細胞培養のための人間の削減乳房形成や乳房切除組織の処理

このプロトコルは、関連する乳腺間質細胞を含まない乳腺の上皮部分を分離することを目的としています。酵素消化を使用して上皮構造を濃縮するために、外科的廃棄材料の未収解剖から始めます。基底膜の外側の間質材料から上皮オルガノイドを分離します。

次に、消化されたオルガノイドを固定された細孔サイズの細胞ストレーナーで処理し、濃縮画分を取得します。オルガノイドに播種してすぐに培養するか、ストックを凍結して将来の使用に備えます。最終的に、上皮オルガノイドは、正常なヒト乳腺上皮細胞の長期培養物を生成するために使用されます。

私がこの方法を開発したのは、1970年代後半にヒト上皮細胞生物学と発がんの分野を発展させるためでした。正常なヒト記憶組織からの豊富な外科的廃棄材料が利用可能であった。必要だったのは、このバルク不均一材料を純粋な上皮細胞培養に適したものに処理する方法と、長期的な成長をサポートするための培地でした。

この方法の視覚的なデモンストレーションは、特に粗解剖の方法に注意するのに役立ちます。適切に消化されたオルガノイドとはどのようなものでしょうか?オルガノイドをろ過し、オルガノイドを培養用にプレーティングします。

この技術の利点は、間質にきれいな上皮画分を提供し、上皮細胞が無傷のままであることです。私たちが発見したオルガノイドは、最高の初期成長をもたらし、得られる細胞の数を最大化します。ローレンスバークレー国立研究所の2人の科学者、ジェームズ・ガーベイとマーク・ルバージは、この手順をデモンストレーションします 外科的処置の廃棄された材料から。

緩衝液または完全な培地と抗生物質を摂氏4度で含む滅菌容器でヒト乳腺組織を入手します。ティッシュの断片を切り取り、大きなガラスの滅菌皿に入れます。上皮領域を脂肪組織、結合組織、血管の間質マトリックスから分離します。

黄色い間質マトリックスに埋め込まれた上皮領域の白い鎖を静かに解剖します。鉗子で材料を保持し、メスでひどく脂肪の多い材料をこすり落とします。次に、反対側のメスで上皮組織を約4ミリメートルに切断して消化を促進します。

解剖した上皮組織を、重繊維性の組織で50ミリリットルまたは15ミリリットルの円錐形遠心分離管に移します。より固体の白い非上皮材料があります。そのような繊維状マトリックスから上皮細胞を解剖するのが難しい場合。

組織は1〜3ミリメートル四方の領域にカットし、別々に消化することができます。粗コラゲナーゼと高アルル日を含む消化培地をチューブに充填し、回転中に混合できるように小さな空域を残します。サンプルを摂氏37度で一晩インキュベートし、分解後8RPMで360度回転させます。

サンプルを600 Gの遠心分離で5分間ペレット化します。上清の脂肪と培地は、人体組織の処分に関する施設のガイドラインに従って廃棄します。組織の消化をモニターするには、ペレットの小さなEloquaを培地で希釈し、完全に消化されたオルガノイドで顕微鏡で調べると、間質が付着していることがわかります。

組織が純粋なオルガノイドに完全に消化されるまで、酵素による消化を繰り返します。2回目の一晩の消化が必要な場合は、過剰消化を防ぐために酵素の濃度を下げる必要があるかもしれません。適切に消化されたオルガノイドは、滑らかに見える管状肺胞または付着した間質のない管状肺胞構造を示します。

消化が完了したら、最終ペレットを中位の抗生物質で懸濁します。分解したサンプルをクワットで滅菌した100ミクロンのストレーナーに通し、滅菌した50ミリリットルのチューブに通します。培地がチューブに排出されたら、オルガノイドを3ミリリットルの培地で洗浄します。

再懸濁したペレットがすべて移送されるまで繰り返します。次に、フィルターを滅菌チューブ上で慎重に裏返し、オルガノイドをさらに培地でチューブに洗います。これが100ミクロンのオルガノイドプールです。

次に、元の50ミリリットルのチューブに排出された材料を40ミクロンのストレーナーに通して、単一細胞の濾液プールと間葉系および上皮細胞の小さな塊、および血管組織の小片から肺胞構造を分離します。100ミクロン、40ミクロン、600Gの濾液プールを5分間遠心分離します。1ミリリットルのccpmを使用して各サンプルを再構成します。

パックされた口蓋の0.1ミリリットルあたり2つの凍結溶液。摂氏4度に保ちます。2つのオルガノイドプールのそれぞれを慎重に0.1ミリリットル置きます。

1つまたは2つの35ミリメートル皿に均等に分布するように、一滴ずつ。オルガノイドを付着させてから数分後に皿の表面を傷つけないようにしてください。オルガノイドが外れないように、成長培地をゆっくりと追加します。

次に、加湿したCO2インキュベーターで初代培養物を摂氏37度でインキュベートします。また、濾液プールの0.1ミリリットルを線維芽細胞培地で組織培養プラスチックに直接播種します。初代培養物を加湿CO2インキュベーターで摂氏37度でインキュベー

24〜48時間後、オルガノイドからの細胞移動を確認し、2〜3日後に有糸分裂伸長培養をモニターします。細胞はほぼ合流点まで、2〜3日ごとに培地を補充します。血管系の小片が付着し、線維芽細胞の成長を引き起こす可能性があります。

著しい線維芽細胞の成長の場合。大きな上皮パッチから線維芽細胞を除去するために、ディファレンシャルトリッピン化を行います。細胞をSTEバッファーで一度洗浄します。

次に、新鮮な0.5ミリリットルのSTEを追加して、連続的な顕微鏡観察と硬い表面に対する皿の穏やかで鋭いノックで皿を覆います。上皮細胞がまだ付着している間に線維芽細胞の剥離を探します。上皮成長のパッチが合流点に近づいているときの一次培養。

一次培養を保持し、複数の二次培養を生成するには、部分的なトリプシンを使用します。細胞をSTEバッファーで一度洗浄し、次に新しいSTEを皿を覆うために加えます。細胞の約50%が剥離したことを監視します。

次に、増殖培地を含む血清を2ミリリットル加え、細胞を採取します。次に、2回の洗浄後に細胞を滅菌済みの15ミリリットルチューブに移します。採取した細胞をプールして培養する部分化は、一次皿からの良好な細胞再増殖と、継代培養または凍結二次細胞からの同等の長期増殖により、約4〜8回繰り返すことができます。

最初の部分的なトリプシン化の細胞を凍結して保管し、2回目のPTの細胞を継代培養に使用することをお勧めします。組織が適切に消化され、ろ過されると、オルガノイド、乳管および肺胞の構造を示すオルガノイドが、付着した間質のない滑らかなエッジで見られます。消化が不十分な場合、材料が付着し、消化しすぎると線維芽細胞の汚染が多くなり、オルガノイドの付着後の端が粗くなり、付着効率が低下します。

上皮の成長は、48時間で72時間から48時間以内に始まります。72時間までに目に見える有糸分裂を伴う活発な細胞分裂はまだありません。有糸分裂はより目立つようになるはずです。

血管系の小片は、4日後に間葉系細胞の増殖の原因となる可能性があります。上皮増殖は、ここでケラチン14およびケラチン19に対する抗体で染色すると、形態学的に不均一な集団を示し、緑色のK 19陽性の管腔と赤色のK 14陽性の筋上皮系統、および黄色のK 14陽性のK 19陽性前駆細胞を示します。HMECは、さまざまな培地製剤で培養できます。

コレラ毒素とオキシトシンを添加したM 87 aなどの低ストレス培地は、正常な停滞前のHMECの優れた長期成長と、複数のHMEC系統の成長をサポートします。ファクト分析の結果は、未培養オルガノイドと第4継代では、M 87、A培地で培養されたHMECの系統の多様性を示しています。ここでは、管腔および筋上皮集団は、管腔マーカー、EPCAおよびCD2 27、ならびに筋上皮マーカーCD49FおよびCD10の再メッキの発現によって同定される。

第4通路、HMEC。以前の管腔マーカーと筋上皮マーカーについて濃縮された事実は、ケラチンK 14およびK 19 HMECの免疫蛍光分析を使用して系統が確認されています。継代4までプラスチックで培養すると、in vivoのように組織化された構造を形成することができ、適切なCD2、27およびCD10に配置すると、管腔細胞と筋上皮細胞の関係がこれら2つの系統を濃縮するために使用されます。

HMCは、管腔細胞から筋上皮細胞の内部にあるマイクロパターン化された3Dマイクロウェルで適切な3D細胞組織を形成する能力を保持しています。事実:富裕層の前駆細胞は、マトリゲルに播種すると、管状および肺胞構造を模倣して堅牢な3D構造を形成することもできます。マトリゲルの3D構造も適切な3D自己組織化を示しています。

このビデオを見た後、関連する乳腺間質のない乳腺の上皮部分を浄化する方法をよく理解しているはずです。一度習得すると、このテクニックは2〜3日かけて行うことができます。組織処理の技術は一般的に簡単です。

正しいポイントで消化を止めることを忘れないようにすることが重要です。