Name: トリプシンで継代色合いヒト胚性幹細胞、線 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-10-12T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 学ぶトリプシンを用いたHuESヒト胚性幹細胞の継代培養法。適切な操作で未分化状態と染色体正常性を維持し、遺伝学的異常のリスクを最小化する標準プロトコルを解説する。

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一般我々は、容易な取り扱いを確保するために与えられた一度に1つ以上のサンプルを解凍することをお勧めします。ハンドラは、長時間室温と低CO2で培養を残さないよう注意する必要があります。生細胞の全ての遠心は室温で5分間、500〜600 × gで行われます。 MEFを（マウス胚性フィーダー細胞） <ol><li> 37〜プレ暖かいMEFのメディア℃の-80から直ちに° Cおよび37 ° Cの水浴中に浸し、チューブの下半分をMEFバイアルを取り外します。細胞が80％（左の小さな冷凍部分）に解凍する前に、これは30〜45秒ほどかかります。 </li><li>迅速に、層流フードへのチューブをもたらす70％アルコールでダウンスプレー、と予め温めておいた培地に細胞を移す。 </li><li>前の準備プレートからゼラチン溶液を吸引除去する。 </li><li> sixのウェルの各々に滴下方法でMEFの溶液のアリコート2ミリリットル。よく約均等にMEFのを配布してください。 MEFのは、プレートにアタッチできるように一晩MEFプレート、および37℃のインキュベータ内の場所を日付。 </li><li> 6時間後のMEFは、プレートに添付されます。 24〜48時間、めっき後MEFプレートを使用するのが最良です。 4日以上経過であるMEFのプレートを使用しないでください。 </li><li> 37にメディア及び0.05％トリプシン/ EDTA ° Cボンネット、prelabel下の1滅菌50 mlコニカルチューブプリ暖かい色合い。 </li><li>慎重に分割する文化から色相の培地を吸引除去する。優しく1Xリン酸緩衝液（PBS）ウェルあたりの2mLのでウェルを洗浄。 PBSを吸引除去する。ウェルに0.75ミリリットル0.05％トリプシン/ EDTAを追加。 </li><li>蓋を交換し、4倍で細胞を観察します。色相のコロニーを周囲のMEFは撤回を開始する必要があります。 MEFのは十分に丸められると色相のコロニーの境界線が荒いときは、フードにプレートを返します。このプロセスは、まったくの10分より長くしたり、細胞がしない再成長、約5分かかりますありません。 </li><li> MEFの単分子層が完全に（単層が固定して、1つの部品のままとなる場合がある）切り離されるまで、静かに、井戸の底を洗い、上下にピペッティングし。 </li><li>追加の色合いのメディアを含む50 mlコニカルチューブに細胞懸濁液を移す。メディアをオフ吸引、5分間500xg細胞のチューブをスピン、細胞ペレットを乱さないように注意してください。 </li><li> MEFの新しいプレート上にプレートに、追加の色合いのメディアへの細胞の適切に定める量を追加し、自動化されたピペットでソリューション5〜7倍のピペット。 </li><li> MEFの新鮮なプレートからMEFメディアを取り出します。 </li><li>分注し、各ウェルに賢明な色合いのソリューションのドロップを、よくに関して均等にドロップを配布することを確認すること。プレートを振とうすることなく、慎重な色合いのコロニーのシードように一晩37℃のインキュベーターにセルを返します。 </li><li>スプリットから出てくる色合いの細胞は、雪解けから出てくるものと同様に動作する必要があります。 </li></ol>

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</ol>

このビデオでは、我々の研究室でどのように日常的に通過の色合いヒト胚性幹細胞株を示した。効率的かつ定期的に分割し、継代は、健康なヒト胚性幹細胞株を維持するために必須です。トリプシンを介した通路は、色相の細胞株の大きな利点である、しかし、それは上の文化をトリプシンしたり、再platting中の単一細胞の大部分を持たないことが重要です。

色合いメディア651.5ミリリットルKO - DMEM 500ミリリットルPenStrep 6.5ミリリットルGlutaMAXTM 6.5ミリリットルNEAA 6.5ミリリットル2 - メルカプトエタノール0.5ul KO血清の交換65ミリリットルPlasmanate 65ミリリットルbFGF2（10 ng / mLの最終的な）0.65ミリリットル

トリプシンで継代色合いヒト胚性幹細胞、線

Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.

このビデオでは、我々の研究室は、日常的にトリプシンとの色合いのヒト胚性幹細胞株を通路方法を示します。ヒト胚性幹細胞は、細胞培養の成果物であり、高い人口倍加した核型異常を取得する傾向がある。適切な継代は、健康、未分化、karyotypically正常な色合いのヒト胚性幹細胞培養を維持するために必須です。最初に、拡大培養は残留メディアや細胞破片を除去するためにPBSで洗浄し、次いで細胞は温かい0.05％トリプシン- EDTAの最小限のボリュームでオーバーレイされます。トリプシンは、最大5分間までのセルに残って、その後、細胞を穏やかに2mLの血清学的ピペットで外れています。細胞懸濁液は、その後、細胞を穏やかな遠心分離によって収集され、色相のメディアの大容量で採取し、混合される。不活化トリプシンメディアの混合物を除去し、細胞は、予め温めておいた色合いのメディアに再懸濁されている。適切なスプリット比は、（一般的には1:10〜1:20）に計算されます、そして放射線照射マウス胎児線維芽細胞のフィーダー細胞の単層を含む1から2日目のプレートに再播種した細胞。新たに接種した色合いの培養プレートを48時間静置され、その後メディアはその後、毎日変更されます。これは核型異常を導入するリスクを増加させるとそれは、単一の細胞懸濁液にダウンtrpsinizeことが重要です。

このビデオでは、我々の研究室は、日常的にトリプシンとの色合いのヒト胚性幹細胞株を通路方法を示します。

このビデオでは、当研究室で日常的に行っている、トリプシンを用いたHuESヒト胚性幹細胞株の継代操作について実演します。ヒト胚性幹細胞は、人工的な...

これは、テクニックをどこで実行しましたか?ああ、どこで教えたの?ベルチャー。うん。初めてベルを教えたとき、夏の間はT.イェアで過ごしました。そして、私たちはそこで軟骨のものが好きだったという感じでした。だから、私はそこの社会文化が好きでした。そして、ホプキンス大学では、4年生のとき、私は別の仕事をしていたので、エンジニアリングのことのように、3次元を設計してみることがはるかに重要でした。

passaging-hues-human-embryonic-stem-cell-lines-with-trypsin

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、マウス胚性線維芽細胞（MEF）フィーダー細胞上でヒト胚性幹細胞（ヒトES）を成長させる方法を示しています。...

MEFの存在下で継代ヒトES細胞：MEFをから私をマトリゲルする

ESCの分化は、細胞型特異的構造の変化とクロマチンの構成と一致している。これらの変更の検出はstemcellnessと細胞分化を定義するメカニズムが貴重な洞察を提供します。クロマチン免疫沈降（ChIP）は、幹細胞の分化の分子メカニズムを解明する貴重な方法を表します。...

ヒト胚性幹細胞からクロマチン免疫沈降

このビデオでは、フィーダー細胞を含まない条件とどのように継続的にフィーダー細胞を含まない条件で継代ヒトESにおけるヒト胚性幹細胞（ヒトES）の成長を維持する方法を示します。免疫蛍光顕微鏡法でフィーダー細胞を含まない条件で増殖させた多能性hESCの確認にも示されている。...

マトリゲル上にマトリゲルからの継代ヒトES細胞：MEFのからマトリゲル3〜

核型分析は、広く遺伝子変異を検出するために使用されるシンプルかつ有用な技術である。ここでは、文化の中で維持、これらの細胞の染色体の状態を監視するためのヒト胚性幹細胞の染色体の広がりの準備のためのステップのプロトコルバイステップで説明します。...

染色体分析のためのヒト胚性幹細胞の染色体スプレッドの準備

我々は、小分子ベースのオリゴデンドロサイト前駆細胞体（OPC）にマウス胚性幹細胞の分化のためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは、分化の30日間で高効率とOlig2 + NG2 +...

オリゴデンドロサイト前駆体に胚性幹細胞の分化

特定の細胞へのヒトES細胞の監督分化、再生医療に大きな関心を生成しています。我々は決定するための簡潔な、ステップバイステップのプロトコルを提供する...

テラトーマ形成により、ヒト胚性幹細胞の運命のマッピング

ミクロ解剖植技術は、骨格筋幹細胞のソースとして、若年成人や胚の筋肉から増殖性骨格筋細胞を単離するための堅牢で信頼性の高い方法です。一意に、これらの細胞は、クローン的に生体移植のために使用される骨格筋幹細胞株を生成するために導出されている。...

大人と胚骨格筋のMicroexplantの文化と骨格筋幹細胞の単離

このプロトコルは、ゼラチンでコーティングされた皿にヒト胎盤由来の馴化培地のみを使用して、ヒト多能性幹細胞(hPSC)を増殖させる簡単で効率的な方法を提供します。追加の外因性サプリメントやhPSC特異的な合成基質はありません。...

ヒト多能性のための新しい文化モデルは、プラセンタ馴化培地中のゼラチンの細胞増殖幹

この方法は、蛍光タグ付きサルコメアタンパク質を有する多能性幹細胞由来心筋細胞を用いてサルコメア短縮を調べるために使用することができる。...

蛍光タグ付きサルコメアタンパク質を用いた多能性幹細胞由来心筋細胞のサルコメア短縮

フィーダー細胞で培養したヒト胚性幹細胞(hESC)およびヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)の酵素的または機械的継代に伴う制限を回避するため、EDTAを介した接着除去を使用して、ヒト包皮線維芽細胞のフィーダー細胞層上に維持されたヒトES細胞またはiPS細胞コロニーを採取するための迅速、効果的、費用対効果の高い、高収率の方法を確立しました。...

エチレンジアミン四酢酸媒介接着消によるフィーダー細胞上のヒト多能性幹細胞の迅速で費用対効果の高い酵素フリー継代

このプロトコルは、人工多能性幹細胞(iPS細胞)からのヒト破骨細胞の微分を示し、破骨細胞および破骨細胞の前駆細胞の性格描写のための方法を記述する。...

ヒト人工多能性幹細胞からの破骨細胞の分化と特性評価

学ぶトリプシンを用いたHuESヒト胚性幹細胞の継代培養法。適切な操作で未分化状態と染色体正常性を維持し、遺伝学的異常のリスクを最小化する標準プロトコルを解説する。

トリプシンで継代色合いヒト胚性幹細胞、線

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