Name: 腹チック中脳マイクロRNAの発現OVO中 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-16T07:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 学ぶin ovo電気穿孔法を用いた鶏胚中脳の選択的遺伝子導入技術。特定の脳領域へのマイクロRNA発現と神経発生のメカニズム解明に有用な実験手法を習得できます。

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我々は、miR画像のためのこの映画とM. Nicolescuの初期段階に貢献したK. Mikicを認めている。 C.フーバーはUniverstitätsklinikumテュービンゲンのFORTUNEプログラムによるUniverstitätsklinikumテュービンゲンIZKF、A.アルウィンプレムアナンドの交わりによってサポートされていました。

1。 でのOVOエレクトロポレーションのための要件<ol><li> ベクター構築の準備：のmiRセンスおよびアンチセンスプライマーは、Ambion社の指示の後に設計をアニールおよびApaI / EcoRIでに連結したのpSilencer U6.1ベクトルを消化。成功した形質転換後、得られたクローンの一つは、成長したとのpSilencerプラスミドをキアゲンミディ調製キットを用いてアルカリ溶解法によって単離した。 </li><li> 電極：電極を購入することができたり、簡単13を構築すること。我々は電気穿孔したい地域によっては8より小さなタングステンワイヤ電極（Φ= 0.1 mm）を自作白金線電極（Φ= 0.2、0.25、または直径0.5mm）を使用するか、またはいくつかのケースでは。組織の灼熱のを回避するために、我々は組織電極シンナーに近いルールとして使用しています。中脳の広範なエレクトロポレーションのために、我々は真鍮/ステンレスチューブ状に半田付け0.5ミリメートルの白金線を使用シャフト、3〜5 mmでの距離（ 図1）と電極ホルダに固定されている。特定の領域をエレクトロポレーションするために、我々は、0.25ミリメートル白金線アノード0.2mmの白金線又は1mm以下のおおよその距離とカソード用の0.1mmのタングステンを使用する。 </li><li> 解決策：次の解決策を用意しておいてください。 <ol><li>オートクレーブしたチキンリンガー、pHは7.5（9.0グラムのNaCl、0.42グラムのKCl、0.24グラムの塩化カルシウムを、1リットルの蒸留水に溶解する）。 </li><li> PBS（8gのNaCl、0.2gのKCl、0.24グラムのKH 2 PO4、1.44グラムのNa 2 HPO 4、1リットルの蒸留H 2 Oに溶解する）。 </li><li>ファストグリーン：ストック溶液10 mg / mlの蒸留水</li><li>遅乾性インク（少ないシェラック、したがって胚にはあまり中毒）。注：カント·ソレルとアドラー14に記載のように、光ファイバ·ランプに取り付けられた青色ダイクロイックフィルタは、コントラストを高め、インクを注入する必要性をなくすことができる。 </li></ol></li></ol><img src="/files/ftp_upload/50024/50024fig1.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50024/50024fig1highres.jpg"/> 図1。電極と電極ホルダーの模式図。 （A、B、C）白金ワイヤはステンレススチール管状シャフトの一側に半田付けした。穴は、このようにそのピンプラグ（A）は赤と青のカラーワイヤがピンプラグに接続されていたインチ合うことができる管状シャフトの反対側に開けた。反対側の端にワイヤがエレクトロの電気ソケットを扱うバナナコネクタに装着した。（A、C）白金線は、90°の天使に折り曲げた。マニキュアの層は曲がり上記シャフトを単離した。 2。直接には、OVOエレクトロポレーション前の準備<ol><li>次の材料を準備します。 <ol><li>チキンリンガー1時06インクを希釈、Gibcから抗生物質 - 抗真菌溶液（100Xを追加O）1:100。 </li><li>ファストグリーン（1:20）を補充し、H 2 O中の特定のDNAあたり1〜2μgの/μL：ベクター溶液を準備します。 </li><li> 70％エタノールで、鉗子、はさみ、タングステン針と電極を滅菌する。 </li><li>ホウケイ酸ガラスキャピラリー（100ミリメートル×0.9ミリメートル、外径までの長さ）から核酸注入にマイクロピペットを引き出します。私たちは、 表1に示した設定で簡単なプラーPUL-1（WPI、ベルリン）を使用します。 </li><li> 表2に示すように、エレクトロのパラメータを設定します。 </li></ol></li></ol><table border="1" ><tbody><tr><td fo:width="1in"> パラメータ </td><td fo:width="1in"> 値 </td></tr><tr><td>熱</td><td> 350 </td></tr><tr><td>引っ張る</td><td> 100 </td></tr><tr><td>速度</tD&gt; <td> 50 </td></tr><tr><td>遅延</td><td> 200 </td></tr></tbody></table> 表1。 PUL-1の設定 <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1.5in"> パラメータ </td><td fo:width="1.5in"> 値 </td></tr><tr><td>周波数</td><td> 50 Hzの</td></tr><tr><td>遅延</td><td> 20から50ミリ秒* </td></tr><tr><td>幅</td><td> 20ミリ秒</td></tr><tr><td>電圧</td><td> 8-25のV * </td></tr><tr><td>パルス</td><td> 3から5倍</td></tr><tr><td colspan="2"> *電極の直径及び距離に応じ。どうぞいずれかのパラメータを変更する際にそれを考慮。 </td></tr></tbody></table> 表2。パルス刺激装置の設定 <ol start="2"><li>エレクトロポレーションのためのニワトリ胚を準備します。 <ol><li>ハンバーガー＆ハミルトン（HH）の間の胚を取得するために39時間、65％の湿度で37℃で、その長い側のニワトリ受精卵を培養するには、15 9月11日ステージ。胚は、卵子の最上部に落ち着くで登録して、鉛筆のラインでそれをマークする必要があります。 </li><li> 70％エタノールで卵を消毒。 </li><li>エアキャビティがどこにあるべきか、そのより広い側面に卵を貫通。 </li><li>卵白1〜2mlのを削除します。これは卵の殻から胚を切り離します。 </li><li>セロテープ胚に落下シェル破片を避けるために卵殻。鉛筆の線を中心に卵殻に小さなウィンドウをカットするはさみを使用してください。 </li><li>インクのビットを注入胚を可視化する暗域の下に。 </li><li>核酸注入およびエレクトロポレーションのための胚のより良いアクセシビリティを実現するために、鋭利なタングステン針と卵黄膜にカットをする。 </li></ol></li></ol> 3。エレクトロポレーションおよびインキュベーション<ol><li>胚上に暖かいリンゲル液を数滴を追加します。これは、胚を下げる組織への電極の過熱、粘着を防止し、両電極間の電流のための媒体を提供する。 </li><li>中脳レベルでの神経管の内腔にベクター溶液を注入する。あなたのDNA発現ベクターはなく、レポーター遺伝子（ 例えば、EGFP）が含まれていない場合は、DNA溶液にわずかに低い濃縮レポーター遺伝子ベクター（0.9μgの/μlのレポーター遺伝子ベクターにベクターを発現する1μgの/μlでのmiR）を加える。これは、後で8トランスフェクトした細胞を認識することを保証します。我々は、いわゆるpCAXベクトル、あちこちの親切な贈り物を使用するC.クルル13メートル。 </li><li>中脳の広範なトランスフェクションのために、中脳の高さで、胚の左側電極と右側に配置します。電極間の距離は3〜5 mmでなければなりません。他の設定は15V、20ミリ秒パルスとHH 10のため50ミリ秒の遅延である。少し中脳の背腹側（DV）軸に沿って2つの電極の位置を変更しても、細胞のより広範なトランスフェクションのDV軸クションを保証します。 </li><li>腹側トランスフェクションのために、卵黄膜から頭を上げ、腹側中脳の下にアノードを配置するためにいくつかのリンガーを追加します。頭が上がらない場合は、神経管のような暑さを避けるために、卵黄と胚を分離する膜の下に電極を押してください。陰極は陽極に反対背側方に、中脳の上に配置する必要があります。神経管に触れないでください。我々は、心臓の開発にあらゆる困難を避けるために、中脳の左腹側半分をトランスフェクト。電極間距離周りの1〜0.5ミリメートル、残りの設定された10V、20ミリ幅と50ミリ秒の遅延がある。 </li><li>それを冷却し、気泡を除去するために胚の頂部に生理食塩水の別の降下を適用する。 </li><li>テープで卵を密封し、少なくとも4時間インキュベートする。ベクトル表現のために必要な最小時間。 </li></ol> 4。ニワトリ胚の固定<ol><li>その卵から胚を取り出します。 </li><li>実体顕微鏡下で蛍光実体顕微鏡を用いたトランスフェクションの程度を評価きれいな胚。 </li><li> 4℃で4％PFA中で一晩胚を修正しました。トランスフェクトエリアの変化を分析するために（in situハイブリダイゼーション 、 免疫組織化学）切片および/ ​​または染色を進める。 </li></ol>

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<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Dev Dyn. 195, 231-272 (1992).</li>
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</ol>

我々は、開示することは何もありません。

このビデオでは、ニワトリ脳の特定の領域の神経上皮細胞にプラスミドをトランスフェクトする効果的な方法を示しています。低電圧の長方形の電気パルスは、OVO 6,16 内のひよこ神経管の細胞にDNAを導入することができます。しかし、DNAのターゲティングの精度は、多くの場合、比較的大きな電極（Φ= 0.5mm）を通って上昇幅の電界によって妨げられる。私たちは、百瀬らのガイドラインに従って直径が小さい電極を使用して、その問題に取り組むことを試みた。8。腹側中脳トランスフェクションのために、私たちは地域帯の膜の下や胚の年齢が直接腹側中脳の下で許可されていれば、カソードを配置します。神経/脳管組織は、陽極で触れると破損することはありませんので、最後のシナリオは少し練習が必要です。リンガーを追加すると、多くの場合、少し面積透明帯をカバーする膜から胚の頭を持ち上げるのを助けることができる。 <pクラスは、= &quot;jove_content&quot;&gt;私達は私達の手で両方の電極を保持する。しかし、それは穏やかで着実に手と少し練習が必要で...

遺伝子発現のための追加的な選手のような小さな非コードRNAの認識は、ゲノムのプログラミング/遺伝子調節に新しい複雑さを立ち上げました。非コードRNAの異なる種は、小さな非コードRNA 1-4を含む神経細胞における機能的重要性を有する。例えばマイクロRNA（MIRまたはmiRNA）は、脳5の開発にはっきりと変化する発現プロファイルを示している。ニワトリ胚のOVOエレクトロポレーションで対象とすることは、開発中の遺伝子発現と抑制の時間的·空間的制御のためのユニークな機会を提供します。 このビデオでは、エレクトロポレーション6月10日 OVOで使用したニワトリ脳の特定の領域にmiRの異所性発現を実施する様々なステップを示しています。細胞におけるこれらの小さな非コードRNAの長期持続効果を確実にするために、miRのDNA配列は、モノ - 又はバイシストロニックベクターにクローニングした。 OVOエレクトロポレーション中の場合は、のmiRは、Vを含む注入器は、卵の殻に小さな窓を作った後に胚を曝露することにより、中脳、神経管に注入される。中脳の小さなプラス（アノード）とマイナス（カソード）の特定の領域をトランスフェクトするために白金電極は、特定の位置に配置されている。腹側中脳トランスフェクションのために、アノードは、左腹側中脳と電流を適用する前に、中脳の右半分上記カソードの下に配置されている。卵殻の開口部をテープで閉じられ、胚であれば、どのような分析に必要とされるようにインキュベートする。この方法は、もともと村松ら 6で説明した特定領域のトランスフェクションのため百瀬ら 8向上した。 <img src="/files/ftp_upload/50024/50024schematic1.jpg" fo:content-width-="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50024/50024schematic1highres.jpg"/> 回路図の概要。 <ol><li>卵内の胚は、目に小さなウィンドウを切断することによって公開されているE卵殻。 </li><li>溶解したベクター（単数または複数）は、マイクロキャピラリーを用いて中脳に注入される。 </li><li> 2つの電極は - 並列配置された、または胚の下で、上 - パルス電界を発生させる。 </li><li>電界は、時間的に陽極11,12に引き付け負に荷電したDNA（またはRNA）による細胞への侵入を促進する細胞膜に孔を作成する。 </li></ol>

<table><tbody><tr><td>ホウ珪酸ガラスキャピラリー </td><td>ハルテンシュタイン</td><td></td><td>モデル:0.9 mm</td></tr><tr><td>マイクロキャピラリープーラー</td><td>WPI、ベルリン</td><td></td><td>モデル:Pul1-E</td></tr><tr><td>エレクトロポレーター</td><td>Intracel</td><td></td><td>モデル:TSSIC</td></tr><tr><td>実体顕微鏡-蛍光 </td><td>LEICA</td><td></td><td>モデル:MZFLIII</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td></td><td>モデル:Stemi</td></tr><tr><td>カメラ・ソフトウェア</td><td>ツァイス</td><td></td><td>モデル: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8</td></tr></tbody></table>

腹チック中脳マイクロrnaの発現ovo中

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

非コードRNAは、遺伝子発現を調節する追加のプレーヤーである。特定分野のOVOエレクトロポレーションで対象となるには、異所性マイクロRNA発現の空間的および時間的制御のためのユニークなツールを提供しています。しかし、腹側中脳のような腹脳構造は、任意の操作のために到達することはかなり困難である。ここでは、薄い白金電極を用いて、腹側中脳へのmiRNAを電気穿孔するための効率的な方法を示しています。この方法では、中脳とのin vivo研究のための有用なツールの特定の領域をトランスフェクトするために信頼性の高い方法を提供しています。

のmiRをトランスフェクトした脳領域の範囲は、miR発現するベクター（ 図2）と一緒に注入されたレポーターベクターからのGFPの発現を介して見ることができる。直径0.5mmの白金電極を用い、後脳、中脳、間脳、時には（ 図2AおよびB）を含む、DVおよびAP-軸に沿った広い領域のトランスフェクションに通常中脳リードのAP軸に平行に配置された。広い電界における電極結果の大きさは、脳領域と、広いトランスフェクト領域に適用。 正確例えば、腹側中脳のような領域を標的とすることは困難である。小さな電界を達成するために、0.5mmの電極間の距離を低減することは、多くの場合、胚に対して毒性であり、アーティファクトをもたらす。私たちは、より局所的なTRAを提供する小さな直径（0.2ミリメートル、0.25ミリメートルの白金やタングステン線シャープに0.1ミリメートル）で電極を使用（ 図2C-I）に到達することは困難である腹側脳のようなnsfection。小さ ​​な電極は印加される電界を低減し、組織に...

異所性発現は、脳の発達におけるマイクロRNAの役割を解明する一つの技術である。しかし、OVOエレクトロポレーションに使用して特定の領域を標的とすることは困難である。ここでは、選択的に腹側と背側中脳領域を電気穿孔するための効率的な方法を示しています。

腹チック中脳マイクロRNAの発現OVO中

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

卵円形電極法によるエレクトロポレーションは、まず胚を露出させるために外胚葉を開くことから始まります。ハンバーガー・ハミルトン（HH）ステージ9から11の段階で、中脳領域にDNAを注入します。次に、中脳の左右に電極を配置し、電圧を印加します。これにより、脳室帯の壁側前駆細胞が腹側へのトランスフェクションのためのDNAを取り込みます。電極は1本使用します。アノードは、中脳領域の下にあるAを覆う膜の下に配置します。電圧をかける前に、カソードを中脳の反対側の背外側に配置します。電極が神経管に接触しないように注意してください。24時間後、Hamburger Hamilton期 16または17において、胚を卵から取り出し、固定した後、抗体、染色、またはin situハイブリダイゼーションによって解析します。GFP陽性細胞は、遺伝子が導入された領域を示しています。マイクロRNA前駆体分子またはマイクロRNA二本鎖のエレクトロポレーションは即効性がありますが、効果は短期的であるため、マイクロRNAをより長期的に発現させる必要があります。そこで、マイクロRNAをコードする配列を含む発現ベクターを、GFPを発現するベクターとともにエレクトロポレーションします。切断された細胞を可視化するため、ベクトルから発現したMicroRNAは、エレクトロポレーションの最短4時間後に出現します。器具の滅菌、および使用した溶液と構築物の調製に関する詳細な手順については、書面によるプロトコルをご参照ください。皆さん、こんにちは。私はテュービンゲン大学解剖学研究所・実験胚発生学部のAndrea Mannの研究室に所属するMD学生です。このビデオでは、中脳の楕円形の特定領域にDNAまたはRNAをトランスフェクションする方法を説明します。この手法は、さまざまな脳領域に適用可能です。この手法を用いて、中脳腹側でマイクロRNAを過剰発現させます。開始前に、マイクロピペットプラーと長いゲルローダーチップを使用して、先端を細くしたマイクロピペットを準備してください。バックフィル（逆充填）の代わりに、約6 µLのDNA溶液をマイクロピペットに満たします。また、マイクロピペットの先端を破断させた後、インジェクターを用いてDNAを吸収させることも可能です。必要な胚段階のニワトリ胚を用意します。Hamburger-Hamilton法に従い、37 °C、湿度65%でインキュベートした後、胚を横向きに配置します。胚が定着する上端にペンで印を付けます。規定の時間インキュベートした後、ペンで付けた印が上を向いた状態でXRをインキュベーターから取り出します。SSONエアチャンバーの広い面を70% ethanolで消毒し、そこに穴を開けます。市販の卵用ピンチャーを使用しますが、太い針でも代用可能です。卵に損傷を与えないよう、10

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鳥類および哺乳動物の聴覚脳幹ニューロンは、正常な聴覚機能のための基本的なプロセスである高速神経エンコーディングに特化しています。これらのニューロンは、胚後脳の別個の前駆細胞から生じる。我々は、聴覚発達中の遺伝子機能を研究するために、ニワトリ胚の後脳における遺伝子を発現させるためにエレクトロポレーションを利用する技術を提示する。...

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ovoエレクトロポレーションを用いて、ニワトリ胚の聴覚内耳と蝸牛核を選択的にトランスフェクションし、回路アセンブリの離散期に脆弱X精神遅滞タンパク質の細胞群特異的ノックダウンを達成する方法を考案しました。...

聴覚回路における脆弱X精神遅滞タンパク質の細胞自律機能をIn Ovo エレクトロポレーション法で解剖

学ぶin ovo電気穿孔法を用いた鶏胚中脳の選択的遺伝子導入技術。特定の脳領域へのマイクロRNA発現と神経発生のメカニズム解明に有用な実験手法を習得できます。

腹チック中脳マイクロRNAの発現OVO中

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