腹チック中脳マイクロRNAの発現OVO中

楕円形のエレクトロポレーションは、頬の胚を露出させる行為を開くことから始まります。ハンバーガーハミルトンでは、ステージ9から11のDNAが中脳領域に注入されます。次に、中脳の左右に電極を配置し、電圧を印加します。

これにより、心室領域の壁面前駆細胞が腹側トランスフェクションのためにDNAを取り込むようになります。1つの電極。アノードは、中脳領域の下のAを覆う膜の下に配置されます。

カソードは、電圧が印加される前に、中脳の反対側で背側に配置されます。電極が神経管に接触しないように注意してください。24時間後、ハンバーガーハミルトンステージ16または17で、固定された卵子から胚を取り出し、抗体、染色、またはin situハイブリダイゼーションによって分析します。

GFP陽性細胞は、遺伝子トランスフェクトの領域を示します。マイクロRNA前駆体分子、またはマイクロRNA二本鎖のエレクトロポレーションは、マイクロRNAのより長い発現を保証するための即時かつ短期間の効果を提供します。マイクロRNAからコードする配列を含む発現ベクターとGFPを発現するベクターを電子操作します。

トランスセッションされた細胞を可視化するために、ベクターから発現したMicroRNAは、エレクトロポレーション後4時間で最も早く存在します。ツールの滅菌と使用した溶液とコンストラクトの準備に関する詳細な手順については、書面によるプロトコルを参照してください。こんにちは皆さん。

私は、テュービンゲン大学解剖学研究所の実験発生学部門のAndrea Mann研究室の医学博士です。次の動画では、中脳の楕円形の特定の領域にDNAやRNAをトランスフェクションする方法を紹介したいと思います。この方法は、さまざまな脳領域に適用できます。

我々は、ベントでマイクロRNAを過剰発現する方法を使用します Midbrain Fineチップマイクロピペットは、長いゲルローダーチップを使用してマイクロピペットプーラーを使用する前に準備する必要があります、マイクロピペットに約6マイクロリットル、埋め戻しの代わりにDNA溶液を充填します。また、マイクロピペットの先端を折った後、インジェクターでDNAを吸収し、必要な胚期にニワトリの胚を受け取ることもできます。XRは、ハンバーガーとハミルトンの指示XRを横に置いた後、摂氏37度、湿度65%でインキュベートしました。

胚が落ち着く上部にはペンの線が付いています。必要なインキュベーション時間の後、XRはペンラインがまだ上を向いているようにインキュベーターから取り出しました。XRは、SSON空気室の広い側で70%エタノールで消毒され、穴が開けられます。

市販の卵ピンチャーを使用していますが、大きな針でもチョップできます。10ミリリットルの注射器をエゴの損傷を避けるために、かなり垂直な角度で穴に挿入し、1〜2ミリリットルの卵白を取り出します。これにより、胚を卵殻から切り離し、卵殻が胚に滴り落ちるのを防ぐことができます。

卵の上部にサドルテープの小さなストライプを貼り付け、卵の殻に小さな窓を切り込んで胚を露出させます。胚を視覚化する。下に少量のイヌスが注入されています。

次に、卵を少し振ってインクを分配します。もう一つは、実体顕微鏡です。胚は認識しやすいです。

甲状腺を追加し、鋭利なタングステンワイヤーで胚をビリン膜から少し切り離します。vilin Membraneに穴を開け、隙間を包みます。ギャップ。マイクロピペットで中脳の後部または前部の神経上皮の壁を穿孔し、DNAを神経管の内腔に注入します。

中脳レベルで エレクトロオペレートするには、フットペダル付きのイントラセルデュアルパルスエレクトロレーダーを使用して、中脳の広い領域をエレクトロオペレートします。直径Ø0.5mmの平角線電極を自作ホルダーに締結して使用しています。電極は、電解質ベント脳に対して互いに約5ミリメートルの距離を示しています。

アノードには直径oh0.2ミリメートル、陰極部にはoh点25ミリメートルのプレートワイヤーを使用しています。電極は胚の中脳レベルに平行で、中脳細胞の広範な検査を実現します。次に、フットペダルを肝臓に3〜5回押すと、電流が胚にパルスします。

否定的に判断された電極をフォーマットする気泡は、成功したエレクトロポレーションを示しています 腹側中脳のトランスフェクションを達成します。アノードはその領域の膜の下に押し込まれ、明快は神経管を焦がすのを避けるために腹側中脳の下に押し込まれます。陰極は中脳の反対側で横方向にまた位置し、現在の脈拍は加えられる。

XRは、脱水症状や感染症から保護するためにテープで密封され、さらに20〜24時間インキュベートされます。必要なインキュベーション後、Xをインキュベーターから取り出し、細いハサミでテープをハサミで開き、胚の周囲をたっぷりと切り、胚を皿に移します。PBSでは、残りの膜、羊膜、および余分な胚組織が除去されます。

4つの脳を切開することで、神経管の心室領域への溶液への良好なアクセスが保証されます。次に、胚を4%PFAに移し、摂氏4度で一晩固定します。エレクトロポレーションを使用してマイクロRNAを心室中脳にトランスフェクションする方法をお見せしました。

私たちは、マイクロRNAが特定の中脳領域の分化と増殖に及ぼす影響を調査しています。しかし、この方法は、ニワトリ胚の神経系の他の特定の領域における遺伝子の誤発現またはS-I-R-N-Aによる遺伝子ノックダウンを研究するのにも非常に役立ちます。これがお役に立てば幸いです、そしてあなたの実験に幸運を祈ります。