筋ジストロフィーのマウスモデルから分離された骨格筋の等尺性と偏心力発生アセスメント

この手順の全体的な目標は、マウスから分離された骨格筋の機械的特性を測定することです。これは、最初に動物の長指伸筋またはEDL筋、および横隔膜筋を解剖することによって達成されます。ダイヤフラムストリップを準備した後、EDLとダイヤフラムストリップを酸素化リンガー溶液の皿に固定し、縫合ループを筋肉の両端に結びます。

次に、EDLまたはダイヤフラムストリップを、力変換器またはレバーの一方の端に取り付けられた2つの電極の間の臓器浴に固定し、引きつり力に基づいて最適な長さに調整します。最後のステップは、いくつかの機械的プロトコルを使用して筋肉を刺激し、力の生成を測定することです。最終的には、力の生成、損傷に対する抵抗力の周波数関係、およびその他の特性の計算を使用して、筋肉の強度と完全性、およびその他の特性、および該当する場合は治療または遺伝子組み換えの影響を示します。

この技術は、筋ジストロフィーの潜在的な治療法をテストするために使用できます。これらの治療法のほとんどは、筋力を取り戻し、筋肉の脆弱性を減らすことを目的としているためです。この技術を利用したのは私たちが初めてではありませんが、私たちは日常的にこれを使用して、さまざまなマウスモデルを研究し、それらの筋肉機能を評価し、筋ジストロフィーの複数の治療法を特徴付けて評価しています。キャサリン・モアウッド博士に加えて、生理学的評価コアの2人のメンバー、研究員のミン・リュー博士と研究専門家のイアン氏を使用して、この手順をデモンストレーションします。

この手順で使用されるマウスは、ケタミンとキシラジンを使用して麻酔をかけられ、痛みや苦痛を感じないようにしますが、筋肉は循環によって十分に酸素化されたままです。つま先をつまむことで動物が十分に麻酔されていることを確認した後、医療用テープを使用して高い肢を固定し、この領域の筋肉を露出させるために下前後肢の皮膚を取り除き、定期的にPBSを塗布して筋肉を湿らせます。解剖スコープの下で、長指伸筋またはEDL筋の近位腱を露出させるために、膝の外側に小さな切開を行います。

この領域には 2 つの腱があり、内側足首の EDL を除去できるように、両方を切断する必要があります。前脛骨筋またはTA筋の腱を切断して、中足骨に沿って伸びるEDLの遠位腱を露出させます。TA筋を邪魔にならないように持ち上げます。

下のEDLを切ったり触れたりしないように注意してください。EDLの遠位腱に戻り、それぞれを切り取ります。次に、腱をつかみ、EDLを手足の残りの部分からそっと引き離します。

近位端から自由に放出する必要があります。EDL筋を取り出し、冷やした酸素化絞り器で満たされた解剖皿に入れます。腱を通して筋肉をほぼ静止した長さ(これは生体内で見られる長さ)で固定します。

筋肉が皿の中でフラップされているときは長さが短すぎ、筋肉が解剖ピンを引っ張っている場合は長すぎます。縫合糸を筋肉にできるだけ近づけて腱に結び付けますが、筋肉には触れないようにします。縫合糸を使用して、ほぼ安静時の長さで筋肉を固定します。

この手順を開始します。安楽死させた動物の皮膚を切開します。腹部と胸腔を露出させる。

腹腔を開き、骨はさみを使用して肋骨のすぐ下の体壁を切断し、横隔膜の挿入の上から開始します。肋骨のラインに沿って胸郭全体を切り取り、背骨を切り抜きます。横隔膜の中央を通る血管を切断し、横隔膜を簡単に取り除けるようにします。

マウスから横隔膜を取り外し、酸素化されたリンガーで満たされた解剖皿に入れます。皿の横隔膜をそっと攪拌して血液を洗い流します。必要に応じてリンガーソリューションを更新します。

次に、側半横隔膜の中央部分の繊維の向きに沿って、中央腱から肋骨まで横隔膜の小さなストリップを切断します。ストリップの幅は2〜4ミリメートルである必要があります。中央の腱に縫合糸を結び、横に突き出た肋骨の端にそれぞれ縫合糸を結び、骨はさみを使用してこれらを結び付けて大きなループを作ります。

ストリップの両側でリブをカットし、ダイヤフラムの両側にリブの張り出しを約1〜2ミリメートル残します。孤立した骨格筋のストリップフォース生成評価は、in vitro 筋肉試験システムによって行われ、メカニックの浴槽に筋肉を取り付け、縫合糸をつかみ、これらを使用して筋肉を一方の端の硬い支柱に、もう一方の端の力変換器に取り付けます。安静時筋の長さを概算するのが適切です。

前に示したように、浴は摂氏22度に維持された酸素化リンガー溶液で満たされています。テストのための筋肉の安定性を延長するために筋肉は、機能テストの前にこの浴で5分間休む必要があります、そうで筋肉温度は摂氏22度に等しくなり、超最大刺激条件を確立するために。筋肉を浴に入れた後、0.5ミリ秒の刺激パルスを1回使用してトゥイッチを生成し、力の出力を監視します。

力が最大だが安定したレベルに達するまで電流を徐々に増やし、残りの実験で最適な長さを確立するためにこのレベルよりも電流を10%多く増やし、まず、筋肉がたるんでいないことを確認しますが、教えられていません。適切な近似値は、前に示した安静時筋の長さです。等尺性トゥイッチ刺激を使用して、最大の力が得られるまで筋肉の長さを徐々に調整します。

各収縮の間に約10秒筋肉を休ませます。最適な筋肉長は、ツイッチ力がバーニアキャリパーを使用して最大記録的な筋肉長である場合に達成されます。EDLの場合、筋腱接合部間の長さです。

横隔膜の場合、中央腱筋腱接合部と肋骨への筋肉挿入部の間の長さです。最大等尺性タイタニック号の力を決定するには、500ミリ秒の期間、最適な筋肉長で設定された筋肉を刺激し、超最大刺激と融合周波数で一連の0.5ミリ秒のパルスを送ります。EDL筋のプラトーは通常、120ヘルツで達成され、100ヘルツの横隔膜筋は、5分間の休息後、各筋肉の刺激発作の間に5分間の休息時間を空けて、それぞれの周波数で3回刺激します。

等角収縮を行った後、偏心収縮の手順を開始します。最初の500ミリ秒の間、80ヘルツで等尺性に筋肉を刺激し、その後、最後の200ミリ秒の刺激で10%最適な筋肉長のストレッチを行います。5分間の休憩を挟んで刺激パターンを繰り返します。

必要な偏心収縮の数については、ストレッチの前の期間における各収縮の力を測定します。機能テストの完了時の最初の収縮と最後の収縮の間の力の低下を計算します。筋肉の長さを短くし、トランスデューサーとポストから筋肉をそっと取り外します。

リンガー付きの解剖皿に筋肉を戻します。EDL筋の筋肉から縫合糸を取り除きます。筋肉を2回ブロックし、その後の処理の前に体重を量ります。

これは、横隔膜の筋肉が0.1%prosとオレンジ、膜と透過性染料に15〜20分間浸すための断面積と比力を計算するために重要になります。これにより、解剖損傷の指標が提供され、横隔膜の筋肉を骨の挿入部と中央腱から離して解剖します。これは、計量およびその後の準備の前に、筋ブロットの正確な重量を提供するために必要です。

断面積またはCSAは、次の式を使用して計算されます。ここで、L over LOは線維と筋肉の長さの比率、1.06は野生型C 57の等尺性力の筋肉期待値の密度であり、12週齢の動物の筋ジストロフィーまたはM-D-X-E-D-L筋がこの図に示されています。MDX筋は代償性肥大を示すため、巨大な力に対する合計は、年齢を一致させた野生型コントロールと比較してMDX筋肉で高くなる可能性があります。機能出力のより適切な尺度は、力が断面積に対して正規化される比力です。

この値を計算するには、比力は筋肉の固有の機能能力に依存し、絶対力と断面積の両方を考慮すると、ジストロフィー筋の弱さがより明らかになります。この研究では、MDXマウスのEDL筋は、10週齢から26週齢の年齢一致野生型マウスのEDL筋よりも約20〜25%低い比力を生成することが観察されました。横隔膜の場合、準備は解剖に依存する筋肉の一部であるため、比力のみが比較に関連します。

青い線で示されたC 57野生型筋肉と赤いバーで示されたMDX横隔膜筋との間の比力の比較は、この組織の進行性の病理を反映しています。等尺性力の出力は年齢とともに減少するため、MDXマウスの横隔膜筋は、年齢を一致させた野生型コントロールの横隔膜ストリップの機能出力の半分以下を生成します。ダイアフラム試験による偏心収縮の例をこの図に示します。

その後の偏心収縮力の出力は、青で示されている野生型C 57と赤で示されているMDXマウスの両方からのダイヤフラムストリップで減少します。しかし、力の損失は、MDXマウスからの筋肉サンプルにおいて、おそらくジストロフィンおよびその関連タンパク質の不在から、より劇的である。このテクニックは、このテクニックに従って適切に行えば、1つの筋肉に対して約1時間で実行できます。

ウェスタンブロッティングやその他の生化学的測定などの他の方法を使用して、治療によってタンパク質レベルが変化したかどうか、または筋肉の完全性が正常化されたかどうかなどの追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、マウスからEDLと横隔膜を解剖する方法や、偏心収縮前後の力の生成を測定および分析する方法を十分に理解できるはずです。