Name: 成長中の軸索に沿ってマウスのシュワン細胞の発達を分析する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: 学ぶマウスシュワン細胞の発達解析法。頸上神経節をコラーゲン基質に培養し、NGF処理で軸索伸長を誘導し、タイムラプスイメージングで細胞移動を観測します。自然環境下での神経再生メカニズムの理解に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

私たちは、優れた技術支援のためにコラーゲンプロトコルとユッタ·フェイとウルスラヒンツを共有するためのUrmas Arumaeに感謝したいと思います。さらに我々は親切にビデオshotingのヘルプのためにクリスチャン·F·アッカーマン、ウルリケ·エンゲルとハイデルベルク大学のニコンイメージングセンターともヨアヒムキルシュに感謝したいと思います。研究の一部はドイツ学術振興（SFB 592）を通じて資金を供給された。

1。コラーゲンゲルの調製<ol><li> 455μlの10倍、MEM、112μlの7.5パーセントのNaHCO 3、50μlのグルタミンおよびNaOHを含む、株式媒体を準備します。濃度とNaOHの量は、ラット尾コラーゲン製剤（1.2参照）、1,000μlのある株式媒体の最終容量に依存します。 </li><li> Ebendal（1）に記載のラット尾部コラーゲンを準備します。 4℃のコラーゲン溶液を保存コラーゲン溶液の劣化を観察することができなかった。新しいバッチを調製した後、株式培地（1.1参照）に必要なNaOH濃度を推定する。 NaOHの量と濃度の滴定のための媒体のpHインジケーターを使用しています。 800μlの酸性ラット尾コラーゲンは、株式の培地210μlの混合赤の影を有効にする必要があります。 NaOHの濃度が低すぎるとコラーゲン溶液は、培地のpH指示薬により、黄色に変わります。突くことなく、メディアとのミックスにコラーゲンを追加気泡をucing。氷の上でこれらの手順を実行します。重合は、コラーゲン溶液と株式媒体を混合した後、2時間以内に発生し、新しい溶液を37℃でインキュベートする。実験を開始する前にこれをテストします。 1.3）（1.2参照）在庫培地210μlでコラーゲン溶液800μlを混合します。 8ウェルチャンバースライドのウェル中にこの溶液100μlを置きます。 37でスライドをインキュベート℃、5％CO 2、および細胞培養インキュベーター中で湿気のある条件。細胞培養ベンチ、無菌条件下でコラーゲンゲルを準備します。コラーゲンは、2時間以内にgelatinizes。 </li></ol> 2。胚SCGsの解剖<ol><li>子宮からの時間妊娠中のマウスの収穫胚（E16-18）し、さらに、必要になるまでそれらをPBS中に入れておきましょう。 </li><li>羊膜から1つの胚を解剖。鎖骨レベルの胚の尾の首を。 &quot;昆虫針&quot;を持つシリコンボトムディッシュ上でヘッドを固定します。頭の腹側はあなたに直面しているあなたは顎下領域を参照してくださいする必要があります。d。固定は簡単に準備できるようになります。 </li><li>左と右の顎下領域およびそれとの皮下結合組織の皮膚を取り除きます。 </li><li>舌、infrahyoidal筋肉や胸鎖乳突筋の上にビューをクリアするために、その場所から顎下唾液腺を削除します。 </li><li>喉頭と気管の上にビューをクリアするために慎重にこれらの筋肉を削除します。気管および喉頭を削除します。頚動脈はその後椎前筋の両側に表示されます。 SCGは、頸動脈の分岐点に位置し、楕円形の形状を有している。慎重に神経を除去し、PBS中に置いてください。彼らはそれらに付着している場合は切開ツールから優しく神経を取り除きます。それは、鉗子と同様SCGを除去するための &quot;昆虫針&quot;が搭載された針ホルダーを使用することは有益である。 </li><li>あなたはenouを解剖するまで一度PBS中、PBS中で室温で神経を保存GH神経節。その後、血管や結合組織から神経をきれいにしてください。層流ベンチ下に置かれた解剖顕微鏡下SCG切開とクリーニングを行ってください。 </li><li>最後に、扱いやすくするために注射器に搭載された注射針の助けを借りて、ゼラチン化したコラーゲンゲルに外植神経を配置します。 </li><li> 5％CO 2の湿潤な条件で、37℃で細胞培養インキュベーター中で糊化コラーゲン上SCG外植片をインキュベートする。 </li></ol> 3。 SCG外植片の治療<ol><li> 1〜2時間のインキュベーション後、B27サプリメント、グルタミンおよび抗生物質を含む100μlNeurobasal細胞培養培地とSCG植含むコラーゲンをカバーしています。今チャンバースライドのウェルは200μl（100μlのゲルと100μlの培地）のボリュームが含まれています。しかし今では軸索の成長を促進するために、NGF（60 ng / mlで）を含む、媒体の別の200μlを添加する。従って最終NGF濃度は30 ng / mlである。 </li><li><ol class="lalpha"><li> SCの移行の発症を調査するために、in vitroで 0（DIV0） で一日に直接追加の要因を追加します。 （2）必要に応じて二重濃度のNGF含有する培地中での要因を溶かす。 </li><li>すでに軸索に沿って移行開始のSCへの影響を分析するために、DIV4（実験の潜在的な停止）までDIV3で付加的な要因を追加します。この目的を達成するために、慎重にDIV3では、溶液の180μlを削除し、NGFとダブル濃度（2）で興味のある付加的な要因を含む200μlの新しいメディアを追加します。 </li></ol></li></ol> 4。タイムラプスイメージング分析用倒立顕微鏡を使用しています。種々の目的は、ビューと倍率のフィールドを定義し、使用することができます。 SCG植片のイメージングは​​スライドガラスとコラーゲンを介して行われるように1つの重要な側面は、しかし、使用目的の作動距離であるゲル。 1/10-30分の録画フレームレートは良好な結果（2）を示した。しかし、この側面は、科学的な疑問に調整する必要があります。通常のCCDカメラは、画像取得のために使用することができます。タイムラプスイメージングのための細胞培養インキュベーションチャンバーは、顕微鏡のステージに取り付けなければならない。 5％CO 2の湿潤な条件で、37℃で撮像中に組織をインキュベートする。撮影開始前培養システム一時間を開始します。これはチャンバースライドを含む顕微鏡部品（ 例えば、対物）の温度に調整することができ、温度ドリフト誘発を防ぐことができます。顕微鏡ソフトのヘルプやSCG外植片に異なる印加条件の同時分析のためのソフトウェア制御の電動ステージ（マルチポジションの設定）に分析の特定の領域を（外植片に内および異なる外植片の間）を定義します。使用することができるタイムラプスイメージング野生型組織だけでなく、トランスジェニック動物からの組織のために（3）：SCS（GFP S100B）をマーキング。イメージング蛍光団のための蛍光光源はmicropscopeセットアップで実装する必要があります。標準のフィルタを使用します。 5。 SCの移動距離の定量化<ol><li>エンドポイント（例えばDIV4）で、3〜4時間のためのチャンバースライドに4％PFAでコラーゲンゲルを固定します。連続してPBSで10分間コラーゲンゲルを5回洗浄する。免疫細胞化学（2）のための標準的なプロトコルを適用します。あなたはSCGsの準備を初めて使用する場合は、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）カテコールアミン細胞に共通のマーカーに対する免疫組織化学による交感神経節と節の身元を確認します。免疫組織化学（一次抗体後）の間に、ゲルを洗浄するために有益であるより大きな体積を有する24ウェルプレートにコラーゲンゲルを含む植を転送します。 </li><li>免疫組織化学の後、スライドガラス上にコラーゲンゲルを慎重に置きます。慎重に残りの溶液を除去し、コラーゲンが乾燥/二次元に縮小することができます。これは、距離（2）の容易な測定を可能にする。この後、サンプルをマウントします。 </li><li>最後に、フィジー（NIH）のソフトウェアの助けを借りて移動距離を測定します。は、特別なプラグインはこの目的を達成するために必要ではありません。 μm単位の正確な測定を可能にするには、正しい画像のメタデータとフィジーの下の設定、画像やスケールを確認してください。細胞の定量化のためにもフィジーを使用しています。 </li></ol>

<ol><li>Ebendal, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEbendal%2C+T+%22Use+of+collagen+gels+to+bioassay+nerve+growth+factor+activity%22">Use of collagen gels to bioassay nerve growth factor activity</a>. Rush, R. A. IBRO Handh, John Wiley & Sons Ltd. (1989).</li>
<li>Heermann, S., SchmÃcker, J., Hinz, U., Rickmann, M., Unterbarnscheidt, T., Schwab, M. H., Krieglstein, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin+1+type+III%2FErbB+signaling+is+crucial+for+Schwann+cell+colonization+of+sympathetic+axons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Neuregulin 1 type III/ErbB signaling is crucial for Schwann cell colonization of sympathetic axons.</a> PloS One. 6 (12), e28692(2011).</li>
<li>Zuo, Y., Lubischer, J. L., Kang, H., Tian, L., Mikesh, M., Marks, A., Scofield, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+expressed+in+mouse+transgenic+lines+mark+subsets+of+glia%2C+neurons%2C+macrophages%2C+and+dendritic+cells+for+vital+examination%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience.+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination.</a> The Journal of Neuroscience. The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24 (49), 10999-11009 (2004).</li>
<li>Levi-Montalcini, R., Booker, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EXCESSIVE+GROWTH+OF+THE+SYMPATHETIC+GANGLIA+EVOKED+BY+A+PROTEIN+ISOLATED+FROM+MOUSE+SALIVARY+GLANDS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">EXCESSIVE GROWTH OF THE SYMPATHETIC GANGLIA EVOKED BY A PROTEIN ISOLATED FROM MOUSE SALIVARY GLANDS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 46 (3), 373-384 (1960).</li>
<li>Meintanis, S., Thomaidou, D., Jessen, K. R., Mirsky, R., Matsas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuron-glia+signal+beta-neuregulin+promotes+Schwann+cell+motility+via+the+MAPK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The neuron-glia signal beta-neuregulin promotes Schwann cell motility via the MAPK pathway.</a> Glia. 34 (1), 39-51 (2001).</li>
<li>Yamauchi, J., Miyamoto, Y., Chan, J. R., Tanoue, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ErbB2+directly+activates+the+exchange+factor+Dock7+to+promote+Schwann+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">ErbB2 directly activates the exchange factor Dock7 to promote Schwann cell migration.</a> The Journal of cell biology. 181 (2), 351-365 (2008).</li>
<li>Anton, E. S., Weskamp, G., Reichardt, L. F., Matthew, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor+and+its+low-affinity+receptor+promote+Schwann+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor and its low-affinity receptor promote Schwann cell migration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2795-2799 (1994).</li>
<li>Mahanthappa, N. K., Anton, E. S., Matthew, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+growth+factor+2%2C+a+soluble+neuregulin%2C+directly+increases+Schwann+cell+motility+and+indirectly+promotes+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial growth factor 2, a soluble neuregulin, directly increases Schwann cell motility and indirectly promotes neurite outgrowth.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 16 (15), 4673-4683 (1996).</li>
<li>Yamauchi, J., Chan, J. R., Shooter, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+regulate+Schwann+cell+migration+by+activating+divergent+signaling+pathways+dependent+on+Rho+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins regulate Schwann cell migration by activating divergent signaling pathways dependent on Rho GTPases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (23), 8774-8779 (2004).</li>
<li>Gumy, L. F., Bampton, E. T. W., Tolkovsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycaemia+inhibits+Schwann+cell+proliferation+and+migration+and+restricts+regeneration+of+axons+and+Schwann+cells+from+adult+murine+DRG%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Hyperglycaemia inhibits Schwann cell proliferation and migration and restricts regeneration of axons and Schwann cells from adult murine DRG.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 37 (2), 298-311 (2008).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., Kurokawa, H., Morimura, T., Hanyu, A., Hama, H., Osawa, H., Kashiwagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li>
<li>Park, D., Don, A. S., Massamiri, T., Karwa, A., Warner, B., MacDonald, J., Hemenway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+cell+death+using+an+Hsp90+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of cell death using an Hsp90 ligand.</a> Journal of the American Chemical Society. 133 (9), 2832-2835 (2011).</li>
<li>Shcherbo, D., Souslova, E. A., Goedhart, J., Chepurnykh, T. V., Gaintzeva, A., Shemiakina, I. I., Gadella, T. W. J., Lukyanov, S., Chudakov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+and+reliable+FRET%2FFLIM+pair+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins.</a> BMC Biotechnology. 9, 24(2009).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

末梢神経系の発達は、エキサイティングなプロセスです。開発が完了すると、軸索は、ヒトでは、多くの場合100 cm以上であることができます全体の長さに沿って、SCSによってensheathedされています。この目的を達成するために必要なSCの正しい数はまた、完全な軸索のカバレッジを確保するため、周囲に伸びる軸索に沿って移動しなければならない開発およびSCの間に確立されてきました。これは、有髄のためだけでなく、unmeylinated軸索にも当てはまります。どちらの場合も、すべての軸索は、SCSと接触しており、彼らのサポートに依存しています。 SCの開発を研究するために、アッセイは考慮軸索コンパートメントを取るため、スクラッチアッセイ（5）、ボイデンアッセイ（6）またはチャンバーアッセイを行うことができますより良い程度に生体模倣開発に必要とされる。いくつかのアッセイでは軸索の区画は既に考慮された。例えば坐骨神経のセクションが移行するSCのためのルートとして使用した（7,8）に沿って、またはSCは彼らが移行す...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> 10xのMEM </td><td>ギブコ</td><td> 21430 </td><td></td></tr><tr><td>炭酸水素ナトリウム（7.5％） </td><td>ギブコ</td><td> 25080 </td><td></td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>ギブコ</td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> NaOHを</td><td>メルク</td><td> 109137 </td><td></td></tr><tr><td> NGF </td><td>ロッシュ</td><td> 1058231 </td><td> R＆Dの＃556-NG-100 </td></tr><tr><td> Neurobasal培地</td><td>ギブコ</td><td> 21103 </td><td></td></tr><tr><td> B27サプリメント</td><td>ギブコ</td><td> 17504 </td><td></td></tr><tr><td>抗生物質</td><td>ギブコ</td><td> 15640 </td><td></td></tr><tr><td> D-PBS </td><td>ギブコ</td><td> 14040 </td><td></td></tr><tr><td>昆虫針</td><td> FST </td><td> 26002から20 </td><td></td></tr><tr><td>注射針</td><td>ブラウン</td><td></td><td> BD＃300013 </td></tr><tr><td> 8穴のチャンバースライド</td><td>ラボTEK </td><td> 177402 </td><td></td></tr></tbody></table>

成長中の軸索に沿ってマウスのシュワン細胞の発達を分析する

Analyzing Murine Schwann Cell Development Along Growing Axons

末梢神経の開発は魅力的なプロセスです。ニューロンはヒトで100以上の30cm離れニューロンの細胞体からしばしば具体的な目標を、支配する軸索を送る。開発中の神経細胞の生存は、対象由来成長因子でなく、シュワン細胞（SCS）のサポートに依存します。この目的を達成するために神経細胞体の地域（または中枢から末梢神経系への移行）のSC ensheath軸索シナプスや神経筋接合部へ。シュワン細胞は神経堤の誘導体であり、全体の軸索は、SCSで覆われるまで、新興の軸索に沿って前駆体として移行されます。これは、末梢神経系の開発のためのSCの移行の重要性を示しており、このプロセスを調査する必要性を強調している。 SCの発展を分析するために、設定も移行のためのそれらの生理学的基質、軸索を含むSCの隣に必要とされる。子宮内の開発による<emは&gt;生体タイムラプスイメージングでは、しかし、マウス（ ハツカネズミ ）のような胎盤の脊椎動物には不可能である。これを回避するために、我々は上頸神経節（SCG）植技術を適応した。神経成長因子（NGF）を用いた治療に基づいたSCG外植片は神経節から周囲に軸索に沿って移行SCの前駆続いて軸索を伸ばす。このシステムの利点は、SCが内因性SCのプールから、それらが同時に成長している自分自身の生理的な軸索に沿って移行することに由来していることです。軸索に沿ってSCの開発がSCの移行についての洞察を得るために更なる可能性を開いて、タイムラプスイメージングによって解析することができるので、このシステムは、特に興味をそそられる。

軸索の成長は、NGF（4）（映画スキームS1は図1方式）を用いた治療により植片をSCGから促進される。このプロセスは、倒立顕微鏡で簡単に表示され、タイムラプスイメージング（ムービーS2）を続けることができます。科学者がマウス胚からSCGを解剖で新たに追加された場合、我々は強くシンプルな抗チロシンヒドロキシラーゼ（TH）免疫組織化学によって手法の妥当性検査をお勧めします。 THは、カテコールアミン作動性ニューロン（このケースでは交感神経ニューロン）のための一般的なマーカーであるとラベルの軸索（ 図2B）も行います。これにより軸索の長さは、このシステム（2）で解析することができます。 軸索成長が誘導された後に重要なのは、遊走細胞の波が（映画S2およびS3）を観察することができる。遊走細胞はS100の免疫陽性のサウスカロライナ（2）として検証されています。 GFPは人間S10の制御下にあるだけでなく、トランスジェニックマ...

ここでは、SCが伸びる軸索に沿って開発することができますているシュワン細胞（SC）の遊走アッセイを記述します。

The  development of peripheral nerves is an intriguing process. Neurons send out  axons to innervate specific targets, which in humans are often more than ...

次の実験の目的は、成長する軸索に沿ったシュワン細胞の発達、つまりその自然な生息地を分析することです。これは、第 1 のステップとして、マウス胚の ex explan 上頸神経節、または S cgs をコラーゲンマトリックス上に投与することによって達成されます。S cgは、SCGニューロンからの軸索成長を冠状に促進する神経成長因子またはNGFで治療されます。X explanからの軸索成長に加えて、内因性シュワン細胞が拡張された軸索に沿って末梢に向かって移動するのを観察できます。シュヴァン細胞の発生は、タイムラプスイメージングによる解析や、固定組織のエンドポイント解析による解析が可能で、距離測定が可能です。この手法がスクラッチマイグレーションアッセイなどの既存の方法よりも優れている主な点は、白鳥細胞の自然な生息地がこのアッセイに含まれていることです。この手法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。コラーゲンメトリクスの正しい組み立てとsgsの正しい解剖が成功の鍵となるからです。これらの手順を学ぶのは特に難しくありません。まずは練習が必要です。組織培養フードで作業しながら、氷上のすべての溶液で私たちの条件を理解しました。ストック培地とラットテールコラーゲンを、書面によるプロトコルの指示に従って調製します。800マイクロリットルのラットテールコラーゲンと210マイクロリットルのストック培地を混合します。気泡を導入しないで、溶液は赤色のままであるべきです。溶液が黄色に変わった場合、ラタールコラーゲン溶液は酸性が強すぎるため、高濃度の水酸化ナトリウムピペットで溶液をマルチウェルスライドの各ウェルに100マイクロ放出して作り直し、各ウェルの底が完全に覆われていることを確認してください。摂氏37度、二酸化炭素5%に設定された加湿組織培養インキュベーターに皿を2時間入れます。収穫後、E 16 から E 18 の胚を PBS を含むシャーレに入れ、羊膜から解剖し、鎖骨 C のレベルで斬首します。次に、頭頸部領域をシリコンボトムディッシュに移し、解剖顕微鏡で観察しながら、昆虫針を使用して組織を顎下領域と鎖骨領域に固定します。次に、鉗子を使用して、顎下領域の皮膚と皮下組織を取り除きます。次に、顎下唾液腺を切除して、舌骨上筋、亜頓骨筋、胸鎖乳突筋を露出させます。次に、鉗子を使用して、肺門下筋と胸鎖乳突筋を慎重に取り除き、喉頭と気管を明らかにします。鉗子で気管をつかみ、気管と喉頭を持ち上げます。喉頭と気管が取り除かれると、頸動脈が見え、椎前筋の両側になります。上頸神経節は頸動脈の分岐部に位置し、楕円形として識別できます。鉗子と昆虫針が取り付けられたニードルホルダーを使用して上頸神経節を取り出し、PBSが入った新鮮な皿に入れてから、神経節から血管または接続された組織を解剖します。シリンジ針の助けを借りて、ゼラチン化されたコラーゲンゲルをインキュベーターから取り出し、シリンジに取り付けられたシリンジ針を使用して神経節をゲルに移します。外植片を摂氏37度に設定された組織培養インキュベーターに5%の二酸化炭素と湿度の高い条件で1〜2時間置きます。1〜2時間のインキュベーション後、上頸神経節外植片を組織培養インキュベーターから取り出し、B 27サプリメントグルタミンおよび抗生物質を含む100マイクロリットルの神経基礎培地を各x説明に加える。続いて、ミリリットルあたり60ナノグラムを含む200マイクロリットルの神経基礎培地。NGFは、軸索の成長を促進するためにウェルにも追加されます。このとき、すでに移動を開始した白鳥細胞への影響を研究するために、in vitro zeroの日として定義される試験物質も追加される場合があります。軸索物質は、既存の培地から180マイクロリットルを取り出し、対象物質とNGFを含む200マイクロリットルの培地に最終濃度の2倍の時間で交換することにより、in vitroで3日間投与できます。倒立顕微鏡装置を使用してタイムラプスイメージングを行い、並行細胞培養インキュベーションとタイムラプスイメージングを可能にし、異なる試験物質を比較します。ある実験では、実験の終点にマルチポジション設定をお勧めします。培養スライド内の外植片を4%PFAで3〜4時間固定し、PBSで洗浄した後、免疫組織化学を実行してX外植片を検証し、SCGが10%正常ロバ血清と2%トリットンX 100を含むPBSで組織を2時間ブロックします。その後、一次抗体をブロッキング溶液中で一晩インキュベートします。一次抗体インキュベーションの翌日、PBSで洗浄した後、X explanを含むゲルを24ウェルプレートに移し、光から保護しながら蛍光標識二次抗体と2時間インキュベートした後、PBSで洗浄し、ダッピー溶液で10分間インキュベートします。数回洗浄した後、X explanを含むコラーゲンゲルを顕微鏡に置き、スライドさせ、スライドを乾燥させ、その後子牛肉にマウントします。標準的な蛍光顕微鏡を使用して、後で定量分析するための画像を取得します。顕微鏡ソフトウェアがメタデータを記録できると便利です。得られた画像の定量分析は、フィジーまたはImageJソフトウェアで行うことができ、科学的な用途に無料で使用できます。この動画では、SCGX EXPLANの概略的なSCGX EXPLANによる4日間のin vitroでの軸索成長が実証されています。免疫組織化学は、外植神経節を明確に同定するために、in vitroで4日目に実施できます。交感神経節として、シュワン細胞は軸索に沿って移動し、上頸神経節から末梢に移動するのを観察できます。このビデオは、高倍率で見たものと同じ移行パターンを示しています。DPIを用いた核の対比染色試料で遊走距離を容易に測定できる 回路図に示されているように、主要なシュワン細胞の核から複数の場所での外植SCGの境界までの距離を測定することができ、DPI標識NGF処理サンプルの画像であるin vitroでの4日間の画像では、SCG説明の境界でのシュワン細胞の遊走を示しています。明視野と蛍光の組み合わせにより、S 100 GFP陽性白鳥細胞と軸索の可視化が可能になります。最後に、この映画は、上頸神経節exの説明の境界でのシュワン細胞の移動を示しています。ここでは蛍光チャンネルのみが示されており、S 100 GFP陽性シュワン細胞の解釈が容易になります。この手順に続いて、1つの細胞増殖の定量化や1つの細胞アポトーシスの定量化など、追加の定量分析を行うことができます。もちろん、エンドポイント分析には適切な免疫組織化学を実施する必要があります。または、特定のトランスジェニック動物を使用して、生体環境での効果を示す必要があります。

analyzing-murine-schwann-cell-development-along-growing-axons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

この記事では、段階的に記述しようとする、一般的に使用される...

使用シュワン-アストロサイト相互作用の解析インビトロアッセイ

培養大人の背根神経節ニューロンの軸索再生の遺伝学的研究

このビデオは、後根神経節外植片とシュワン細胞の共培養モデルを示しています。共培養条件では、アスコルビン酸はシュワン細胞の髄鞘形成型への分化を促進します。ミエリン化シュワン細胞は、軸索を複数回包み込み、神経機能に不可欠なミエリン鞘を形成します。...

ニューロン髄鞘形成のための背根神経節外植片とシュワン細胞の共培養

ここでは、遺伝子操作マウスの開発における感覚軸索成長表現型を評価する効果的な方法として、全動物の末梢侵害受容器軸索突起のイメージングのために胎児マウスを遺伝子型決定し、染色し、準備するための最適化されたプロトコルを提示します。...

マウスの胚感覚軸索投影のホールマウントイメージング

光学顕微鏡技術と生化学的アッセイを組み合わせることで、ネトリン依存性軸索分岐におけるSNARE媒介性エキソサイトーシスの関与を解明します。この技術の組み合わせにより、軸索の分岐と細胞形状の変化を制御する分子メカニズムの同定が可能になります。...

軸索分岐と神経形態形成中に形質膜配信の役割を定義するために組み合わせる方法論を活用

このプロトコルは、ラットから分離された後根神経節(DRG)ニューロンの単離と、軸索の整列を強化するための静的なプレストレッチ細胞培養システム上でのDRGニューロンの培養、そしてその後のシュワン細胞(SC)の共培養による髄鞘形成を促進することを説明しています。...

後根神経節ニューロンのアライメントや髄鞘形成を強化するためのアプローチ

ここでは、運動ニューロンの投影と形質転換Hb9::GFPマウス胚における軸索分枝を可視化するためのプロトコルについて述べる。運動ニューロンの免疫染色後は、後続の定量分析のため光シート蛍光顕微鏡画像の胚を使用されます。このプロトコルは、中枢神経系の他のニューロンのナビゲーション...

モーター軸索ナビゲーションと光シート蛍光顕微鏡を用いたマウス胚における軸索分枝の定量化の可視化

ex vivoスライスアッセイは、オキュロ運動神経の成長をリアルタイムで画像化することを可能にします。スライスは、E10.5...

オキュロ運動神経増殖のタイムラプスイメージングのための胚性GFP発現マウスからのEx Vivo Oculomotorスライス培養

後根神経節とシュワン細胞の共培養系では、末梢神経系の髄鞘形成を研究することができます。このモデルは、末梢髄鞘形成を観察および定量化し、ミエリン鞘に対する目的の化合物の影響を研究するための実験的機会を提供します。...

ラット背根神経節外植片とシュワン細胞の共培養における末梢軸索のin vitro髄鞘形成

大脳皮質の発達中、ニューロンとグリア細胞は、心室の内側を覆う心室ゾーンで発生し、脳表面に向かって移動します。このプロセスには多くの遺伝子が関与しています。このプロトコルでは、移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージングの技術を紹介します。...

マウス胚脳切片における移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージング

学ぶマウスシュワン細胞の発達解析法。頸上神経節をコラーゲン基質に培養し、NGF処理で軸索伸長を誘導し、タイムラプスイメージングで細胞移動を観測します。自然環境下での神経再生メカニズムの理解に貢献します。

成長中の軸索に沿ってマウスのシュワン細胞の発達を分析する

さらに動画を探す