Name: 筋ジストロフィーのマウスモデルから分離された骨格筋の等尺性と偏心力発生アセスメント (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: 学ぶ筋ジストロフィーマウスモデルからの骨格筋の等尺性と偏心力発生アセスメント。EDLと横隔膜の分離、器官浴での機能評価、力発生測定の標準化手法を解説し、治療効果評価に有用な信頼性の高いアプローチを提供する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、ポール·D Wellstone共同研究センター（AR052646）によってサポートされていました。

すべての手順は、ペンシルベニア大学の動物実験委員会によって審査され、承認されています。 1。 EDLの解剖と準備（約30分） <ol><li>彼らは処置中は痛みや苦痛を経験しないことを保証するためにマウスを麻酔しますが、筋肉が十分に循環させることによって酸素化のままにしておくこと。我々は日常的にIPを介して注入されたケタミン/キシラジンカクテル（100/10 mg / kg）を使用しています。麻酔の手術面は完全ペダルやpalpedral撤退反射の欠如、または耳の攣縮反応の欠如によって決定されます。 </li><li>医療用テープを使用して、後肢を固定し、この領域の筋肉を露出させるために下顎後肢の皮膚を取り除きます。一定の間隔で、PBSのアプリケーションと筋肉の潤いを保つ。 </li><li>解剖スコープ]で、EDL筋の近位腱を露出させるために、膝に横に小さな切開を行います。そこに、この領域内の2つの腱があり、両方を再有効にするためにカットする必要がありますEDLのmoval。 </li><li>内側の足首に、 メタtarsalsに沿って延びているEDLの遠位腱を露出させ、TAの筋肉の腱を切った。 EDLの下をカットしたり、触れないように注意しながら、道のTAの筋肉を持ち上げます。 、EDLの遠位腱に戻るスニップ各1、その後腱を把握し、足首を介してそれらを描き、そっと手足の残りの部分から離れてEDLを引き出します。それは自由に近位端から離し、そうでない場合、腱が切断されたことを確認するために横切開に戻るべきである。チルド酸素リンガーでいっぱい解剖皿に筋肉や場所を削除します。 生体内で見つかった長さである約休憩長で腱、筋肉をピン。長さは、筋肉が筋肉は解剖ピンを引っ張っている場合皿に弛緩し、長すぎる場合には短すぎる。 </li><li>頸椎脱臼による筋除去直後にマウスを安楽死させる。 </li><li> 10に縫合糸を結ぶドンズ、できるだけ近くの筋肉にしますが、筋肉に触れていない。約縫合糸を使用して長さを休んで筋肉をピン。 </li></ol> 2。ダイヤフラム解剖と準備（約30分） <ol><li>同じマウスを頸椎脱臼で確認続く解剖、あるいはCO 2の両方を受けた場合には、麻酔下頚椎脱臼により前に、この手順にマウスを安楽死させる。 </li><li>腹部や胸部空洞を公開するために皮膚切開を加えます。腹腔を開き、ちょうど肋骨下の体壁を切った。骨のはさみを使用して、ダイヤフラムの上に挿入開始、リブのラインに続く胸郭全体の周りにカットし、背骨を切って。ダイアフラムが容易に除去することができるように横隔膜の中心を通る血管を切った。 </li><li>マウスからダイアフラムを外し、酸素リンガーズでいっぱい解剖皿に置きます。優しくdiapを扇動血を洗い流すための皿の中でhragm。必要に応じてリフレッシュ液をリンゲル。 </li><li>横hemidiaphragmsの中央部における繊維の配向に沿って腱中心から肋骨横隔膜の小さなストリップをカット。ストリップは広い2〜4ミリメートルの間でなければなりません。骨のはさみを使用して、ダイヤフラムストリップの両側にリブの約1〜2 mmのオーバーハングを残して、ストリップの両側にリブをカット。 </li><li>腱中心に縫合糸を結ぶ。横方向に突き出たリブ側にそれぞれ縫合糸を結び、その後の大きなループを作るために一緒にこれらを結ぶ。 </li><li>二つのストリップは、任意のダイヤフラム（各側から1）から取得することができます。 </li></ol> 3。力学バースの取り付け筋肉<ol><li>縫合糸をつかみ、一方の端部に剛性のポストに筋肉を付けるために、これらを使用し、もう一方の端に力変換器に。 </li><li>筋肉がたるんではありませんが、ピンと張っていないことを確認するために長さを調整します。良い近似が休憩MUSCです1.4のように、leの長さ - 1.5。 </li><li>浴°Cはテストのために筋肉の安定性を延ばすために22で維持酸素化リンゲル液で満たされるべきである。その筋肉の温度が22℃に戻したので、筋肉が前に機能テストにこの浴中で5分間休むべき</li></ol> 4。等尺性収縮<ol><li>最大上刺激条件を確立します。筋肉が風呂に配置された後、けいれんを生成するために、単一の0.5ミリ秒の刺激パルスを使用し、力の出力を監視します。力が最大ではあるが着実なレベルになるまで徐々に電流を増加させる。残りの実験のために、このレベルより10％以上の電流は増加します。 </li><li>最適な長さを確立します。最大の力が得られるまでアイソメトリック筋の刺激を用いて、徐々に筋肉の長さを調整します。各収縮の間に筋肉〜10秒を休ませてください。収縮力が最大になるときに最適な筋肉の長さ（L o）が達成されます。レコード筋肉の長さ（長さノギスを使用して、EDLのため、リブの中心腱myotendinousジャンクショ​​ンと筋肉の間に挿入myotendinous接合）トゥイーン。 </li><li>最大等尺性強縮フォース。最大上刺激で0.5ミリ秒のパルスのシリーズとと融合周波数（周波数、力関係（ 例えば Refの高原からで、500ミリ秒の期間L Oに設定した筋肉を刺激する：8）EDL筋肉のプラトーがある典型的には120 Hzの、100 Hzの横隔膜の筋肉のために達成しました。あらゆる筋肉の刺激の試合の間に5分の休憩時間に、それぞれの周波数で3回を刺激する。 </li></ol> 5。エキセントリック収縮<ol><li>筋肉はアイソメトリックとエキセントリック収縮を実行する間に5分を休ませることができます。 </li><li>最後の200ミリ秒の刺激で10％L Oストレッチ （0.5L oの伸び率が続く最初の500ミリ、等尺用80 Hzで筋肉を刺激/秒）。 </li><li>エキセントリック収縮の必要な数の間に5分休符と刺激パターンを繰り返します。 </li><li>ストレッチの前に期間中の各収縮力を測定する。最初と最後の間の収縮力の低下を計算します。 </li></ol> 6。装置からの筋肉の取り外し<ol><li>トランスデューサからの筋肉の穏やかな除去を可能にし、投稿し、リンガーと解剖皿にそれを戻すために、筋肉の長さを短くしてください。 </li><li>筋肉から縫合糸を外します。 </li><li> EDLの筋肉は、筋肉を二回ブロット、その後の処理（ 例えば凍結、固定など）の前に、それを重量を量る。これは、断面積、および特定の力を計算するために重要となるであろう。 </li><li>横隔膜筋の場合、0.1％プロシオンオレンジ、15〜20分間、膜透過性の染料に浸します。これは解剖損傷の指標を提供します。 </li><li>離れて骨の挿入から筋肉だけでなく、セントを解剖するRAL腱。これは、筋肉の正確な重量を提供することが必要である。体重とその後の準備の前に上記のように吸い取る。 </li><li>断面積（CSA）をクロス計算します。 CSA（㎜2）=質量（mg）/ [（L Oミリメートル）*（L / L○）*（1.06ミリグラム/ mm 3の ）] ここで、L / L、Oは、筋肉の長さの比（EDL、ダイヤフラムの1.0の0.45）5〜繊維であり、1.06は、筋肉の密度である。 </li></ol>

<ol><li>Barton, E. R., Khurana, T. S., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+isometric+force+of+isolated+mouse+muscles+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22TREAT-NMD%22%5BJournal%5D)">Measuring isometric force of isolated mouse muscles in vitro.</a> TREAT-NMD. , (2008).</li>
<li>Barton, E. R., Morris, L., Musaro, A., Rosenthal, N., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+expression+of+insulin-like+growth+factor+I+counters+muscle+decline+in+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific expression of insulin-like growth factor I counters muscle decline in mdx mice.</a> J. Cell Biol. 157, 137-148 (2002).</li>
<li>Barton, E. R., Morris, L., Kawana, M., Bish, L. T., Toursel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+administration+of+L-arginine+benefits+mdx+skeletal+muscle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Systemic administration of L-arginine benefits mdx skeletal muscle function.</a> Muscle Nerve. 32, 751-760 (2005).</li>
<li>Barton, E. R., Wang, B. J., Brisson, B. K., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diaphragm+displays+early+and+progressive+functional+deficits+in+dysferlin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Diaphragm displays early and progressive functional deficits in dysferlin-deficient mice.</a> Muscle Nerve. 42 (1), 22-229 (2010).</li>
<li>Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+skeletal+muscles+from+young%2C+adult+and+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice.</a> J. Physiol. 404, 71-82 (1988).</li>
<li>Harcourt, L. J., Schertzer, J. D., Ryall, J. G., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+dose+formoterol+administration+improves+muscle+function+in+dystrophic+mdx+mice+without+increasing+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul.+Disord%22%5BJournal%5D)">Low dose formoterol administration improves muscle function in dystrophic mdx mice without increasing fatigue.</a> Neuromuscul. Disord. 17 (1), 47-55 (2007).</li>
<li>Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+power+output+of+fast+and+slow+skeletal+muscles+from+mdx+mice+6-28+months+old%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old.</a> J. Physiol. 535 (Pt. 2), 591-600 (2001).</li>
<li>Oishi, P. E., Cholsiripunlert, S., Gong, W., Baker, A. J., Bernstein, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myo-mechanical+Analysis+of+Isolated+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle.</a> J. Vis. Exp. (48), e2582(2011).</li>
<li>Petrof, B. J., Shrager, J. B., Stedman, H. H., Kelly, A. M., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+protects+the+sarcolemma+from+stresses+developed+during+muscle+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 3710-3714 (1993).</li>
<li>Salomonsson, S., Grundtman, C., Zhang, S. J., Lanner, J. T., Li, C., Katz, A., Wedderburn, L. R., Nagaraju, K., Lundberg, I. E., Westerblad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+MHC+class+I+in+transgenic+mice+results+in+reduced+force-generating+capacity+in+slow-twitch+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Upregulation of MHC class I in transgenic mice results in reduced force-generating capacity in slow-twitch muscle.</a> Muscle Nerve. 39 (5), 674-6782 (2009).</li>
<li>Stedman, H. H., Sweeney, H. L., Shrager, J. B., Maguire, H. C., Panettieri, R. A., Petrof, B., Narusawa, M., Leferovich, J. M., Sladky, J. T., Kelly, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mdx+mouse+diaphragm+reproduces+the+degenerative+changes+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mdx mouse diaphragm reproduces the degenerative changes of Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature. 352, 536-539 (1991).</li>
<li>Welch, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTC124+targets+genetic+disorders+caused+by+nonsense+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PTC124 targets genetic disorders caused by nonsense mutations.</a> Nature. 447 (7140), 87-91 (2007).</li>
</ol>

この記事への生産とフリーアクセスがオーロラ·サイエンティフィックが主催しています。

EDL及びダイアフラム - この記事の目的は、マウスから2筋に孤立筋肉の機能を実行するための指針を提供することである。これらの筋肉の評価は、筋肉疾患の治療薬候補が有益であるか否かについての洞察を提供することができます。両方の筋肉のために、堅牢なデータを得るための重要な要因は、クリーン解剖です。したがって、初期分離ステップを練習し、完成すると、機能テストに移る前に、必要不可欠である。また、通常の筋肉のために機能的なベンチマークを確立することはジストロフィー筋へ、または治療間の比較を行う前に重要です。これは研究結果は、実験を行う人の能力によって与えられる高い変動の対象にはなりませんことが保証されます。膜透過性色素の使用は、染料を含む溶液中で、任意の筋肉のインキュベーションは、ほとんど損傷を受けた繊維をマークしますが、dの指標として役立つことができるため、解剖の準備を最適化することを支援することができますissection成功。筋肉で損傷繊維の数を最小限に抑えることにより、測定を最適化するのに役立ちます。解剖によって損傷繊維が伸張性収縮によって損傷したものよりもはるかに明るく蛍光を発すると、染料はまた力学プロセスの間に使用されていたら、人はダメージの2つのタイプを区別するために、色素の強度を使用することができます。 ダイアフラムストリップの解離はほぼ必ず、繊維の長さ方向に沿って切断することにより、いくつかは必然的に破壊さという理由だけで、繊維の損傷を持つことになります。色素の取り込みは、これらの破損した繊維で強力であり、これらは通常、準備の外縁に制限されています。平均的に、我々は、筋条片の両側に幅約3繊維（〜120μm）であり、破損した繊維のバンドを観察します。損傷したバンドは筋肉の15％以上を含む場合、そのデータは破棄されます。横隔膜標本は、機能の対策の最適なサイズ上の制約があります。我々は、dの部分ことを発見した腱中心のタイは一点のみであるため、5ミリメートルより広いiaphragmは、自分自身に畳むし始める。この結果は、準備のために特定の力を減少させた。我々はまた、狭いストリップはまた、我々は解剖中に破損した繊維の数字は総繊維数の大きな割合を含んでいるためであると考えて下の特定の力を持っていることを発見した。例えば、それぞれの側に0.1ミリメートルが破損している場合、それは、強制的に寄与しない筋標本の5％（2x0.1ミリメートル/ 4ミリメートルストリップ）であるのに対し、ストリップはその後わずか1mm、20の場合筋標本の％が損傷しています。したがって、損傷領域の幅だけでなく、製剤全体の幅の両方を制御するための重要な要因である。 最大等尺性張力の測定は、筋肉内のすべての筋線維が刺激されている必要があります。機能装置の部品の大幅な変動があるので、これは個々のセットのために決定されなければならないアップ。たとえば、お風呂の大きさや刺激の種類は刺激の強度に影響を与えることができる。単収縮刺激は最大上刺激条件を決定するために合理的な方法です。これは特定のセットアップや筋肉のために確立されると、それは、その後の研究のために利用することができる。 これとは対照的に、任意の筋肉の最適な長さは、上記の反復プロセスを使用して、各調製のために測定する必要があります。このことは、厚いと薄いフィラメントの重なりが最適であると発電容量を最大の潜在的な力が測定されることを保証します。代替手順は、筋肉の横紋に関連付けられた回折パターンに依存することができますが、これはここで説明されていない追加の機器が必要です。 我々は日常的にこの分野における他の研究者によって使用され、このパラメータの真ん中範囲内500ミリ秒の刺激の持続時間を使用します。これは明らかである収縮、筋肉の中にいくつかの疲労を引き起こすかもしれませんが最大の力生産の &quot;ダレ&quot;で、これ自体は有益なことができます。例えば、疲労の差が故にアクティブ収縮時の力のたるみは改善のための指標となることができ、その目標カルシウム処理も含めて治療法の異なる種類によって達成することができる。あるいは、力の損失は腱に縫合糸は十分なタイトではないことを示している、と彼らは収縮時に滑っていることでした。筋肉を浴から除去されなければならない、これが発生した場合の縫合糸は、再接続する必要があります。我々はまた、製剤の安定性を評価するのに役立ち3テタヌス収縮のシリーズを使用しています。繰り返しになりますが、縫合スリップは再抱き合わせ縫合を必要と収縮との間の力の喪失につながる。大きな筋肉は、プロトコルの間の力の損失につながる無酸素コアを生成することができる。筋肉のサイズが20より大きい質量を持つEDL筋肉がミリグラム各contracと力を失い孤立した筋機能テストを実行するための制限要因であるると、浴中の灌流でサポートすることはできません。彼らは風呂で長時間生存能力を持つのに十分薄いためダイヤフラムストリップは同じ合併症で苦しむことはない。 他の筋肉は一般的に使用されるが、ここで説明されていないヒラメ筋など、孤立した筋機能のために利用することができます。同じ手順の多くは、準備と機能テストの面でヒラメを採用することができる。しかし、主な相違点は、刺激周波数にあり、エキセントリック収縮のためのパラメータ。関数のヒラメを使用する他の二つの筋肉のことは、補完するものであり、従ってそれはジストロフィーマウス4,7を評価するための&quot;標準パッケージ&quot;の一部として考慮されるべきである。 エキセントリック収縮は、収縮もろさの指標を提供します、そして、それは野生動物からの筋肉の力のささやかな損失との力の大幅な損失をもたらしているプロトコルを使用することが重要です。比較のため、広いダイナミックレンジがあるように未処理ジストロフィー筋。通常の筋肉内の任意の力の損失の欠如は、伸張性収縮があまりにもマイルドであることを示唆し、かつ効果的な治療法はありませんし、真に有益なものを区別するのに十分ではありません。しかし、伸張性収縮を受け、通常の筋肉の力の劇的な損失は、疾患に関連する差異を引き出すには余りにも大きいかもしれません。 EDLとダイヤフラムのための私たちのプロトコルには10％の長さの変化を生成する0.5ロー/秒の伸び率を使用しています。我々は、典型的には5エキセントリック収縮は、正常な筋肉の力の小さい損失およびジストロフィー筋肉の力の大幅な損失に結果を実行します。確かに、これらのパラメータのすべてが病気の、健康的な筋肉の間に、同様の変異の特定のタイプの効果の違いを区別するために、全体の長さ変化、ストレッチのレート、またはエキセントリック収縮の数を増やすために変化させることができるまたはtreatment 1は勉強しています。限り正常と疾患筋肉の間に顕著な違いがあるように、その後の治療の観点からのために達するために、金本位制があります。 要約すると、このプロトコルでは、等尺性とエキセントリック収縮を実行するためのガイドラインを確立し、うまくいけば、あなたのラボでこのテクニックをセットアップするときに回避するために潜在的な落とし穴を識別します。

筋機能の測定は、筋肉病理のための治療の可能性の評価にだけでなく、この組織の生理機能のメカニズムの決定に貢献しています。筋疾患は、マウスモデルを使用することは、潜在的な治療薬の設計とテストにその知識を拡張するための遺伝子型と表現型の間のリンクを理解するための中心的なコンポーネントとなっています。筋ジストロフィーは、特に、これらのエージェントを評価し、患者での臨床試験に進めるために必要な前臨床データを確立するためにマウスに頼ってきた。頻繁なアウトカム指標は、研究の広い範囲に適用される強さを決定するために、隔離された筋肉の機能を使用しています。もう一つの指標は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを欠損している筋膜の完全性、およびこの疾患のマウスモデル（MDX）の変化を決定するために、偏心、または長く収縮の使用です。したがって、それはmeasuremこれらのタイプのために不可欠である親は高感度で再現性のあることが。 マウス長趾伸筋（EDL）筋肉が均一な繊維配向と決定的腱2、5、6、10、12を含む、理想的なジオメトリやサイズに起因する絶縁型筋機能のために広く使用されてきました。 EDL筋肉アイソメトリック機能測定のための方法は、以前のJove出版物8のと同様に、TREAT-NMDのSOPの1に記載されている。我々は、等尺性とエキセントリック収縮の両方が含まれるように、これらのメソッドの説明を拡張しました。病気の特徴は、変性/再生および減少力出力のheightedサイクルを含む、EDLに明らかである。 マウスの横隔膜は、マウス11の他の筋肉に比べて筋ジストロフィーの中で最も急速な病理の進行を示す。生後6ヶ月までに、累積線維症は、筋肉の約50％を構成している。大幅impaireこの結果、D力出力11。したがって、線維浸入を防ぐことができる治療薬は、横隔膜で効率的に評価することができます。 筋肉中のジストロフィンの損失が増加した脆弱性とすべての筋肉9の高まり収縮損傷につながる。したがってデュシェンヌ型筋ジストロフィーのための多くの治療法はジストロフィンの交換のために連動されています。このように、これらの戦略を評価するために不可欠となっている検定は、同様に収縮ダメージ2、3、4からジストロフィー筋を保護するために特定の戦略を持っているメリットは何かを判断として、正常およびジストロフィー筋を区別することができ伸張性収縮、、です12。この手順では、/レコード長と力、力変換器から急速に別々の長さを調整する方法を調節することができるどちらのデュアルモードサーボモータを必要とします。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> in vitroでの筋力テスト·システムの </td><td>オーロラ·サイエンティフィック</td><td> 1200A </td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ライカ</td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td> ACEの光源</td><td> SCHOTT-Fostec </td><td> A20500 </td><td></td></tr><tr><td>解剖用はさみ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 14060から11 </td><td></td></tr><tr><td>アングルド解剖ハサミ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 15006から09 </td><td></td></tr><tr><td>スカルペルハンドル</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 10003から12 </td><td>代替解剖ツール</td></tr><tr><td>湾曲したメス刃＃12 </td><td>ファインサイエンスツール</td><td> 10012から00 </td><td>代替解剖ツール</td></tr><tr><td>骨はさみ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 16044から10 </td><td></td></tr><tr><td> S＆Tの縫合抱き合わせ鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 00272から13 </td><td></td></tr><tr><td>デュモンSS鉗子 - 角度付き</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11203から25 </td><td></td></tr><tr><td>編んだ絹縫合サイズ6から0 </td><td>テレフレックスメディカル</td><td> 07-30-10 </td><td></td></tr><tr><td>医療テープ</td><td> Transpore </td><td>スリーエム</td><td></td></tr><tr><td>塩酸ケタミン100 mg / mlの</td><td>ホスピーラ</td><td> NDC 0409-2051-05 </td><td>最終用量は80 mg / kgである</td></tr><tr><td> TranquiVedインジェクション（キシラジン100 mg / ml）を</td><td> Vedco </td><td> NDC 50989-234-11 </td><td>最終用量は10 mg / kgである</td></tr><tr><td>リアクティブオレンジ14 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> R-8254 </td><td></td></tr><tr><td> ソリューションコンポーネントをリンゲル </td><td></td><td></td><td>解決策は、95％O 2および5％CO 2、最終pH 7.4で平衡化ガスである</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S7653 </td><td>最終濃度：118ミリメートル</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> P217-3 </td><td>最終濃度：4.7 mMの</td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> C79-500 </td><td>最終濃度：2.5mMの</td></tr><tr><td>リン酸二水素カリウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> P-285 </td><td>最終濃度：1.2mMの</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td> JTベーカー</td><td> 2500から01 </td><td>最終濃度：0.57 mMの</td></tr><tr><td> 4 - （2 - ヒドロキシエチル）パイプrazine-1-エタンスルホン酸（HEPES） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP310-500 </td><td>最終濃度：5.95 g ​​/ Lの</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G8270 </td><td>最終濃度：5.5 mMの</td></tr></tbody></table>

筋ジストロフィーのマウスモデルから分離された骨格筋の等尺性と偏心力発生アセスメント

Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

筋肉の病気のための潜在的な治療法の評価に重要な筋機能の高感度で再現性の生理学的な評価です。多くの前臨床試験では、これらの疾患のマウスモデルに依存しているため、隔離された筋肉の機能は、患者にまで前方に新薬候補を移動する]の[移動/ NOGO意思決定のための基準の一つとなっている。私たちは、これらの研究のために利用優勢な筋肉である機能テスト用の長趾伸筋（EDL）と横隔膜の筋肉の準備のデモンストレーションを行います。 EDL筋肉のジオメトリは2簡単にアクセス腱、浴中の灌流によってサポートすることができる小型で、隔離された筋肉の準備に最適です。ダイヤフラムは、筋ジストロフィーの動物で深遠な進歩的な病態を示し、線維症に対抗する多くの潜在的な治療法を評価し、筋線維の安定を促進するためのプラットフォームとして機能することができます。アイソメトリックとeccenを含め、定期的なテストのためのプロトコル、TRIC収縮は、表示されます。アイソメトリック力が強さの評価を提供し、エキセントリック収縮は、筋ジストロフィーの多くの種類で破壊されている鞘の安定性を評価するのに役立ちます。野生型およびジストロフィー筋肉から筋肉の間に期待される結果の比較も提供されます。これらの措置は、組織の恒常性の形態学的および生化学的測定と同様に、筋機能の全体の動物アセスメントを補完することができます。

12週齢の動物からEDL筋群の等尺性力に対する期待値を図1に示します。 mdxの筋肉が代償性肥大を呈するため、トータルテタヌス力は年齢一致野生型対照と比較して、MDX筋肉で高くなることがあります。しかし、機能の出力のより適切な尺度は、力は、この値を計算するために断面積のために正規化されている特定の力（ 図2）です。具体的な力は絶対的な力と断面積の両方が考慮されている場合ジストロフィー筋肉の弱さがより明らかである筋肉の本来の機能的な能力に依存します。我々の手で、mdxマウスからEDL筋肉は約20を生成する - 26週齢 - 10から野生型マウスにマッチした時代のものよりも25％低い特定の力を。 準備がdisse依存筋肉の一部であるため、ダイアフラムのは、特定の力は比較のために関連していますction。野生型およびMDX横隔膜の筋肉の間に特定の力の比較では、この組織における進行性の病態を反映している。アイソメトリック力出力は、生後6ヶ月で、mdxマウスから横隔膜の筋肉が年齢をマッチさせた野生型コントロールからダイアフラムストリップの機能出力の半分以上のものを出さないように、（ 図3）加齢とともに減少します。 ダイアフラムテストから偏心収縮の例を図4に示す。後続の各伸張性収縮では、力の出力は、野生型（C57）とmdxマウスの両方からダイアフラムストリップに減少します。しかし、力のロスがあると推測されるジストロフィンとその関連タンパク質の不在から、mdxマウスの筋サンプルでより劇的です。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig1.jpg" /> 図1野生型とMDXのEDL筋肉fのアイソメトリックテタヌス力<html> ROM 12週齢のマウス。絶対的な力は、代償性肥大のために年齢をマッチさせたMDX EDL筋肉に高くなることがあります。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig2.jpg" /> 筋肉の断面積で正規化した図2。アイソメトリックテタヌス力は特定の力であり、野生型マウスに比べmdxマウスからEDL筋肉の落ち込んで機能的能力を明らかにする。トレースは図1と同じマウスからです。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig3.jpg" /> 図3：特定の力によって評価力発電能力の漸進的な損失は、野生型（青線でC57）に比べて（赤いバー）mdxマウスの横隔膜の中で最も明白である。 36/50036fig4.jpg &quot;/&gt; 図4：12週齢C57とmdxマウスから横隔膜の筋肉のための伸張性収縮数の関数としての力の損失。データは平均値である±遺伝子型ごとにN = 4の筋肉のためのSEMである。

筋機能の測定は、筋肉病理のための潜在的な治療法の評価と同様に、この組織の生理機能のメカニズムの決定に貢献しています。我々は、機能テストのための長趾伸筋と横隔膜の筋肉の準備のデモンストレーションを行います。アイソメトリックとエキセントリック収縮のためのプロトコルは、病理学的状態を表すジストロフィー筋の間で結果の違い、および野生型の筋肉だけでなく、表示されます。

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

この手順の全体的な目標は、マウスから分離された骨格筋の機械的特性を測定することです。これは、最初に動物の長指伸筋またはEDL筋、および横隔膜筋を解剖することによって達成されます。ダイヤフラムストリップを準備した後、EDLとダイヤフラムストリップを酸素化リンガー溶液の皿に固定し、縫合ループを筋肉の両端に結びます。次に、EDLまたはダイヤフラムストリップを、力変換器またはレバーの一方の端に取り付けられた2つの電極の間の臓器浴に固定し、引きつり力に基づいて最適な長さに調整します。最後のステップは、いくつかの機械的プロトコルを使用して筋肉を刺激し、力の生成を測定することです。最終的には、力の生成、損傷に対する抵抗力の周波数関係、およびその他の特性の計算を使用して、筋肉の強度と完全性、およびその他の特性、および該当する場合は治療または遺伝子組み換えの影響を示します。この技術は、筋ジストロフィーの潜在的な治療法をテストするために使用できます。これらの治療法のほとんどは、筋力を取り戻し、筋肉の脆弱性を減らすことを目的としているためです。この技術を利用したのは私たちが初めてではありませんが、私たちは日常的にこれを使用して、さまざまなマウスモデルを研究し、それらの筋肉機能を評価し、筋ジストロフィーの複数の治療法を特徴付けて評価しています。キャサリン・モアウッド博士に加えて、生理学的評価コアの2人のメンバー、研究員のミン・リュー博士と研究専門家のイアン氏を使用して、この手順をデモンストレーションします。この手順で使用されるマウスは、ケタミンとキシラジンを使用して麻酔をかけられ、痛みや苦痛を感じないようにしますが、筋肉は循環によって十分に酸素化されたままです。つま先をつまむことで動物が十分に麻酔されていることを確認した後、医療用テープを使用して高い肢を固定し、この領域の筋肉を露出させるために下前後肢の皮膚を取り除き、定期的にPBSを塗布して筋肉を湿らせます。解剖スコープの下で、長指伸筋またはEDL筋の近位腱を露出させるために、膝の外側に小さな切開を行います。この領域には 2 つの腱があり、内側足首の EDL を除去できるように、両方を切断する必要があります。前脛骨筋またはTA筋の腱を切断して、中足骨に沿って伸びるEDLの遠位腱を露出させます。TA筋を邪魔にならないように持ち上げます。下のEDLを切ったり触れたりしないように注意してください。EDLの遠位腱に戻り、それぞれを切り取ります。次に、腱をつかみ、EDLを手足の残りの部分からそっと引き離します。近位端から自由に放出する必要があります。EDL筋を取り出し、冷やした酸素化絞り器で満たされた解剖皿に入れます。腱を通して筋肉をほぼ静止した長さ(これは生体内で見られる長さ)で固定します。筋肉が皿の中でフラップされているときは長さが短すぎ、筋肉が解剖ピンを引っ張っている場合は長すぎます。縫合糸を筋肉にできるだけ近づけて腱に結び付けますが、筋肉には触れないようにします。縫合糸を使用して、ほぼ安静時の長さで筋肉を固定します。この手順を開始します。安楽死させた動物の皮膚を切開します。腹部と胸腔を露出させる。腹腔を開き、骨はさみを使用して肋骨のすぐ下の体壁を切断し、横隔膜の挿入の上から開始します。肋骨のラインに沿って胸郭全体を切り取り、背骨を切り抜きます。横隔膜の中央を通る血管を切断し、横隔膜を簡単に取り除けるようにします。マウスから横隔膜を取り外し、酸素化されたリンガーで満たされた解剖皿に入れます。皿の横隔膜をそっと攪拌して血液を洗い流します。必要に応じてリンガーソリューションを更新します。次に、側半横隔膜の中央部分の繊維の向きに沿って、中央腱から肋骨まで横隔膜の小さなストリップを切断します。ストリップの幅は2〜4ミリメートルである必要があります。中央の腱に縫合糸を結び、横に突き出た肋骨の端にそれぞれ縫合糸を結び、骨はさみを使用してこれらを結び付けて大きなループを作ります。ストリップの両側でリブをカットし、ダイヤフラムの両側にリブの張り出しを約1〜2ミリメートル残します。孤立した骨格筋のストリップフォース生成評価は、in vitro 筋肉試験システムによって行われ、メカニックの浴槽に筋肉を取り付け、縫合糸をつかみ、これらを使用して筋肉を一方の端の硬い支柱に、もう一方の端の力変換器に取り付けます。安静時筋の長さを概算するのが適切です。前に示したように、浴は摂氏22度に維持された酸素化リンガー溶液で満たされています。テストのための筋肉の安定性を延長するために筋肉は、機能テストの前にこの浴で5分間休む必要があります、そうで筋肉温度は摂氏22度に等しくなり、超最大刺激条件を確立するために。筋肉を浴に入れた後、0.5ミリ秒の刺激パルスを1回使用してトゥイッチを生成し、力の出力を監視します。力が最大だが安定したレベルに達するまで電流を徐々に増やし、残りの実験で最適な長さを確立するためにこのレベルよりも電流を10%多く増やし、まず、筋肉がたるんでいないことを確認しますが、教えられていません。適切な近似値は、前に示した安静時筋の長さです。等尺性トゥイッチ刺激を使用して、最大の力が得られるまで筋肉の長さを徐々に調整します。各収縮の間に約10秒筋肉を休ませます。最適な筋肉長は、ツイッチ力がバーニアキャリパーを使用して最大記録的な筋肉長である場合に達成されます。EDLの場合、筋腱接合部間の長さです。横隔膜の場合、中央腱筋腱接合部と肋骨への筋肉挿入部の間の長さです。最大等尺性タイタニック号の力を決定するには、500ミリ秒の期間、最適な筋肉長で設定された筋肉を刺激し、超最大刺激と融合周波数で一連の0.5ミリ秒のパルスを送ります。EDL筋のプラトーは通常、120ヘルツで達成され、100ヘルツの横隔膜筋は、5分間の休息後、各筋肉の刺激発作の間に5分間の休息時間を空けて、それぞれの周波数で3回刺激します。等角収縮を行った後、偏心収縮の手順を開始します。最初の500ミリ秒の間、80ヘルツで等尺性に筋肉を刺激し、その後、最後の200ミリ秒の刺激で10%最適な筋肉長のストレッチを行います。5分間の休憩を挟んで刺激パターンを繰り返します。必要な偏心収縮の数については、ストレッチの前の期間における各収縮の力を測定します。機能テストの完了時の最初の収縮と最後の収縮の間の力の低下を計算します。筋肉の長さを短くし、トランスデューサーとポストから筋肉をそっと取り外します。リンガー付きの解剖皿に筋肉を戻します。EDL筋の筋肉から縫合糸を取り除きます。筋肉を2回ブロックし、その後の処理の前に体重を量ります。これは、横隔膜の筋肉が0.1%prosとオレンジ、膜と透過性染料に15〜20分間浸すための断面積と比力を計算するために重要になります。これにより、解剖損傷の指標が提供され、横隔膜の筋肉を骨の挿入部と中央腱から離して解剖します。これは、計量およびその後の準備の前に、筋ブロットの正確な重量を提供するために必要です。断面積またはCSAは、次の式を使用して計算されます。ここで、L over LOは線維と筋肉の長さの比率、1.06は野生型C 57の等尺性力の筋肉期待値の密度であり、12週齢の動物の筋ジストロフィーまたはM-D-X-E-D-L筋がこの図に示されています。MDX筋は代償性肥大を示すため、巨大な力に対する合計は、年齢を一致させた野生型コントロールと比較してMDX筋肉で高くなる可能性があります。機能出力のより適切な尺度は、力が断面積に対して正規化される比力です。この値を計算するには、比力は筋肉の固有の機能能力に依存し、絶対力と断面積の両方を考慮すると、ジストロフィー筋の弱さがより明らかになります。この研究では、MDXマウスのEDL筋は、10週齢から26週齢の年齢一致野生型マウスのEDL筋よりも約20〜25%低い比力を生成することが観察されました。横隔膜の場合、準備は解剖に依存する筋肉の一部であるため、比力のみが比較に関連します。青い線で示されたC 57野生型筋肉と赤いバーで示されたMDX横隔膜筋との間の比力の比較は、この組織の進行性の病理を反映しています。等尺性力の出力は年齢とともに減少するため、MDXマウスの横隔膜筋は、年齢を一致させた野生型コントロールの横隔膜ストリップの機能出力の半分以下を生成します。ダイアフラム試験による偏心収縮の例をこの図に示します。その後の偏心収縮力の出力は、青で示されている野生型C 57と赤で示されているMDXマウスの両方からのダイヤフラムストリップで減少します。しかし、力の損失は、MDXマウスからの筋肉サンプルにおいて、おそらくジストロフィンおよびその関連タンパク質の不在から、より劇的である。このテクニックは、このテクニックに従って適切に行えば、1つの筋肉に対して約1時間で実行できます。ウェスタンブロッティングやその他の生化学的測定などの他の方法を使用して、治療によってタンパク質レベルが変化したかどうか、または筋肉の完全性が正常化されたかどうかなどの追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、マウスからEDLと横隔膜を解剖する方法や、偏心収縮前後の力の生成を測定および分析する方法を十分に理解できるはずです。

isometric-eccentric-force-generation-assessment-skeletal-muscles

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

単離骨格筋のミオ - 機械的分析

私たちは、犬の後肢の筋肉の強さと繰り返しエキセントリック収縮に対する筋肉の反応を測定するために低侵襲かつ無痛の方法を説明します。...

ビボ犬筋肉の機能アッセイに

我々は、直接筋力、筋パワー、収縮動態との単離された骨格筋の疲労を測定する方法を説明します...

隔離された骨格筋の収縮、倦怠感や交互の ex vivo での評価

手足の筋肉の収縮とパッシブの機械的性質の変化は筋肉の疾患のための重要なバイオマーカーである。本稿では、ネズミ伸digitorum長指と前脛骨筋、これらの特性を測定するための生理的なアッセイを記載。...

長指伸筋の筋機能の評価<em&gt;エクスビボ</em&gt;と前脛骨筋<em&gt;その場</em&gt;マウスの

神経筋疾患のための臨床試験における主要評価項目は、通常、筋肉の機能を向上させることができる。従って、マウスモデルにおいて、臨床的にあらかじめ筋性能に対する潜在的な治療化合物の効果を評価することは非常に重要である。ここでは、この問題に対処するためのいくつかの機能テストを記述します。...

における機能のパフォーマンスを評価する<em&gt; MDX</em&gt;マウスモデル

化学的に皮を剥がれ、または透過化、骨格筋線維の収縮特性の分析は、単一の筋細胞のレベルでの筋機能を評価することにより、強力な手段を提供しています。この記事では、製造するのに有効かつ信頼性の高い技術の概要を説明し、試験は、in vitroでの骨格筋線維を透過処理しました。...

透過性に骨格筋線維によって生成される最大等尺性力の測定

齧歯動物の骨格筋収縮機能の測定は、治療的介入の有効性と同様、病気の進行を追跡するために使用できる便利なツールです。私たちはここで同じマウスで時間をかけて繰り返すことができる内がえし筋の非侵襲的体内評価について説明します。...

マウスで内がえし筋機能の非侵襲的評価

ここで提示されるプロトコルは、ナノニュートン分解能を有する線条筋筋筋線維の収縮特性を評価する。このプロトコルは、干渉法ベースの光学力プローブを用いたセットアップを採用しています。この設定は、高い信号対雑音比を持つデータを生成し、myofibrilsの収縮運動の評価を可能にします。...

骨格筋生検からミオフィブリルを分離し、ナノニュートン分解力トランスデューサーによる収縮機能を決定する

ここでは、出生後初期の発達段階で単一の筋線維を効率的に得る方法を、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー(EDMD)の非常に重篤なモデルであるホモジューザイゴウス変異体ラミンΔ8-11マウスモデルから提案する。...

出生後初期の発達におけるエメリー・ドレイフス型筋ジストロフィーのマウスモデルからの単一の筋繊維の分離と培養

骨格筋機能は、孤立した筋線維の収縮性を定量化することによって評価することができ、従来は面倒で低スループットのアプローチを使用していました。ここでは、ヒドロゲル包埋筋線維の収縮性を定量化するための光学ベースのハイスループット法について説明します。このアプローチは、薬物スクリーニングや治療薬開発に応用されています。...

光学系を用いたヒドロゲル包埋無傷マウス筋線維のハイスループット収縮測定(英語)

ここでは、経皮的筋肉刺激を使用して、ラット足底屈筋のトルク-角速度-出力関係 をin vivoで 非侵襲的に測定するための新しいプロトコルを提示します。このセットアップにより、力変換器/長さコントローラー...

ラット足底屈筋の in vivo における 定荷重 (等張) および等速 (等速) トルク - 速度 - パワープロファイルの構築

学ぶ筋ジストロフィーマウスモデルからの骨格筋の等尺性と偏心力発生アセスメント。EDLと横隔膜の分離、器官浴での機能評価、力発生測定の標準化手法を解説し、治療効果評価に有用な信頼性の高いアプローチを提供する。

筋ジストロフィーのマウスモデルから分離された骨格筋の等尺性と偏心力発生アセスメント

さらに動画を探す