Name: ホールマウントRNAを蛍光その場でハイブリダイゼーションショウジョウバエ胚 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 学ぶ ホールマウント蛍光in situハイブリダイゼーション法でショウジョウバエ胚におけるRNA発現と局在を可視化する手法。この最適化プロトコルは発生生物学研究における遺伝子発現動態の理解に貢献します。

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レキュヤー室で行った仕事は、国立科学とカナダの技術評議会（NSERC）、健康研究（CIHR）とフォン·ド·RECHERCHE専用サンテ·デュ·ケベック（FRSQ）のカナダの協会からの資金によってサポートされています。キャロルIampietroがアンジェロPizzagalliポスドクでサポートされていながら、ファビオアレクシスルフェーブルとガエル·Moquin·ボードリーは、NSERC学部研究studentshipsによってサポートされています。

<ol><li>Wilcox, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+principles+of+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Fundamental principles of in situ hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 41, 1725-1733 (1993).</li>
<li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98, 81-85 (1989).</li>
<li>Lecuyer, E., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+gene+expression+universe%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Mapping the gene expression universe.</a> Curr Opin Genet Dev. 18, 506-512 (2008).</li>
<li>Tomancak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+patterns+of+gene+expression+during+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Global analysis of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis.</a> Genome Biol. 8, 2007-208 (2007).</li>
<li>Thisse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+expression+of+the+zebrafish+genome+by+large-scale+in+situ+hybridization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal expression of the zebrafish genome by large-scale in situ hybridization screening.</a> Methods Cell Biol. 77, 505-519 (2004).</li>
<li>Quiring, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+expression+screening+by+automated+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization.</a> Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).</li>
<li>Pollet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atlas+of+differential+gene+expression+during+early+Xenopus+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">An atlas of differential gene expression during early Xenopus embryogenesis.</a> Mech. Dev. 122, 365-439 (2005).</li>
<li>Lein, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445, 168-176 (2007).</li>
<li>Lecuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li>
<li>Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+blueprint+for+a+chordate+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulatory blueprint for a chordate embryo.</a> Science. 312, 1183-1187 (2006).</li>
<li>Bell, G. W., Yatskievych, T. A., Antin, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GEISHA%2C+a+whole-mount+in+situ+hybridization+gene+expression+screen+in+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">GEISHA, a whole-mount in situ hybridization gene expression screen in chicken embryos.</a> Dev. Dyn. 229, 677-687 (2004).</li>
<li>Wilkie, G. S., Shermoen, A. W., O'Farrell, P. H., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcribed+genes+are+localized+according+to+chromosomal+position+within+polarized+Drosophila+embryonic+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcribed genes are localized according to chromosomal position within polarized Drosophila embryonic nuclei.</a> Curr. Biol. 9, 1263-1266 (1999).</li>
<li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+embryo+dechorionation%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Drosophila embryo dechorionation.</a> CSH Protoc. , (2007).</li>
<li>Stapleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+gene+collection%3A+identification+of+putative+full-length+cDNAs+for+70%25+of+D.+melanogaster+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes.</a> Genome Res. 12, 1294-1300 (2002).</li>
<li>Rubin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+complementary+DNA+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Drosophila complementary DNA resource.</a> Science. 287, 2222-2224 (2000).</li>
<li>Tomancak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+determination+of+patterns+of+gene+expression+during+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic determination of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis.</a> Genome Biol. 3, (2002).</li>
<li>Terashima, J., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+available+food+into+the+number+of+eggs+laid+by+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Translating available food into the number of eggs laid by Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 167, 1711-1719 (2004).</li>
<li>Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+protocols+in+Drosophila+embryos+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues.</a> Methods Mol. Biol. 420, 289-302 (2008).</li>
<li>Lecuyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+fluorescent+in+situ+hybridization+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High resolution fluorescent in situ hybridization in Drosophila.</a> Methods Mol. Biol. 714, 31-47 (2011).</li>
<li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846(2004).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

プローブ合成の手順については、我々は通常、 ショウジョウバエ遺伝子コレクション（DGC）は、次のWebサイトで詳細なリソースで見つかったプラスミドから増幅された完全長cDNAからショウジョウバエのin vitro転写によりランオフアンチセンスRNAプローブを生成： <a href="http://www.fruitfly.org/DGC/index.html" target="_blank">のhttp://www .fruitfly.org / DGC / index.htmlを</a> 14,15。このアプローチは、遺伝子発現やフライ9,16胚におけるmRNA局在パターンをマッピングすることを目的とした大規模なISHの研究に広く用いられてきた。 DGCプラスミドは、 ショウジョウバエのゲノムリソースセンター（から注文することができ<a href="https://dgrc.cgb.indiana.edu/vectors/" target="_blank">https://dgrc.cgb.indiana.edu/vectors/</a>...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> T7、T3またはSP6 RNAポリメラーゼ</td><td>フェルメンタスライフサイエンス</td><td> EP0101、EP0111、EP0131 </td><td>キットは、反応緩衝液を含んでいます。 </td></tr><tr><td> DIG RNAラベリングミックス</td><td>ロシュ·ダイアグノスティックス</td><td> 11 277 073 910 </td><td></td></tr><tr><td> RNAguard </td><td>アマシャムバイオサイエンス</td><td> 27-0816-01 </td><td></td></tr><tr><td> 3M酢酸ナトリウム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷たい100％エタノール。 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷70％エタノール。 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩素系漂白剤の溶液を水で1:1に希釈した。 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヘプタン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼK </td><td>シグマアルドリッチオークビル、ON、カナダ</td><td>商品番号P2308 </td><td></td></tr><tr><td>新たに調製し、40％ホルムアルデヒド溶液、 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>をPBS-Tween溶液（PBT） </td><td></td><td> 1xPBS、0.1％Tween-20を</td><td></td></tr><tr><td>グリシン溶液</td><td></td><td> PBTで2 mg / mlのグリシン</td><td></td></tr><tr><td> HRP標識マウスモノクローナル抗DIG </td><td>ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ株式会社</td><td> 200から032 - 156 </td><td> （PBTBで1 mg / mlの原液の400分の1希釈</td></tr><tr><td> HRP結合ヒツジモノクローナル抗DIG </td><td>ロシュ·アプライド·科学者CE、ラヴァル、QC </td><td> 1 207 733 </td><td> PBTBで原液の1/500希釈</td></tr><tr><td>ビオチン結合マウスモノクローナル抗DIG </td><td>ジャクソンイムノリサーチ·ラボラトリーズ社、ウェストグローブ、ペンシルバニア州、アメリカ合衆国</td><td> 200-062-156 </td><td> （PBTBで1 mg / mlの原液の400分の1希釈</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン-H​​RPコンジュゲート</td><td> Molecular Probes社、ユージーン、OR、アメリカ合衆国</td><td> S991 </td><td> （1μg/ mlの株式の1/100希釈</td></tr></tbody></table>

ホールマウントrnaを蛍光<em&gt;その場で</emの&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

遺伝子の発現パターンだけでなく、その転写されたRNAの細胞内局在化特性を評価、開発中にその生物学的機能を理解するために重要な機能です。 in situハイブリダイゼーション 、RNA（RNA ISH）は、生物の、細胞または細胞内のレベル1でそれである、RNAの分布特性を可視化するために使用される強力な方法です。 RNA-ISHはmRNAまたは関心2の非コーディングRNA標的の配列に相補的な標識核酸プローブ（ 例えば、アンチセンスRNA、オリゴヌクレオチド）のハイブリダイゼーションに基づいています。手順は配列特異的なプローブを生成するために単独で一次配列情報を必要として、それは普遍的に生物や組織標本3の広い範囲に適用することができます。実際、大規模なISHの多くの研究がにつながっている様々なモデル生物における遺伝子発現とRNA局在化ダイナミクスを文書化するために実装されています重要な地域資源の確立4-11プローブのラベリングと検出、様々な戦略が長年にわたって開発されてきたが、蛍光標識された検出試薬と酵素信号増幅ステップの併用は、手順12の感度と分解能の大幅な機能強化を提供します。ここでは、段階的なショウジョウバエ胚におけるRNAの発現と局在の動態を可視化するためにチラミドシグナル増幅（TSA）を用いるin situハイブリダイゼーション法（FISH） に最適化された蛍光を記述します。手続きが大幅に多数のサンプルの同時処理を容易にする96ウェルPCRプレート形式で行われる。

正常に実行されている場合、このプロシージャは、初期のショウジョウバエの胚発生における遺伝子発現とmRNA局在化ダイナミクスの時空間分析の細部の著しく強化されたレベルを提供しています。古典的なペアルール遺伝子ラント （ ラン ）のために、図3Aに示すように、確かに、1つは核を表現するグループの新生転写産物病巣の検出を介して遺伝子発現のイベントを監視するために、このプロトコルを使用することができます。加えて、 図3Bの胚のモザイクのように、この方法は、高解像度でのmRNA局在機能の可視化を可能にします。 <img src="/files/ftp_upload/50057/50057fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。 RNAプローブの調製手順の概要（）は、in vitro転写usin 内でDIG標識...

ここでは、ホールマウント蛍光を記述<em&gt;その場で</emショウジョウバエの胚発生の間に発現したRNAの発現と局在特性を決定するための&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）プロトコル、<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;。

ホールマウントRNAを蛍光<em&gt;その場で</emの&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

この手順では、ショウジョウバエの胚全体におけるRNAの発現と局在特性を評価するための最適化された魚法について説明します。これは、まず、適切に選択されたDNAテンプレートのin vitro転写により、目的のMr NAまたは非コーティングRNAに相補的な標識RNAプローブを合成することによって達成されます。並行して、ハエの個体数ケージは、目的の発生段階の胚を採取、固定、および透過するために使用されます。いくつかの固定後ステップの後、胚を標識アンチセンスRNAプローブとハイブリダイズします。最後に、サンプルを広範囲に洗浄した後、ハイブリダイズプローブを特異的抗体および蛍光色素標識検出試薬による免疫標識により検出し、標的RNA分布を高感度に読み出します。最終的に、その結果は、ショウジョウバエの胚形成中の標的RNAの空間的および時間的発現特徴を文書化するために、標準的な蛍光顕微鏡法で分析される高度に分離された蛍光シグナルをもたらします。ノーザンブロットやR-T-P-C-Rなどの既存の方法と比較した場合、この手法の主な利点は、無傷の組織標本内のRNA発現を評価できることです。この方法は、初期のショウジョウバエ胚におけるRNA発現特性の解析を目的としていますが、幼虫や成虫から解剖した組織の後期発生段階の胚の解析にも使用できます。私たちの手順の重要な側面は、PCRの場所で魚を行うことで達成できるサンプル数のアップスケーリングであり、これによりアプローチのスループットが大幅に向上します。この手順を実証するラボのメンバーには、学部生の研究抵抗、大学院生、ポスドク研究員が含まれます。まずは、栄養が豊富なポピュレーションケージから始めましょう。プレートをリンゴジュース酵母プレートに交換し、摂氏25度で1時間ハエを放置します。次に、リンゴジュース酵母プレートを交換して、初期段階の胚を収穫します。ケージを摂氏25度でインキュベートし、胚の所望の発達段階に達するまで待ち、化学フードで待機し、化学薬品を混合してガラス吸入バイアルで37%ホルムアルデヒドを作製します。PFA粉末が完全に溶解するまで溶液を煮沸します。次に、室温まで冷却し、新しいシンチレーションバイアルにろ過します。次に、二相性固定溶液を調製します。PBSをシンチレーションバイアルで37%ホルムアルデヒドと組み合わせ、準備ができたらヘプタンを追加します。リンゴジュースプレートから室温、水道水、細い絵筆で繊細に掃いて胚を採取します。再懸濁した胚をバスケットに移し、ぬるま湯の水道水ですすいでください。次に、バスケットを新鮮な3%漂白剤溶液に浸して、胚を90秒間デコレーションします。その後、漂白剤の臭いがなくなるまでぬるま湯の水道水で漂白剤を取り除きます。胚を採取するには、採取バスケットを分解し、胚を二相性固定溶液に穏やかに移します。

whole-mount-rna-fluorescent-situ-hybridization-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

in situハイブリダイゼーション全体のマウントは、発生生物学で最も広く使用されている技術の一つです。ここで、我々は、単一の遺伝子の正確な発現パターンを解析するためと、二つの遺伝子の発現領域の重なりを判定するためのin...

ゼブラフィッシュの全マウント高分解能二重蛍光上皮内ハイブリダイゼーション

ショウジョウバエの血球は胚の全体にわたって分散させる。このプロトコルは、蛍光標識した血球で胚を使用してこれらの移行をマウントし、イメージする方法を示します。...

のライブイメージングキイロショウジョウバエ胚性血球移行

全体のマウント<em&gt;上皮内</emE11.5マウス胚へのE8.5&gt;ハイブリダイゼーション

ゼブラフィッシュは、小さな熱帯魚は、脊椎動物の発生と疾患の間に遺伝子機能を研究するための人気のあるモデルとなっている。標的遺伝子の時間的および空間的な表現は次式で求めることができる...

高解像度全マウント<em&gt;その場で</em遺伝子発現と機能を研究するためにゼブラフィッシュ胚内&gt;ハイブリダイゼーション

我々は、色の沈殿物を対照することによって三つの異なるmRNAの分布パターンの同時および特定の検出を可能にする、完全なショウジョウバエの胚におけるマルチターゲット発色性ホールマウントin situハイブリダイゼーション （MC-WISH）の手順を説明します。...

マルチターゲット発色ホールマウント<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーションにおける遺伝子発現のドメインを比較します<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

記載されている RNAその場で交配のプロトコルでは、全体のショウジョウバエの胚または切り裂かれたティッシュで RNA の検出をことができます。96 ウェル マイクロ...

ショウジョウバエの胚とパスチラミドシグナル信号増幅を利用した生体表面の高解像度蛍光In Situハイブリダイゼーション

この原稿は、 Xを生成するための詳細な方法を提示-染色体腕プローブおよび実行する蛍光その場で交配 (魚) の妹の状態を調べるに染色分け体結束の prometaphase...

Prometaphase の腕凝集度と中期の状態を監視する蛍光In Situハイブリダイゼーション (魚) を使用して私はショウジョウバエの卵母細胞

ここでは、分子ビーコン、スピニングディスク共焦点顕微鏡、オープンソース分析を用いたライブショウジョウバエメラノガスター卵室における内因性mRNA人身売買の可視化、検出、分析、追跡のためのプロトコルを提示する。ソフトウェア。...

ライブショウジョウバエメラノガスター卵室における内因性mRNAの可視化と追跡

ここでは、 ショウジョウバエ 胚タンパク質およびRNAの収集から事前包埋および包埋、免疫染色、およびmRNAin situ...

初期ショウジョウバエ胚における免疫組織化学およびRNAのその場分布のためのプロトコル

Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization(EASI-FISH)は、拡大顕微鏡法と蛍光in...

Expansion-assisted iterative Fluorescence In Situ Hybridizationを用いたInsact Drosophila Brainにおける遺伝子発現のマルチプレックス検出

学ぶ ホールマウント蛍光in situハイブリダイゼーション法でショウジョウバエ胚におけるRNA発現と局在を可視化する手法。この最適化プロトコルは発生生物学研究における遺伝子発現動態の理解に貢献します。

ホールマウントRNAを蛍光

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