シーケンシャル神経筋接合部におけるシングルシュワン細胞の輪郭を描くのにフォトブリーチング

次の実験の全体的な目標は、共焦点顕微鏡法を使用して神経筋接合部の単一シュワン細胞を描写することです。このプロトコルは、末端および軸索シュワン細胞でGFPを発現するトランスジェニックマウスを使用します。最初のステップは、神経筋の説明を解剖することです。

次に、所与の神経筋接合部における1つを除くすべてのシュワン細胞の逐次漂白が行われ、単一細胞の形態が明らかになる。最後に、低電力マップが作成されます。組織は固定され、免疫組織化学に使用され、残りの未漂白シュワン細胞に関連して任意の所望のマーカーを視覚化します。

結果は、単一細胞の形態と、必要に応じて、共焦点イメージングに基づく固定組織でのタイムラプス顕微鏡法または免疫組織化学的共局在分析を示しています。しかし、この方法は、神経筋接合部における単一の白鳥細胞の形態と領域についての洞察を提供することができます。また、細胞株、生きた脳スライス、さらにはゼブラフィッシュなどの他の種などの他のシステムにも適用できます。

一般的に、この方法に不慣れな人は、十分に表面的な神経筋接合部を特定し、努力に見合わない構造に時間を無駄にしないためにある程度の経験が必要なため、苦労するでしょう手術を開始する前に、リンガー溶液を少なくとも15分間酸素化して冷却します。氷を入れた15cmの組織培養皿を顕微鏡下に置きます。金属板で覆います。

リンガー溶液を充填した10cmの組織培養皿を金属板の上に置きます。酸素化石を溶液に入れます。次のステップは、白鳥の細胞と軸索が異なる色でラベル付けされたマウスを選択することです。

マウスを安楽死させた後、エタノールを噴霧します毛皮の汚染を防ぐために、大きなはさみを使用して胸骨の上に正中線を切開し、胸郭の下端に平行に2つの切開を行います。皮膚を切除し、腹部を開き、胸骨の筋肉挿入部の近くに切開して胸筋を解剖します。鉗子を使用して剣状骨をつかみ、剣状骨のすぐ下にある横隔膜を切り開きます。

横隔膜を肋骨の挿入部に沿って解剖します。時々、剣状突起によって胸郭を保持するための鉗子を使用して乾燥を防ぐために、組織をリンガー溶液で濡らします。肋骨の挿入部にできるだけ近い椎骨から肋骨を切り始めます。

左右のカットは、心臓の上でマヌブリウムの船尾の目に向かって収束する必要があります。主要な血管、特に鎖骨下静脈を切断しないようにしてください。視認性を向上させるため。

鉗子で剣状突起をつかみながら、準備を静かに持ち上げます。次に、マニュブリウムの船尾の目のすぐ下に横方向の切り込みを入れて胸部を取り除き、準備したリンガー溶液でX explanを10センチメートルの皿に移します。皿を金属板の上に置き、氷を入れた皿を顕微鏡下で顕微鏡下に置きます。

小さなスプリングハサミを使用して、胸腺、胸膜、横隔膜、胸筋の残りを取り除きます。小さなスプリングハサミを使用して、胸骨に挿入されていないすべての肋骨を解剖します。肋骨の間の組織を切断します。

これにより、X explanは3.5cmのSILガードコーティングディッシュに収まります。次に、8〜10本の短縮されたミニューシンピンを使用して、ここで指摘されている三角形の船尾の目の筋肉を避けて、Xエクスプランをピンダウンします。2本のピンは胸骨の軟骨部分を通り、2本のピンは肋骨の間の柔らかい軟骨部分を通り抜ける必要があります。

肋骨を三角形の筋肉の下または近くに穴を開けることは避けてください。肋骨がいくらか広がるまでピン留めを続けます。筋肉を少し伸ばした位置に固定します。

3.5cmのシルガードコーティングディッシュを、アルゴンヌレーザーと水浸対物レンズを備えた共焦点顕微鏡に移します。タイムラプス顕微鏡検査の場合は、3.5cmのシルガードコーティングされたディッシュを加熱リングに挿入します。超灌流システムを設置し、温度プローブを取り付けます。

エクスプラン、皿の縁、または葉巻のコーティングに何も触れないようにしてください。タイムラプス顕微鏡の場合はX explanを加熱しますが、シュワン細胞の漂白の場合は室温が適しています。今Forexの空気対物レンズを使って、三角の船尾の目の筋肉の神経支配パターンを観察し、三角の船尾の目の端板バンドを見つけます。

20 x ディッピングコーン対物レンズに切り替えて、nplate バンド領域内の表在領域を探し始めます。肋骨の上にあり、肋間神経に近い領域が有力な候補領域です。100 x または 60 x ディッピングコーン対物レンズに切り替えて、個々の対物レンズと mjs を確認します。

理想的には、このプロトコルの成功にとって非常に表面的に重要ないくつかのシュワン細胞によって覆われたNMJを見つけることは、それらの表面的で平らな神経筋接合部を見つけることです。神経筋接合部は円筒形筋線維を革新しているため、線維に巻き付けられる傾向があり、手はイメージングに最適な角度を持っていないことがよくあります。表面が平らで表面にある神経筋接合部のみを選択します 100 x 1.0 の開口数対物レンズを使用します。

2.5ズームで、NMJの共焦点画像を取得します。これらの設定では、約 0.1 マイクロメートルのピクセル サイズが提供され、ナイキスト基準に従って適切な空間サンプリングが保証されます。次に、488ナノメートルのレーザービームを核の中央に駐車し、最大出力を5秒間使用してシュワンセルを光退色します。

次に、細胞に再び焦点を合わせ、漂白結果を判断します。必要に応じて、GFPレベルが背景レベル近くまで下がるまで漂白手順を再度繰り返してから、別の画像を取得します。漂白領域が 2 つのセル間の重なりの外側にあることを確認することが重要です。

重なり合っている場合、2番目のセルの漂白は明らかです。このアプローチを適切に行うと、最終細胞が明確に明らかになり、多くの場合、手順を開始する前には推測できなかった非常に驚くべき形態になります。シュワンセルの1つを除くすべての細胞が漂白されるまで、漂白プロセスを繰り返します。

最後の未漂白シュワンセルは、共焦点タイムラプス顕微鏡法に適しています。タイムラプス撮影が完了したら、ズームなしで100倍で画像を撮影し、次に20倍対物レンズを使用して領域を撮影し、4倍対物レンズを使用してこのプロセスを繰り返して、これらのnjsのマップを作成します。このマップは、固定された筋肉の免疫組織化学に続くnjsを見つけるために必要です。

イメージングと漂白の後、エクスプランのピンを外し、少なくとも15ミリリットルの4%PFAを含む50ミリリットルのチューブに移します。次に、組織を1時間冷やした後、チューブを氷の上に1時間置き、PBS中の0.1モルグリシンで少なくとも10分間すすぎます。次に、固定されたexplanを0.01モルPBSで満たされた5センチメートルのシルクガードコーティング組織培養皿に移し、explanをさらに解剖する準備をします。

まず、片側が胸骨に平行で、もう片側が骨から軟骨への移行を通した台形を切り取ります。これには、その表面に三角形の筋肉が含まれています。次に、三角形の筋肉のコドルエンドに自由にアクセスできるように、水平または経胸骨のカットで下部肋骨を取り外します。

次に、皮下注射針をピンとして台形の上部に挿入します。次に、三角筋を取り除きます。まず、鉗子を使用して、筋肉のコドルコーナーを優しく保持します。

次に、注射器と針をマイクロメスのように使用して、胸壁の平面と平行に切断します。筋肉の甘えん坊部分が解放されたら、胸壁を通して筋肉の下に別の針を挿入して、準備を固定します。結合組織の挿入部を切断しながら、鉗子から優しく引っ張るように胸部から筋肉を剥がします。

最後に、鉗子を使用して脂肪と血管の残りを取り除きます。神経を引き裂かないように注意してください。これで、三角形の筋肉が免疫組織化学の準備が整いました。

PLPプロモーター下でGFPを発現するマウスを用いた三角船尾眼のexplanを作製し、シュワン細胞のex vivo可視化を行った。軸索は、P-L-P-G-F-Pを大腿部に交差させることで、同時に可視化することができ、OFPは3匹のマウスでした。記載されたプロトコルを使用して、単一末端シュワン細胞の形態は、隣接する2つの末端および最初の軸索シュワン細胞を生きたまま漂白することにより、驚くほど詳細に明らかにされた。

画像化された神経筋接合部は、事前に作成されたマップを使用して追跡され、ライブ共焦点顕微鏡検査後に固定組織で高解像度でスキャンされ、三角形の船尾の外壁が固定され、染色されました。ここに示されているのは、Alexa 6 47に結合したバンガロートインで標識されたアセチルコリン受容体(赤)と、抗シナプトフィジン抗体で標識されたシナプス小胞(白)です。このビデオを見れば、最初はすべて同じ蛍光タンパク質で標識され、密集しすぎて個別に分解できない単一細胞の形態を視覚化する方法を十分に理解できるはずです。

この例では神経筋接合部を示していますが、他にも多くの潜在的なアプリケーションがあります。