脳組織の慢性Optogenetic刺激のための光ファイバ注入

次の実験の目的は、覚醒している行動マウスの神経回路を長期間活性化し、研究することです。この方法は、スパルタエタールで最初に説明された概念から適応されています。これは、最初に光回転ジョイントを光ファイバーインプラントに接続する光ファイバーカップルコードを組み立てることによって達成されます。

次に、光ファイバーを目的の脳組織に埋め込んで、光がニューロンを発現するチャネルレジンに直接移動するための通路を作成します。最後に、光源を光学回転ジョイントに接続して、光源から脳組織まで直列に接続された経路を作成します。最終的には、チャネルレッドシン発現ニューロンの光誘起発火は、in vivo、電気生理学、および行動研究に基づいて評価できます。

ガイドカニューレのような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、光ファイバーの繰り返しの挿入と取り外しによって引き起こされる脳組織への損傷を最小限に抑えることです。この方法は、神経回路の機能に関する洞察を提供するだけでなく、特定の種類の神経疾患の根底にあるシナプスと回路依存性のメカニズムをよりよく理解するために、他のシステムにも適用できます。この手法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。

移植ステップを習得するのは難しいため、一見小さなステップごとに、メソッドの全体的な安定性と信頼性に大きく貢献します。まず、直径 125 ミクロンの光ファイバーを 100 ミクロンのコアで 35 mm 切断します。まず、ウェッジ チップの超硬スクライブを光ファイバーに垂直に配置し、1 回の一方向動作でファイバーにスコアを付けてからまっすぐ引き出します。次に、直径127ミクロンのlcセラミックフェラルを直径ボアの凸面を下向きにしてバイスに挿入し、光ファイバー片をフェラルに挿入します。

光ファイバーは、滑らかにスライドし、野生の凸端を超えてわずかに突き出ている必要があります。次に、新たに調製した熱硬化型光ファイバーエポキシを1滴フェラルの平らな端に塗布し、次にエポキシにヒートガンを塗布します。エポキシは、加熱されると野生を満たし、黒くなると硬化するはずです。

硬化後、野生の側面からエポキシをきれいにし、次にlc光ファイバー研磨ディスクを使用して、4つの減少グレードの研磨パッド上の酸化アルミニウム研磨シートに野生の野生の凸端を研磨するための円形回転パターンを作成します。次に、平らな端の光ファイバーを、関心領域をターゲットにするための適切な長さに切断します。研磨された光ファイバーをテストするには、インプラントの研磨された端をカプラーのスリーブに挿入します。

対向する野生との直接接触が感じられるまで、悪いインプラントは光ファイバーの先端近くに弱い焦点を持ちますが、良いインプラントは出力なしで滑らかな同心円の光を透過します。最大10ミリワットの電力で、完成したインプラントは使用時までフォームに蓄えられます。この手順を開始するには、直径 220 ミクロンの光ファイバーと 200 ミクロンのコアを測定してスコアリングし、マウスが自由に動くようにしますが、マウスがファイバーを噛むことはできません。

次に、光ファイバーを、光ファイバーの内径がわずかに大きく、長さが光ファイバーよりもわずかに短いフューレーションチューブに挿入します。次に、光ファイバーの一方の端から約25ミリメートルを剥がし、マルチモードFCMM野生アセンブリの金属端に挿入します。直径230ミクロンの穴が止まるまで、光ファイバーは野生の端から突き出ているはずです。

次に、金属端でシアノアクリレートとの接続を固定し、コネクタで接続を覆います ブーツ研磨 フェラル端をFC研磨ディスクで研磨します。光ファイバーのもう一方の端を剥がした後、凸端の遠位だけを使用してlcセラミックフェラルに挿入します。次に、平らな端にエポキシを一滴垂らし、示したように硬化するまで加熱します。

先ほど示したように野生の凸端を研磨した後、野生がスリーブの中点に達するまで、lc野生スリーブを野生の凸端にスライドさせます。次に、熱収縮チューブをエーションチューブとスリーブの上に置き、熱収縮チューブを加熱して接続を固定して保護します。最後に、レーザー光源に野生を接続し、次に分光光度計でカプラーを介して光出力を測定してテストし、レーザー出力と測定されたカプラー出力との間の光損失は、手術を開始する前に30%を超えてはなりません。

手術部位をisopプロファイルアルコールで消毒し、続いてクロルヘキシジン溶液で消毒します。次に、マウスを定位固定装置に置き、頭蓋骨が水平になるように頭を固定します。動物の目に眼軟膏を塗布して、乾燥や術後の痛みを防ぎます。

次に、頭皮の正中線を切開して、頭蓋骨を眼窩からラムダ縫合糸に露出させます。セラフィンクランプを使用して皮膚を抑え、頭蓋へのアクセスを維持します。次に、デンタルピックを使用して、頭蓋骨の表面全体に市松模様をエッチングします。

生じた破片を滅菌生理食塩水で洗い流します。十分に乾燥させた後、綿棒を使用して、露出した頭蓋骨に3%の過酸化水素を約2〜3秒塗布して、微細孔を作成します。次に、頭蓋骨をより滅菌生理食塩水で複数回洗い、完全に乾かします。

エッチング、チェッカーボードパターンの洗浄、乾燥を頭蓋骨に再度、光ファイバーの野生インプラントをプローブホルダーに挿入し、それを脳定位固定アームに接続します。bgmaおよびlambdaに調整された定位アトラスを使用して、バーの穴の位置を決定します。次に、回転式デンタルドリルを使用して、硬膜を壊したり組織を損傷したりしないように注意しながら、関心のある領域から直径1ミリメートル未満の小さなバーホール開頭術を行います。

脳定位固定装置アームを使用して、インプラントを関心のある領域の真上に配置することで、野生は周囲の頭蓋組織に載せる必要があります。次に、滅菌爪楊枝を使用して、新たに準備した歯科用セメントの薄く均一な層を頭蓋骨全体とインプラントの下部に塗布します。動物の皮膚に触れないように注意しながら、歯科用セメントの基層は頭蓋骨の表面をできるだけ覆う必要があります。

この手順の最も難しい側面は、歯科用セメントが腫瘤の皮膚に触れずに塗布することです。成功を確実にするには、一度に少量のセメントを薄い層に塗布し、各層が完全に乾くのを待ってから次の層を追加します。デンタルセメントの均一な層を適用して、頭蓋骨の上部とインプラントの周りに小さなマウンドを形成します。

野生の凸端の3〜5ミリメートルをセメントのきれいなままにして、スムーズで遮るもののない接続を可能にします。次に、頭皮を歯科用セメントの山の上とインプラントの周りで縫合し、獣医用接着剤接着剤を縫合後の追加結合に使用できます。最後に、局所鎮痛薬と抗生物質を縫合糸の皮膚とインプラントの基部の周りに適用し、マウスをケージに入れて術後の回復を図ります。

光ファイバーインプラントとカプラーを適切に組み立てると、関心領域の光源と光ファイバーの端との間の光子損失が最小限に抑えられます。磨かれた光ファイバーは、この画像で見られるように、ここに示されている円と同様の均一な同心円で光を透過するはずですが、慎重な移植と縫合により、インプラントはマウスに目に見える刺激を引き起こさず、光ファイバーの著しい劣化なしに、または透過する光の量に対して長期的な研究のために所定の位置に留まることができます覚起したマウスの機能的行動アッセイは、刺激からの直接応答を示していますこのin vivo電気生理学ビデオデータによって証明されるように、運動皮質上に埋め込まれた光ファイバーを介して、インプラントを介した標的ニューロンの活性化と脳刺激中の動物の行動応答を示します。この手順に続いて、標的細胞に関連する回路接続のパターンは何かなどの追加の質問に答えるために、標的脳領域の光刺激などの他の方法を実行できますか?

このビデオを見れば、光ファイバーインプラントとカプラーコードの組み立て方、および光遺伝学的ポーターを発現する脳組織にそれらを埋め込む方法についてよく理解できるはずです。