成長中の軸索に沿ってマウスのシュワン細胞の発達を分析する

次の実験の目的は、成長する軸索に沿ったシュワン細胞の発達、つまりその自然な生息地を分析することです。これは、第 1 のステップとして、マウス胚の ex explan 上頸神経節、または S cgs をコラーゲンマトリックス上に投与することによって達成されます。S cgは、SCGニューロンからの軸索成長を冠状に促進する神経成長因子またはNGFで治療されます。

X explanからの軸索成長に加えて、内因性シュワン細胞が拡張された軸索に沿って末梢に向かって移動するのを観察できます。シュヴァン細胞の発生は、タイムラプスイメージングによる解析や、固定組織のエンドポイント解析による解析が可能で、距離測定が可能です。この手法がスクラッチマイグレーションアッセイなどの既存の方法よりも優れている主な点は、白鳥細胞の自然な生息地がこのアッセイに含まれていることです。

この手法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。コラーゲンメトリクスの正しい組み立てとsgsの正しい解剖が成功の鍵となるからです。これらの手順を学ぶのは特に難しくありません。

まずは練習が必要です。組織培養フードで作業しながら、氷上のすべての溶液で私たちの条件を理解しました。ストック培地とラットテールコラーゲンを、書面によるプロトコルの指示に従って調製します。

800マイクロリットルのラットテールコラーゲンと210マイクロリットルのストック培地を混合します。気泡を導入しないで、溶液は赤色のままであるべきです。溶液が黄色に変わった場合、ラタールコラーゲン溶液は酸性が強すぎるため、高濃度の水酸化ナトリウムピペットで溶液をマルチウェルスライドの各ウェルに100マイクロ放出して作り直し、各ウェルの底が完全に覆われていることを確認してください。

摂氏37度、二酸化炭素5%に設定された加湿組織培養インキュベーターに皿を2時間入れます。収穫後、E 16 から E 18 の胚を PBS を含むシャーレに入れ、羊膜から解剖し、鎖骨 C のレベルで斬首します。次に、頭頸部領域をシリコンボトムディッシュに移し、解剖顕微鏡で観察しながら、昆虫針を使用して組織を顎下領域と鎖骨領域に固定します。

次に、鉗子を使用して、顎下領域の皮膚と皮下組織を取り除きます。次に、顎下唾液腺を切除して、舌骨上筋、亜頓骨筋、胸鎖乳突筋を露出させます。次に、鉗子を使用して、肺門下筋と胸鎖乳突筋を慎重に取り除き、喉頭と気管

鉗子で気管をつかみ、気管と喉頭を持ち上げます。喉頭と気管が取り除かれると、頸動脈が見え、椎前筋の両側になります。上頸神経節は頸動脈の分岐部に位置し、楕円形として識別できます。

鉗子と昆虫針が取り付けられたニードルホルダーを使用して上頸神経節を取り出し、PBSが入った新鮮な皿に入れてから、神経節から血管または接続された組織を解剖します。シリンジ針の助けを借りて、ゼラチン化されたコラーゲンゲルをインキュベーターから取り出し、シリンジに取り付けられたシリンジ針を使用して神経節をゲルに移します。外植片を摂氏37度に設定された組織培養インキュベーターに5%の二酸化炭素と湿度の高い条件で1〜2時間置きます。

1〜2時間のインキュベーション後、上頸神経節外植片を組織培養インキュベーターから取り出し、B 27サプリメントグルタミンおよび抗生物質を含む100マイクロリットルの神経基礎培地を各x説明に加える。続いて、ミリリットルあたり60ナノグラムを含む200マイクロリットルの神経基礎培地。NGFは、軸索の成長を促進するためにウェルにも追加されます。

このとき、すでに移動を開始した白鳥細胞への影響を研究するために、in vitro zeroの日として定義される試験物質も追加される場合があります。軸索物質は、既存の培地から180マイクロリットルを取り出し、対象物質とNGFを含む200マイクロリットルの培地に最終濃度の2倍の時間で交換することにより、in vitroで3日間投与できます。倒立顕微鏡装置を使用してタイムラプスイメージングを行い、並行細胞培養インキュベーションとタイムラプスイメージングを可能にし、異なる試験物質を比較します。ある実験では、実験の終点にマルチポジション設定をお勧めします。

培養スライド内の外植片を4%PFAで3〜4時間固定し、PBSで洗浄した後、免疫組織化学を実行してX外植片を検証し、SCGが10%正常ロバ血清と2%トリットンX 100を含むPBSで組織を2時間ブロックします。その後、一次抗体をブロッキング溶液中で一晩インキュベートします。一次抗体インキュベーションの翌日、PBSで洗浄した後、X explanを含むゲルを24ウェルプレートに移し、光から保護しながら蛍光標識二次抗体と2時間インキュベートした後、PBSで洗浄し、ダッピー溶液で10分間インキュベートします。

数回洗浄した後、X explanを含むコラーゲンゲルを顕微鏡に置き、スライドさせ、スライドを乾燥させ、その後子牛肉にマウントします。標準的な蛍光顕微鏡を使用して、後で定量分析するための画像を取得します。顕微鏡ソフトウェアがメタデータを記録できると便利です。

得られた画像の定量分析は、フィジーまたはImageJソフトウェアで行うことができ、科学的な用途に無料で使用できます。この動画では、SCGX EXPLANの概略的なSCGX EXPLANによる4日間のin vitroでの軸索成長が実証されています。免疫組織化学は、外植神経節を明確に同定するために、in vitroで4日目に実施できます。

交感神経節として、シュワン細胞は軸索に沿って移動し、上頸神経節から末梢に移動するのを観察できます。このビデオは、高倍率で見たものと同じ移行パターンを示しています。DPIを用いた核の対比染色試料で遊走距離を容易に測定できる 回路図に示されているように、主要なシュワン細胞の核から複数の場所での外植SCGの境界までの距離を測定することができ、DPI標識NGF処理サンプルの画像であるin vitroでの4日間の画像では、SCG説明の境界でのシュワン細胞の遊走を示しています。

明視野と蛍光の組み合わせにより、S 100 GFP陽性白鳥細胞と軸索の可視化が可能になります。最後に、この映画は、上頸神経節exの説明の境界でのシュワン細胞の移動を示しています。ここでは蛍光チャンネルのみが示されており、S 100 GFP陽性シュワン細胞の解釈が容易になります。

この手順に続いて、1つの細胞増殖の定量化や1つの細胞アポトーシスの定量化など、追加の定量分析を行うことができます。もちろん、エンドポイント分析には適切な免疫組織化学を実施する必要があります。または、特定のトランスジェニック動物を使用して、生体環境での効果を示す必要があります。