらは、しかし、個々に、光学顕微鏡では解決できません。 いくつかのアプローチは、個別の端末SCを可視化するために存在しています。これらのどれとはいえ、完璧なありません。例えば、単一の細胞が色素充填微小電極で突き刺さアール染料充填は、2つ目を充填する前に標識した細胞を破壊する必要があります。これにより、その後の時間経過の録音3と互換性がありません。 SCのマルチスペクトル&quot;Brainbow&quot;標識は、蛍光タンパク質の組み合わせ式4を使用することによって達成されてきた。しかし、この手法にはいくつかの導入遺伝子を組み合わせることが必要であり、使用されるプロモーターの発現パターンによって制限されます。将来的には、SCの中で&quot;光切替可能な&quot;タンパク質の発現は、さらに別の代替5かもしれない。ここでは、順次、光退色単一の細胞が漂白されている場所、および減算によって得られたそれらのイメージを提示する。我々は信じているこのアプローチという-その使いやすさと汎用性に起因する-それがインビボで使用され、他の細胞型、解剖学的部位や種6に転送することができ、特にとして、神経科学者の技術パレットに恒久加算を表しています。 オトガイ三角胸骨筋の外植片で端末のSCに、以下のプロトコルでは、我々は詳細漂白シーケンシャルおよびその後の共焦点タイムラプス顕微鏡法の適用を。これは、薄い表面的で簡単に解剖神経筋標本7,8 NMJ開発学、生理学、病理学9の研究のために有用であることが証明されました。最後に、我々はオトガイ三角胸骨筋が相関の高分解能共焦点イメージング、免疫組織化学や超微細構造検査を実行するために固定した後に準備される方法を説明します。

イメージング皿の準備オトガイ三角胸骨植片の例を図1Gに示されている。オトガイ三角筋は筋線維のいくつかの層からのみ構成されていますので、この外植片は、イメージングNMJs エクスビボのために特に適している。これは、いずれかのSC（PLP-GFPの2）および/ ​​または軸索（THY1-XFP 1）を強調するトランスジェニックマウス系統由来の外植片から高解像度の画像を得ることができる。高品質のイメージングのための重要な要因には、（i）筋線維の損傷を防止するための植準備中にオトガイ三角筋に触れて回避する、（ii）（&gt; 37（ⅲ）過熱していないサンプル、深さに関連した収差を低減する表面的で平らなシナプスを選択注意深くサンプルを触れないように灌流チューブおよび温度プローブを配置する（V）だけでなく、K;°C）とサンプルがよく酸素を維持し、（iv）は、潜在的にドリフトや振動を低減するために撮像中に灌流を停止ドリフトを防ぐために乾燥した皿の裏側をeeping、（vi）のコントラストを最大にするために、オフターゲット...

このような神経筋接合部（NMJs）で端末シュワン細胞（SCS）と密集した組織内の個々の細胞を可視化に挑戦している。 &quot;シーケンシャル光退色&quot;漂白シーケンシャルはタイムラプスイメージングと組み合わせることができますオトガイ三角胸骨筋の外植片、便利な神経筋標本において、例えば、単一のターミナルSCを、輪郭を描くことができ、<em&gt;事後</em&gt;免疫染色。

逐次的な光退色により、神経筋接合部（NMJ）における個々のシュワン細胞（SC）を非侵襲的に標識することが可能になります。NMJは、哺乳類の神経系において最大のシナプスであり...

本実験の目的は、共焦点顕微鏡を用いて神経筋接合部における個々のシュワン細胞を詳細に描出することである。本プロトコルでは、終末シュワン細胞および軸索シュワン細胞にGFPを発現するトランスジェニックマウスを使用する。最初のステップは、神経・筋肉外植物を摘出することである。次に、特定の神経筋接合部において、1つのシュワン細胞を除くすべての細胞の連続的な脱色を行い、単一細胞の形態を明らかにします。最後に、低倍率のマップを作成します。組織を固定し、免疫組織化学染色を行うことで、残っている脱色されていないシュワン細胞との位置関係において、任意のマーカーを可視化します。結果として、単一細胞の形態、および必要に応じてタイムラプス顕微鏡観察や、共焦点イメージングに基づく固定組織内の免疫組織化学的共局在解析が得られます。この手法は、神経筋接合部における単一のスワン細胞の形態や領域に関する知見を提供できるだけでなく、細胞株や生存脳切片、さらにはゼブラフィッシュなどの他種などの他のシステムにも適用可能です。一般的に、この手法に慣れていない方は、十分な浅層にある神経筋接合部を特定し、労力に見合わない構造に時間を費やさないようにするまでに経験が必要となるため、苦労することがあります。手術を開始する前に、リンガー液を少なくとも15分間酸素化し、冷却してください。氷を入れた15 centimeterの組織培養皿を顕微鏡下に配置します。その上を金属プレートで覆います。リンガー液を満たした10 centimeterの組織培養ディッシュを金属プレートの上に置きます。酸素供給用ストーンを溶液の中に入れます。次のステップでは、シュワン細胞と軸索が異なる色で標識されたマウスを選択します。マウスを安楽死させた後、エタノールをスプレーします。被毛による汚染を防ぐため、大きなハサミを用いて、胸骨上の正中線および肋骨弓の下端に平行に2本の切開線を入れます。皮膚を取り除いて腹部を開き、胸骨の筋肉付着部付近を切開して大胸筋を剥離します。ピンセットで剣状突起軟骨を固定し、剣状突起軟骨の直下で横隔膜を切開します。肋骨の付着部に沿って横隔膜を切り出します。ピンセットで剣状突起を持って肋骨を固定し、組織が乾燥しないよう、適宜リンガー液で湿らせてください。椎骨に可能な限り近い位置から肋骨を切り離し始めます。左右の切開線は、心臓の上方で胸骨柄に向かって収束させるようにしてください。主要な血管、特に鎖骨下静脈を切断しないよう注意します。視認性を高めるためです。鉗子で剣状突起を保持しながら、標本をそっと持ち上げます。次に、胸骨柄のすぐ下を横方向に切断して胸部を取り除き、準備したリンゲル液が入った10 centimeterディッシュに標本を移します。ディッシュを金属プレート上に置き、さらに氷を満たしたディッシュと共に顕微鏡下に設置します。小型のスプリングシザーを用いて、胸腺、胸膜、横隔膜、および胸筋の残渣を除去します。小型のスプリングシザーを用いて、胸骨に挿入されていないすべての肋骨を切り離します。肋骨間の組織を切断します。これにより、X explanを3.5 centimeterのSILガードコーティング皿に適合させることができます。次に、短くしたminuchinピンを8本から10本使い、ここに示した三角形の胸眼筋を避けてX explanを固定します。2本のピンを胸骨の軟骨部分に、さらに2本のピンを肋骨間のより柔らかい軟骨部分に刺してください。三角筋の下またはその付近にある肋骨を穿刺しないように注意してください。肋骨がある程度広がるまでピン留めを続けます。これにより、筋肉をわずかに伸展させた状態で固定します。3.5 centimeterのシルガードコーティング済みディッシュを、Argonneレーザーと水浸対物レンズを備えた共焦点顕微鏡に転送します。タイムラプス顕微鏡観察を行う場合は、3.5 centimeterのシルガードコーティング済みディッシュをヒーティングリングに挿入します。スーパーフュージョンシステムを設置し、温度プローブを取り付けます。explan、ディッシュの縁、またはシガーコーティングに何も触れないようにしてください。タイムラプス顕微鏡観察の場合はX explanを加熱しますが、シュワン細胞の漂白には室温の方が適しています。次に、Forex air objectiveを用いて、三角 stern eye 筋の神経支配パターンを観察し、三角 stern eye 終板帯を確認します。20倍の浸漬コーン対物レンズに切り替え、nplateバンド領域内の表層部位を探します。肋骨の上方や肋間神経の近傍が良好な候補領域となります。100倍または60倍の浸漬コーン対物レンズに切り替え、個々の細胞およびmjsを確認します。理想的には、いくつかのシュワン細胞に覆われ、非常に浅い部位に位置する神経筋接合部（NMJ）を選定してください。本プロトコルの成功において極めて重要なのは、浅い位置にある平坦な神経筋接合部を見つけることです。神経筋接合部は円筒状の筋線維を支配しているため、線維に巻き付く傾向があり、イメージングに最適な角度が得られないことが多々あります。浅く平坦で、表面に位置する神経筋接合部のみを選択してください。ここで、100倍・開口数（NA）1.0の対物レンズを使用します。2.5倍のズームで、NMJの共焦点像を撮影します。これらの設定により、ピクセルサイズは約0.1 micrometersとなり、ナイキスト基準に従った適切な空間サンプリングが確保されます。次に、488 nanometerのレーザービームを最大出力で5秒間、核の中心に照射し、シュワン細胞を光退色させます。次に、細胞に再度焦点を合わせ、退色結果を確認します。必要に応じて、GFPレベルが背景レベル付近まで低下するまで退色ステップを繰り返し、その後、別の画像を取得します。退色領域が2つの細胞の重複部分の外側にあることを確認することが極めて重要です。重複がある場合、2番目の細胞の脱色によりそれが明らかになります。適切に行えば、この手法によって最終的な細胞が鮮明に描き出され、処置を始める前には予想だにしない驚くべき形態が見られることがよくあります。シュワン細胞のうち1つを残してすべてが脱色されるまで、脱色プロセスを繰り返します。最後に漂白しなかったシュワン細胞は、共焦点タイムラプス顕微鏡観察に適しています。タイムラプスイメージングの完了後、ズームなしの100倍で画像を撮影し、次に20倍対物レンズを用いてその領域の画像を撮影し、さらに4倍対物レンズを用いて同様の操作を繰り返すことで、これらのnjのマップを作成します。このマップは、固定した筋肉の免疫組織化学染色の後にnjを特定するために必要です。イメージングと漂白後、説明（explan）をピンから外し、少なくとも 15 mL の 4% PFA が入った 50 mL チューブに移します。次に、チューブを氷上で 1 時間静置し、組織を 1 時間冷却した後、PBS で調製した 0.1 M glycine で 10 分以上洗浄します。その後、固定した説明を 0.01 M PBS で満たした 5 cm シルガードコート組織培養皿に移し、さらなる説明の切り出し準備を行います。まず、片側を胸骨に平行にし、もう一方を骨から軟骨への移行部を通るようにして、台形に切り出します。この表面には三角筋が含まれています。次に、水平方向または経胸骨的に切開して下部肋骨を取り除き、三角筋の尾側端に自由にアクセスできるようにします。次に、下垂体針をピンとして台形筋の上部に挿入します。続いて、三角筋を除去します。まず、ピンセットを用いて筋肉の隅をそっと保持してください。次に、注射器と針をマイクロメスのように使い、胸壁の平面に平行に切断します。筋肉の側面の固定が解除されたら、別の針を胸壁を通して筋肉の下に挿入し、標本を固定します。結合組織の付着部を切断しながら、ピンセットで優しく牽引して、胸部から筋肉を剥離させます。最後に、ピンセットを用いて脂肪や血管の残渣を除去します。この際、神経をちぎらないように注意してください。これで、三角筋を免疫組織化学染色に使用できる状態に準備できました。シュワン細胞をex vivoで可視化するため、PLPプロモーターの下でGFPを発現するマウスを用いて、三角形の後眼の説明が準備されました。P-L-P-G-F-Pを3匹のマウスの太ももに交配させることで、軸索を同時に可視化することができました。記述されたプロトコルを用い、隣接する2つの末端シュワン細胞と最初の軸索シュワン細胞を生状態で漂白することにより、単一の末端シュワン細胞の形態が驚くほど詳細に明らかになりました。イメージングした神経筋接合部は、あらかじめ作成したマップを用いて追跡され、生細胞共焦点顕微鏡観察後、固定組織において高解像度でスキャンされました。三角形の胸板（stern explan）を固定し、染色しました。ここでは、Alexa 647を結合させたbungalow toinで赤色に標識したアセチルコリン受容体と、抗synaptophysin抗体で白色に標識したシナプス小胞を示しています。このビデオを視聴することで、当初はすべて同じ蛍光タンパク質で標識され、個別に識別するには密度が高すぎた単一細胞の形態を視覚化する方法について、十分に理解できるはずです。本例では神経筋接合部を示していますが、他にも多くの潜在的な応用先があります。

sequential-photo-bleaching-to-delineate-single-schwann-cells-at

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

アクセス可能なシナプスの電気生理学のアプリケーションでは、シナプス変異体の分析に有用なシナプス活性の定量的な尺度を提供しています。この記事では、神経筋接合部（NMJ）のを公開するために使用される解剖の方法を説明します...

解離性とC. elegansの神経筋接合部から録音する

で、アクティブなゾーンの解剖とイメージングショウジョウバエ神経筋接合部

出典: Marinello, M., et al.共焦点顕微鏡と超解像顕微鏡の組合せによるマウスの神経筋接合部の特性評価J. Vis.

共焦点顕微鏡と超解像顕微鏡の組み合わせによるマウスの神経筋接合部の特性評価

四次元（4D）画像化は、脊椎動物の神経末端を生体内エンドソームの2種類のうちの挙動および相互作用を研究するために利用される。これらの小さな構造の移動は、例えばエンドソーム融合およびエキソサイトーシスなどのイベントの確認を可能にする、三次元を特徴としている。...

4次元蛍光イメージングと住んでいる神経末端におけるエンドソームダイナミクスの可視化

神経筋接合部(NMJ)は、シナプス不全に至ることもあるさまざまな条件で変化します。本稿では、このような構造変化を定量化するための蛍光顕微鏡法について述べる。...

神経筋接合部：測定シナプスサイズ、断片化および共焦点蛍光顕微鏡を用いてシナプスタンパク質の密度の変化

ここでは、3齢幼虫の神経筋接合部（NMJ）における運動ニューロンの神経変性を視覚化および定量化するために、 ショウジョウバエ幼虫における分節神経を傷つける簡単かつ広くアクセス可能な方法について説明する。...

研究のための単純な神経細胞学的損傷法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;運動ニューロン変性

本稿で説明されたプロトコルは、神経筋接合部で自然を記録するマウス挙オーリス長(ラル) 筋とシナプス後電位の神経誘発 (電流クランプ) と電流 (電圧クランプ)...

オーリスの挙筋哺乳類の神経筋伝達電圧クランプ条件下での試験のための準備

神経筋接合成分を正確に検出する能力は、病理学的または発達的プロセスのために、そのアーキテクチャの変更を評価する上で非常に重要です。ここでは、定量的測定を行うために使用できる全マウント神経筋接合部の高品質画像を得るための簡単な方法の完全な説明を提示する。...

全山神経筋接合部の免疫蛍光解析と形態測定解析のための単一骨格筋線維の解剖

このプロトコルは、SMAおよびColQ関連のCMSのマウスモデルの病理学的変化を定量化するために使用される共焦点顕微鏡とSTED顕微鏡の組み合わせによる神経筋接合部の形態測定分析の方法を説明しています。...

共焦点顕微鏡と超解像顕微鏡の組み合わせによるマウスの神経筋接合部のキャラクタリゼーション

このプロトコールは、異なるバイオマーカー、すなわち、ニューロフィラメント200、小胞アセチルコリントランスポーター、α-バンガロトキシン、およびS100を有する蛍光免疫組織化学を用いて、ラット内側腓腹筋におけるシナプス前末端、シナプス後部受容体、およびシナプス周囲シュワン細胞間の空間的相関を調べる方法を示す。...

ラット内側腓腹筋における神経筋接合部の形態学的特徴の可視化

ここでは、神経筋接合部と筋細胞の微小管ネットワークを可視化するための詳細なプロトコルを紹介します。ショウ...

ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部と筋細胞を用いた微小管ネットワークの可視化

学ぶシーケンシャルフォトブリーチング法による神経筋接合部のシングルシュワン細胞可視化技術。GFP発現トランスジェニックマウスを用いて、個々の細胞形態を明らかにし、神経再生研究に応用可能です。

シーケンシャル神経筋接合部におけるシングルシュワン細胞の輪郭を描くのにフォトブリーチング

さらに動画を探す