Name: 脳組織の慢性Optogenetic刺激のための光ファイバ注入 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 学ぶ光ファイバーインプラントによるマウスの慢性光遺伝学的刺激法。神経回路の長期的活性化と行動評価を可能にし、組織損傷を最小限に抑えた神経科学研究に応用されます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我々は、この技術はもともとスパルタら 、2012によって記述されていたと簡単に私たちの研究室での使用に適合されていることを承認したいと思います。

それぞれの製造者および/またはベンダーと一緒に*すべての材料は、プロトコルの下に表示されます。 1。インプラントの組み立て<ol><li>樹脂1gに硬化剤100 mgを追加することで、熱硬化性光ファイバエポキシの混合物を準備します。 </li><li>メジャーとくさび先端カーバイドスクでそれを得点に100μmコアを持つ光ファイバ125μmファイバーの約35mmを切った。単一、単方向の動きで光ファイバーとスコアにスクライブ垂直に置きます。繊維を切断して完全に光ファイバのコアにダメージを与えます。 </li><li>バイスに穴127μmのフェルールのLCセラミックを挿入し、凸側がダウンして指摘した。 </li><li>フェルールに光ファイバを挿入します。光ファイバーはスムーズにスライドし、わずかにフェルール（ 図1a）の凸端を越えて突出する必要があります。 </li><li>エポキシが黒くなるまで、ヒートガンで平らな端と熱に熱硬化性のエポキシ樹脂の光ファイバの1滴を適用します。エポキシべきそれを加熱して硬化される前にフェルールを埋める。エポキシは、一定の熱アプリケーションの〜1分以内に治す必要があります。 </li><li>それはカプラとのインタフェース邪魔になるため、フェルールの側面に沿って任意のエポキシを拭き取ります。 </li><li>研磨パッド上に酸化アルミニウム研磨シート（ 図1b）でLC光ファイバ研磨ディスク（FOPD）を使用して、フェルールの凸端を磨く。円形の回転パターンを作成し、次の順序で4つのグレードに磨く：5、3、10.3μmのグリット。 </li><li>それは関心領域を対象としているような適切な長さに平らな端で光ファイバをカットします。長さは脳地図を用いて決定することができる。 </li><li>後述のカプラーコードを介してレーザーに接続することによってインプラントをテストします。インプラントの研磨端は、カプラのスリーブ内に挿入され、対向するフェルールとの直接の接触を行う必要があります。インプラントは番目の先端で測定、光出力10 mWを維持することができるはずeのインプラント繊維。悪いインプラントは、光ファイバの先端付近の弱い焦点を持つことになります。 </li><li>使用するまで泡の完成インプラント（ 図1c）を格納します。 </li></ol> 2。光ファイバカプラのコードのアセンブリ<ol><li>上記のような熱硬化性光ファイバエポキシの混合物を準備します。 </li><li>くさび先端カーバイドスクでそれを得点に200μmコアを持つ光ファイバ220μmファイバーの適切な長さを測定し、カット。繊維の長さは、マウスが住宅の周りを自由に移動することができますが、マウスがファイバを通じてかむを許すべきではない。 </li><li>光ファイバの長さよりわずかに長い根分岐部のチューブの長さに光ファイバーを挿入します。チューブは光ファイバーよりもわずかに大きい内径を有するべきである。 </li><li>ストリップ〜止まるまで230μmのボアと光ファイバの一端に25mmとマルチモードのFC MMの金属端に挿入し、アセンブリをフェルール。光ファイバーはferru通って固執する必要がありますル·エンド（ 図2a）。 </li><li>金属の終わりに（スーパー接着剤）シアノアクリレートとの接続を固定します。コネクタのブーツとの接続をカバーするとFC FOPDとフェルール端面を研磨する。 5、3、1、0.3μmのグリット（ 図2b）は、次の順序で4学年上の円形の回転パターンとポリッシュを行います。 </li><li>遠凸端を有するLCセラミックフェルール（230μmのIDボア）に光ファイバのもう一方の端を取り除き、挿入します。硬化するまで平らな端および熱に対するエポキシのドロップを適用します。 </li><li>上記のように酸化アルミニウムの研磨シートでFC FOPDを使用して、フェルールの凸端を磨く。 </li><li>スリーブの中点までフェルールの端の上に凸のLCフェルールスリーブをスライドさせます。 </li><li>場所、熱収縮チューブと分岐接続（ 図2c）を確保し、保護するスリーブと熱上のチューブを。 </li><li>レーザ光源に接続し、光OUTPを測定することによりカプラをテスト分光光度計を用いてカプラを介してUT。レーザー出力と測定されたカプラ出力との間の光損失は30％を超えてはならない。 </li></ol> 3。外科的移植 *これはヒントのみの手順です。 Instrumentsは、滅菌されているが、手袋は器具および装置との間に一定の操作に起因している必要はありません。 <ol><li> 30ゲージの針を用いてそれぞれ腹腔内注射をケタミン/キシラジン混合物100及び10 mg / kgでマウスを麻酔。 </li><li>バリカンで頭皮を剃る。 Betasept続いて70％イソプロピルアルコールで頭皮を拭い回繰り返し、2分間（4％クロルヘキシジン溶液）を拭きます。 </li><li> sterotaxicリグにマウスを置き、頭部を固定し、頭蓋骨が水平であることを保証します。乾燥や術後の痛みを防ぐために、目に眼軟膏を適用します。畝の生理状態に応じて酸素で希釈揮発イソフルラン（1〜3％を使用して麻酔を維持連続テールピンチへの応答）によって監視されるべきであるSE、。 </li><li>ラムダにある目の軌道から頭蓋を露出させ、頭皮の正中線を通って切り込みを入れる。必要に応じて結合組織を押し退ける。 </li><li>肌を抑えて頭蓋（ 図3a）へのアクセスを維持しセラフィン·クランプを使用しています。 </li><li>デンタルピックと頭蓋の表面全体にエッチ市松模様。滅菌生理食塩水を離れて破片を洗ってください。徹底的に乾燥させます。 </li><li>微細孔を作成するために〜2-3秒間綿棒で露出した頭蓋に過酸化水素（3％）を適用します。複数回洗い、よく乾かします。スパルタらで説明したように別の方法として、アンカーは、頭蓋にねじ込むこともできます。 （2012）。 </li><li>繰り返しになりますが、歯のピックと頭蓋全体に市松模様のエッチングと食塩水で残骸を洗い流す。徹底的に乾燥させます。 </li><li>回転工具を用いて、滅菌ドリルビット小さな穿頭孔開頭術（直径&lt;1 mm）を作る（オートクレーブ）関心領域の上に、ブレグマとラムダに校正脳地図によって決定されます。硬膜を壊すか、または任意の組織に損傷を与えないように注意してください。破片を離れて洗い、よく乾かします。 </li><li>プローブホルダーに光ファイバーフェルール（インプラント）を挿入し、定位アームに接続します。 </li><li>直接定位アーム（ 図3b）を使用して、関心領域の上に所定の位置にインプラントを置きます。脳組織内の光ファイバを挿入した場合、繊維は約2 mm / minの速度でゆっくりと進めなければならない。フェルールは、残りの頭蓋上にくるようにします。 </li><li>歯科用セメントの混合物を準備します。混合物は容易に頭蓋全体に適用されるのに十分低い粘度を持っている必要があります。混合物は2-4分間使用可能になります。 </li><li>滅菌つまようじを使用して、頭蓋全体およびインプラントの下部への歯科用セメントの薄い均一な層を適用します。として歯科用セメントのベース層は、頭蓋にできるだけ多くの表面積をカバーすべきである可能。歯科用セメントは、マウスの皮膚に接触させないでください。これは、増加した縫合の難しさだけでなく、マウスへの刺激につながる。歯科用セメントが皮膚に接触しない場合、それは部分的にセメントのレイヤー全体が設定する前に剥離することができるように乾燥することができます。 </li><li>それが完全に乾燥することができます。 </li><li>それぞれの層は（ 図3c）完全に乾燥させ、頭蓋の上、インプラントの周りの小さなマウンドを形成するために、歯科用セメントの偶数層を適用します。滑らかで、遮るもののない接続を可能にするためにセメントのきれいなフェルールの凸端の約3〜5 mmのままにしておきます。 </li><li>歯科用セメントのマウンドの上およびC22針付き滅菌の単回使用絹編組縫合糸（6-0）を使用して、インプラントの周りに頭皮を縫合。 7日後に削除します。オプション：縫合した後、追加のバインドに使用獣医ボンド。最小限の獣医ボンドを必ず使用してください。過剰は引っかき傷に起因する重篤な皮膚の損傷につながることができます。 </li><li> Immediatel手術後のY、マウスの皮下術後疼痛を減少させるためにKetprophen（5 mg / kgの）を注射しなければならない。これは24時間後に繰り返されるべきである。縫合し、皮膚への局所鎮痛薬（Bupivicaine）と抗生物質（ネオスポリン）を適用して、インプラントの根元。 </li><li>麻酔からの回復のための毛布の上にケージにマウスを置きます。滅菌し、術後の回復ケージにマウスを置きます。回復ケージには温度を維持し、窒息を避けるために、どんな寝具を含むべきではありません。マウスは、元のケージまたは一回目が覚めて、新しいケージに戻すことができます。 </li></ol>光源と関心領域内の光ファイバーの端部との間の最小の光子損失の光ファイバインプラントとカプラ結果の適切な組み立て。洗練された光ファイバーは同心円（ 図2d）、均一に光を透過する必要があります。慎重に注入し、縫合では、インプラントは、には目に見える刺激を起こさないマウスや光ファイバーまたは透過する光の量の有意な低下させることなく、長期的な研究（ 図3d、&gt; 1ヶ月、未発表の観察）のための場所に留まることができる。不適切な注入や縫合は炎症を引き起こすことができ、その頭皮を通してスクラッチマウスになる可能性があり、歯科用セメントを露出したり、永続的な操作に起因する歯科用セメントからフェルールの破損。組み立てられたシステムの概略図を図4に示します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig1.jpg" /> 図1：植込み型光ファイバーの組立。 （a）は、光ファイバはわずかに矢印で示す凸端を越えて突出、フェルールに挿入されます。 （b）のフェルールの凸端は、研磨シートの徐々に細かいグレードにFOPDを用いて研磨されています。 （c）に完成した植込み型繊維のオプトインIC。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50004/50004fig1large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig2.jpg" /> 図2：光ファイバカプラの組立は、インプラントにテザーへの光ファイバーロータリージョイントを使用していました。フェルールアセンブリから（a）の光ファイバスティッキング。 （b）は、アセンブリのフェルール側は研磨紙の使用FOPDと洗練徐々に細かいグレードに挿入されます。 （c）のフェルール、フェルールスリーブの上に取り付けられ、熱収縮チューブで固定されています。 （d）を終え、光ファイバカプラは、最小限の光子損失と同心光を生成する必要があります。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig3.jpg" /> 図3：外科的移植光ファイバー。 craniuの（a）の全面メートルが露出していると結合組織はクリアされます。 （b）は光ファイバインプラントは、定位固定アーム付き位置に保持されている。 （C）歯科用セメントは、頭蓋に光ファイバを固定するインプラントが適用されます。 （d）は移植後&gt; 1ヶ月、皮膚がインプラントの周囲に治癒したと刺激の兆候はありません。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig4.jpg" /> 図4機能的なシステムの概略図

<ol><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Light-Induced+Activation+of+Neural+Circuitry+in+Trangenic+Mice+Expressing+Channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Trangenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2.</a> Neuron. 54, 205-218 (2007).</li>
<li>Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141, 165-16 (2010).</li>
<li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li>
<li>Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetic+and+imaging+technologies+for+circuit+based+neuroanatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy.</a> Nature. 461, 900-907 (2009).</li>
<li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+interrogation+of+neural+circuits%3A+technology+for+probing+mammalian+brain+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures.</a> Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).</li>
<li>Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+substrates+of+awakening+probed+with+optogenetic+control+of+hypocretin+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons.</a> Nature. 450, 420-424 (2007).</li>
<li>Sparta, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nature Protocols. 7, 12-23 (2012).</li>
<li>Stuber, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+transmission+from+the+amygdala+to+nucleus+accumbens+facilitates+reward+seeking%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Excitatory transmission from the amygdala to nucleus accumbens facilitates reward seeking.</a> Nature. 475, 377-380 (2011).</li>
<li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+a+hippocampal+engram+activates+fear+memory+recall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall.</a> Nature. 484, 381-385 (2012).</li>
</ol>

Optogeneticsは、特定の神経細胞サブタイプ上前例のない制御を可能にする強力な新技術です。これは、電極を介して電気刺激の細胞型無差別かつ侵襲の影響を回避しながら、解剖学的および時間的な精度で神経回路を調節するために悪用される可能性があります。光ファイバーの注入は組織への最小限のダメージでマウスを行動、覚醒では、複数のセッションにまたがる神経回路の一貫性があり、慢性的な刺激が可能になります。このシステムは、もともとスパルタらによって開拓され、図8および我々の目的に合わせて修正されたが、移植されたカニューレから一歩進んで、長期的な研究の合間ターゲティング一貫性を保証するために、関心領域の代わりに光ファイバーを修正しています。インプラントは、脳の異なる領域を刺激するように適合させることができます。 このメソッド内で様々な手順が詳細に精度と注意を払う必要があります。光ファイバーカップリングの各接合部がある必ずしも最小限の光損失を確実にするために磨いた。研磨した後、両端がファイバコアに損傷がないことを確認するために、顕微鏡下で検討すべきである...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬や機器の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ＃ </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> LCフェルールスリーブ</td><td>精密ファイバー製品（PFP） </td><td> SM-CS125S </td><td> 1.25ミリメートルのID </td></tr><tr><td> FCのMM組立て済みのコネクタ</td><td> PFP </td><td> MM-CON2004-2300 </td><td> 230μmのフェルール</td></tr><tr><td>ミラーFOPD-LCのディスク</td><td> PFP </td><td> M1-80754 </td><td> LCフェラル用</td></tr><tr><td>分岐配管</td><td> PFP </td><td> FF9-250 </td><td> 900μmの外径、250μmの番号</td></tr><tr><td> MM LCスティックは1.25mmフェルール</td><td> PFP </td><td> MM-FER2007C-1270 </td><td> 127μmのIDは、内径</td></tr><tr><td> MM LCスティックは1.25mmフェルール</td><td> PFP </td><td> MM-FER2007C-2300 </td><td> 230μmでIDボア</td></tr><tr><td>熱硬化性のエポキシ樹脂、硬化剤および樹脂</td><td> PFP </td><td> ET-353ND-16オンス</td><td></td></tr><tr><td> FC / PC及びSC / PCコネクタ研磨ディスク</td><td> ThorLabs </td><td> D50-FC </td><td> FCフェラル用</td></tr><tr><td>デジタル光パワーとエネルギーメーター</td><td> ThorLabs </td><td> PM100D </td><td>分光光度計</td></tr><tr><td>研磨パッド</td><td> ThorLabs </td><td> NRS913 </td><td> 9 &quot;×13&quot; 50デュロメーター</td></tr><tr><td>酸化アルミニウムラッピング（研磨）シート：0.3、1、3、5μmのグリッツ</td><td> ThorLabs </td><td> LFG03P、LFG1P、LFG3P、LFG5P </td><td></td></tr><tr><td>標準ハード·クラッドマルチモードファイバ</td><td> ThorLabs </td><td> BFL37-200 </td><td>低OH、200μmコア、0.37 NA </td></tr><tr><td>繊維ストリッピングツール</td><td> ThorLabs </td><td> T10S13 </td><td>クラッド/ Coの時：200ミクロン/ 300ミクロン</td></tr><tr><td>シリカ/シリカ光ファイバ</td><td>ポリマイクロ·テクノロジーズ</td><td> FVP100110125 </td><td>高OH、UVエンハンスド、0.22 NA </td></tr><tr><td> 1x1の光ファイバーロータリージョイント</td><td>ドリス式レンズ</td><td> FRJ_FC-FC </td><td></td></tr><tr><td>モノ光ファイバーパッチコード</td><td>ドリス式レンズ</td><td> MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC </td><td></td></tr><tr><td> 1/8インチ、熱収縮チューブ</td><td>アライドエレクトロニクス</td><td> 689-0267 </td><td></td></tr><tr><td>ヒートガン</td><td>アライドエレクトロニクス</td><td> 972-6966 </td><td> 250 W、750から800°F </td></tr><tr><td>綿はアプリケーターをひっくり返した</td><td>ピューリタンメディカルプロダクツ株式会社</td><td> 806-WC </td><td></td></tr><tr><td> VetBond組織接着剤</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 19-027136 </td><td></td></tr><tr><td>フラッシュ義歯床用アクリル</td><td>イェーツMotloid </td><td> ColdPourPowder + LIQ </td><td></td></tr><tr><td> BONNミニチュアアイリスはさみ</td><td>インテグラMiltex </td><td> 18から1392 </td><td> 3-1/2 &quot;（8.9センチメートル）、ストレート、15ミリメートルブレード</td></tr><tr><td>ジョンズ·ホプキンス大学ブルドッグクランプ</td><td>インテグラMiltex </td><td> 7から290 </td><td>湾曲1-1/2 &quot;（3.8 cm）であり、 </td></tr><tr><td>メガトルクモーター電動ラボ</td><td>ベクトル</td><td> EL-S </td><td></td></tr><tr><td>パンサーBURSボール1位</td><td>クラーク研究所</td><td> 77.1006 </td><td></td></tr><tr><td>バイオレットブルーレーザーシステム</td><td> CrystaLaser </td><td> CK473-050-O </td><td>波長：473 nmの</td></tr><tr><td>レーザ電源</td><td> CrystaLaser </td><td> CL-2005 </td><td></td></tr><tr><td>デュモン第2椎弓切除鉗子</td><td> F伊根科学ツール</td><td> 11223から20 </td><td></td></tr><tr><td>プローブ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 10140から02 </td><td></td></tr><tr><td> 5 &quot;ストレート止血</td><td> Excelta </td><td> 35-PH </td><td></td></tr><tr><td>重み付けされたベースとの万力</td><td> Altexエレクトロニクス</td><td> PAN381 </td><td></td></tr></tbody></table>

脳組織の慢性optogenetic刺激のための光ファイバ注入

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

神経結合の解明パターンは臨床と基礎の両方の神経科学の課題となっている。電気生理学はシナプス接続のパターンを分析するためのゴールドスタンダードとされてきたが、対になった電気生理学的記録は面倒で実験的に制限することの両方が可能。 optogeneticsの開発は 、in vitro および in vivo 1 2,3 の両方で 、神経細胞や回路を刺激するエレガントな方法を導入しています。離散的なニューロン集団でオプシン発現を駆動するために細胞型特異的プロモーター活性を利用することによって、人は正確に別個の回路4-6に遺伝的に定義されたニューロンのサブタイプを刺激することができる。電気刺激および/または薬理学的操作を含むニューロンを刺激するためによく記載されている方法は、多くの場合、侵襲的な細胞型無差別、であり、周囲の組織を損傷することがあります。これらの制限は、正常なシナプス機能および/または回路の動作を変更することがあります。加えて、原因操作の性質のために、現在の方法は、多くの場合、急性および端末です。 Optogeneticsは比較的無害な方法で、遺伝子標的ニューロンに神経細胞を刺激する能力を与える。 生体 optogenetics に関与する研究の大半は現在移植カニューレ6,7を通じて案内光ファイバを使用しますが、この方法の限界は、光ファイバの繰り返し挿入し、カニューレ内部の繊維の潜在的な破損と損傷脳組織が ​​含まれています。 optogeneticsの急成長分野を考えると、慢性的な刺激のより信頼性の高い方法は、最小限の巻き添え組織の損傷との長期的な研究を促進することが必要である。ビデオの記事は、効果的かつエレガントなスパルタらに記載の方法を補完するとして、ここで我々は修正されたプロトコルを提供します。8は、光ファイバインプラントの作製とその恒久的な固定のために麻酔したマウスの頭蓋と同様、アセンブリの上に繊維光源にインプラントを接続するファイバカプラ。固体レーザへの光ファイバで接続インプラントは、慢性的に少ない組織損傷9は小、取り外し可能な、テザーを用いて機能的な神経回路をphotostimulateする効率的な方法が可能になります。光ファイバーインプラントの永久固定は最小限の組織損傷で目を覚まし、行動マウスにおける神経回路10 の in vivo optogenetic試験において 、一貫した長期を提供しています。

optogeneticsの開発は今正確に遺伝的に定義されたニューロンと回路の両方を刺激するための手段を提供する<em&gt; in vitroで</em&gt;と<em生体内で&gt;</em&gt;。ここでは、脳組織の慢性光刺激用の光ファイバのアセンブリおよび移植について説明します。

脳組織の慢性Optogenetic刺激のための光ファイバ注入

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

次の実験の目的は、覚醒している行動マウスの神経回路を長期間活性化し、研究することです。この方法は、スパルタエタールで最初に説明された概念から適応されています。これは、最初に光回転ジョイントを光ファイバーインプラントに接続する光ファイバーカップルコードを組み立てることによって達成されます。次に、光ファイバーを目的の脳組織に埋め込んで、光がニューロンを発現するチャネルレジンに直接移動するための通路を作成します。最後に、光源を光学回転ジョイントに接続して、光源から脳組織まで直列に接続された経路を作成します。最終的には、チャネルレッドシン発現ニューロンの光誘起発火は、in vivo、電気生理学、および行動研究に基づいて評価できます。ガイドカニューレのような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、光ファイバーの繰り返しの挿入と取り外しによって引き起こされる脳組織への損傷を最小限に抑えることです。この方法は、神経回路の機能に関する洞察を提供するだけでなく、特定の種類の神経疾患の根底にあるシナプスと回路依存性のメカニズムをよりよく理解するために、他のシステムにも適用できます。この手法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。移植ステップを習得するのは難しいため、一見小さなステップごとに、メソッドの全体的な安定性と信頼性に大きく貢献します。まず、直径 125 ミクロンの光ファイバーを 100 ミクロンのコアで 35 mm 切断します。まず、ウェッジ チップの超硬スクライブを光ファイバーに垂直に配置し、1 回の一方向動作でファイバーにスコアを付けてからまっすぐ引き出します。次に、直径127ミクロンのlcセラミックフェラルを直径ボアの凸面を下向きにしてバイスに挿入し、光ファイバー片をフェラルに挿入します。光ファイバーは、滑らかにスライドし、野生の凸端を超えてわずかに突き出ている必要があります。次に、新たに調製した熱硬化型光ファイバーエポキシを1滴フェラルの平らな端に塗布し、次にエポキシにヒートガンを塗布します。エポキシは、加熱されると野生を満たし、黒くなると硬化するはずです。硬化後、野生の側面からエポキシをきれいにし、次にlc光ファイバー研磨ディスクを使用して、4つの減少グレードの研磨パッド上の酸化アルミニウム研磨シートに野生の野生の凸端を研磨するための円形回転パターンを作成します。次に、平らな端の光ファイバーを、関心領域をターゲットにするための適切な長さに切断します。研磨された光ファイバーをテストするには、インプラントの研磨された端をカプラーのスリーブに挿入します。対向する野生との直接接触が感じられるまで、悪いインプラントは光ファイバーの先端近くに弱い焦点を持ちますが、良いインプラントは出力なしで滑らかな同心円の光を透過します。最大10ミリワットの電力で、完成したインプラントは使用時までフォームに蓄えられます。この手順を開始するには、直径 220 ミクロンの光ファイバーと 200 ミクロンのコアを測定してスコアリングし、マウスが自由に動くようにしますが、マウスがファイバーを噛むことはできません。次に、光ファイバーを、光ファイバーの内径がわずかに大きく、長さが光ファイバーよりもわずかに短いフューレーションチューブに挿入します。次に、光ファイバーの一方の端から約25ミリメートルを剥がし、マルチモードFCMM野生アセンブリの金属端に挿入します。直径230ミクロンの穴が止まるまで、光ファイバーは野生の端から突き出ているはずです。次に、金属端でシアノアクリレートとの接続を固定し、コネクタで接続を覆います ブーツ研磨 フェラル端をFC研磨ディスクで研磨します。光ファイバーのもう一方の端を剥がした後、凸端の遠位だけを使用してlcセラミックフェラルに挿入します。次に、平らな端にエポキシを一滴垂らし、示したように硬化するまで加熱します。先ほど示したように野生の凸端を研磨した後、野生がスリーブの中点に達するまで、lc野生スリーブを野生の凸端にスライドさせます。次に、熱収縮チューブをエーションチューブとスリーブの上に置き、熱収縮チューブを加熱して接続を固定して保護します。最後に、レーザー光源に野生を接続し、次に分光光度計でカプラーを介して光出力を測定してテストし、レーザー出力と測定されたカプラー出力との間の光損失は、手術を開始する前に30%を超えてはなりません。手術部位をisopプロファイルアルコールで消毒し、続いてクロルヘキシジン溶液で消毒します。次に、マウスを定位固定装置に置き、頭蓋骨が水平になるように頭を固定します。動物の目に眼軟膏を塗布して、乾燥や術後の痛みを防ぎます。次に、頭皮の正中線を切開して、頭蓋骨を眼窩からラムダ縫合糸に露出させます。セラフィンクランプを使用して皮膚を抑え、頭蓋へのアクセスを維持します。次に、デンタルピックを使用して、頭蓋骨の表面全体に市松模様をエッチングします。生じた破片を滅菌生理食塩水で洗い流します。十分に乾燥させた後、綿棒を使用して、露出した頭蓋骨に3%の過酸化水素を約2〜3秒塗布して、微細孔を作成します。次に、頭蓋骨をより滅菌生理食塩水で複数回洗い、完全に乾かします。エッチング、チェッカーボードパターンの洗浄、乾燥を頭蓋骨に再度、光ファイバーの野生インプラントをプローブホルダーに挿入し、それを脳定位固定アームに接続します。bgmaおよびlambdaに調整された定位アトラスを使用して、バーの穴の位置を決定します。次に、回転式デンタルドリルを使用して、硬膜を壊したり組織を損傷したりしないように注意しながら、関心のある領域から直径1ミリメートル未満の小さなバーホール開頭術を行います。脳定位固定装置アームを使用して、インプラントを関心のある領域の真上に配置することで、野生は周囲の頭蓋組織に載せる必要があります。次に、滅菌爪楊枝を使用して、新たに準備した歯科用セメントの薄く均一な層を頭蓋骨全体とインプラントの下部に塗布します。動物の皮膚に触れないように注意しながら、歯科用セメントの基層は頭蓋骨の表面をできるだけ覆う必要があります。この手順の最も難しい側面は、歯科用セメントが腫瘤の皮膚に触れずに塗布することです。成功を確実にするには、一度に少量のセメントを薄い層に塗布し、各層が完全に乾くのを待ってから次の層を追加します。デンタルセメントの均一な層を適用して、頭蓋骨の上部とインプラントの周りに小さなマウンドを形成します。野生の凸端の3〜5ミリメートルをセメントのきれいなままにして、スムーズで遮るもののない接続を可能にします。次に、頭皮を歯科用セメントの山の上とインプラントの周りで縫合し、獣医用接着剤接着剤を縫合後の追加結合に使用できます。最後に、局所鎮痛薬と抗生物質を縫合糸の皮膚とインプラントの基部の周りに適用し、マウスをケージに入れて術後の回復を図ります。光ファイバーインプラントとカプラーを適切に組み立てると、関心領域の光源と光ファイバーの端との間の光子損失が最小限に抑えられます。磨かれた光ファイバーは、この画像で見られるように、ここに示されている円と同様の均一な同心円で光を透過するはずですが、慎重な移植と縫合により、インプラントはマウスに目に見える刺激を引き起こさず、光ファイバーの著しい劣化なしに、または透過する光の量に対して長期的な研究のために所定の位置に留まることができます覚起したマウスの機能的行動アッセイは、刺激からの直接応答を示していますこのin vivo電気生理学ビデオデータによって証明されるように、運動皮質上に埋め込まれた光ファイバーを介して、インプラントを介した標的ニューロンの活性化と脳刺激中の動物の行動応答を示します。この手順に続いて、標的細胞に関連する回路接続のパターンは何かなどの追加の質問に答えるために、標的脳領域の光刺激などの他の方法を実行できますか?このビデオを見れば、光ファイバーインプラントとカプラーコードの組み立て方、および光遺伝学的ポーターを発現する脳組織にそれらを埋め込む方法についてよく理解できるはずです。

fiber-optic-implantation-for-chronic-optogenetic-stimulation-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

嗅球のアダルト生まれのニューロンはoptogenetically...

慢性のためのアダルト生まれの嗅覚ニューロンの選択的なウイルス形質導入 in vivoで Optogenetic刺激

遺伝学と光学系を組み合わせた神経科学のツールの最近の開発は、空間的および時間解像度の前例のないレベルの神経回路の活動を制御することができ、「光遺伝学」と呼ばれる。ここでは、前頭前皮質及びsubicular錐体ニューロンの遺伝的に定義されたサブセットのoptogenetic操作で、生体内の記録に統合するためのプロトコルを提供する。...

個々の錐体細胞のハイフィデリティOptogenetic制御法<em&gt;インビボ</em

Optogeneticsは、行動神経科学の実験で使用するための強力なツールとなっています。このプロトコルは、レーザーシステムの設計とセットアップのステップバイステップガイドを提供し、ほとんどのげっ歯類の行動試験パラダイムと互換性のある複数の同時in...

齧歯類の中枢神経系の生体光遺伝学的刺激

このプロトコルは、光遺伝学的機能的磁気共鳴画像法(ofMRI)を成功させるために必要なステップとデータ分析を説明しています。ofMRIは、高磁場fMRIの読み出しと光遺伝学的刺激を組み合わせた新しい技術であり、機能的な神経回路とそのダイナミクスを生きた脳全体にわたって細胞タイプ特異的にマッピングすることを可能にします。...

光遺伝学機能MRI

絹フィブロイン膜を用いた脳にウイルス発現ベクターを配信する方法を紹介します。このメソッドは、シルク/AAV 被覆光ファイバー、光ファイバー、・頭蓋の windows...

生体内でシルク/AAV 膜を用いた光遺伝学的タンパク質の発現

特定の神経集団や脳領域の光遺伝学的操作により、自由に動く動物の高い時間的および空間的分解能で行動を修正することができる。慢性に埋め込まれた光ファイバーと組み合わせて異なる光遺伝学的ツールを使用することにより、さまざまな神経変調および行動検査を行うことができます。...

自由に動くマウスの行動を調節する神経活動の光遺伝学的操作

ここでは、光伝達用光ファイバと神経記録用電極アレイを用いたオプトロードシステムの製造方法について紹介する。チャネルロドプシン-2を発現するトランスジェニックマウスを用いた インビボ 実験は、同時光遺伝学的刺激および電気生理学的記録のためのシステムの実現可能性を示す。...

同時光遺伝学的変調と電気的神経記録のためのオプトロードアレイ

このプロトコルは、脊髄手術を行うための外科的手順と、げっ歯類の脊髄上に光学シャンクを移植して固定するための外科的手順を詳述しています。...

げっ歯類の脊髄へのオプトエレクトロニクスデバイスの移植

私たちは、電極製造のためのシンプルで費用対効果の高いアプローチを開発し、自由に動くマウスで複数の領域にわたる信号の記録を行いました。光遺伝学と多領域電気生理学およびカルシウムシグナル記録を利用することで、発作キンドリングモデルにおける領域間のニューロン活動の解明が可能になりました。...

多領域In Vivo記録のための柔軟で便利な電気生理学的オプトロードを作成するための統合的手法

このプロトコルは、ウイルスの送達、視球体の着床、光血栓誘導、アストロサイトおよびニューロン活動の同時記録、アストロサイトのオプトジェネティック刺激を含む統合的な手法を提供します。この統合手法は、虚血性脳卒中の急性期から慢性期にわたり、アストロサイトとニューロンの関係を同時に調査することを目的としています。...

振る舞うマウスの神経細胞およびアストロサイト活動の光血栓性脳卒中モデリングおよび in vivo 光学記録のための統合手法

学ぶ光ファイバーインプラントによるマウスの慢性光遺伝学的刺激法。神経回路の長期的活性化と行動評価を可能にし、組織損傷を最小限に抑えた神経科学研究に応用されます。

脳組織の慢性Optogenetic刺激のための光ファイバ注入

さらに動画を探す