ホールマウントRNAを蛍光その場でハイブリダイゼーションショウジョウバエ胚

この手順では、ショウジョウバエの胚全体におけるRNAの発現と局在特性を評価するための最適化された魚法について説明します。これは、まず、適切に選択されたDNAテンプレートのin vitro転写により、目的のMr NAまたは非コーティングRNAに相補的な標識RNAプローブを合成することによって達成されます。並行して、ハエの個体数ケージは、目的の発生段階の胚を採取、固定、および透過するために使用されます。

いくつかの固定後ステップの後、胚を標識アンチセンスRNAプローブとハイブリダイズします。最後に、サンプルを広範囲に洗浄した後、ハイブリダイズプローブを特異的抗体および蛍光色素標識検出試薬による免疫標識により検出し、標的RNA分布を高感度に読み出します。最終的に、その結果は、ショウジョウバエの胚形成中の標的RNAの空間的および時間的発現特徴を文書化するために、標準的な蛍光顕微鏡法で分析される高度に分離された蛍光シグナルをもたらします。

ノーザンブロットやR-T-P-C-Rなどの既存の方法と比較した場合、この手法の主な利点は、無傷の組織標本内のRNA発現を評価できることです。この方法は、初期のショウジョウバエ胚におけるRNA発現特性の解析を目的としていますが、幼虫や成虫から解剖した組織の後期発生段階の胚の解析にも使用できます。私たちの手順の重要な側面は、PCRの場所で魚を行うことで達成できるサンプル数のアップスケーリングであり、これによりアプローチのスループットが大幅に向上します。

この手順を実証するラボのメンバーには、学部生の研究抵抗、大学院生、ポスドク研究員が含まれます。まずは、栄養が豊富なポピュレーションケージから始めましょう。プレートをリンゴジュース酵母プレートに交換し、摂氏25度で1時間ハエを放置します。

次に、リンゴジュース酵母プレートを交換して、初期段階の胚を収穫します。ケージを摂氏25度でインキュベートし、胚の所望の発達段階に達するまで待ち、化学フードで待機し、化学薬品を混合してガラス吸入バイアルで37%ホルムアルデヒドを作製します。PFA粉末が完全に溶解するまで溶液を煮沸します。

次に、室温まで冷却し、新しいシンチレーションバイアルにろ過します。次に、二相性固定溶液を調製します。PBSをシンチレーションバイアルで37%ホルムアルデヒドと組み合わせ、準備ができたらヘプタンを追加します。

リンゴジュースプレートから室温、水道水、細い絵筆で繊細に掃いて胚を採取します。再懸濁した胚をバスケットに移し、ぬるま湯の水道水ですすいでください。次に、バスケットを新鮮な3%漂白剤溶液に浸して、胚を90秒間デコレーションします。

その後、漂白剤の臭いがなくなるまでぬるま湯の水道水で漂白剤を取り除きます。胚を採取するには、採取バスケットを分解し、胚を二相性固定溶液に穏やかに移します。絵筆を使用して、胚はPBS層とヘプタン層の間の界面に蓄積します。

次に、シンチレーションバイアルを密封し、ボルテックスミキサーに固定し、最低の設定で20分間振とうします。振とうした後、牧草地のピペットを使用して、下部PBSおよび上部HEANE相のほとんどを廃棄します。次に、残りの混合物をピペットに吸引し、胚を失うことなく下相を慎重にドロップアウトします。

胚を、500マイクロリットルのヘプタンと500マイクロリットルのメタノールの二相性溶液を含む1.5ミリリットルのチューブに沈着させます。チューブを30〜45秒間激しく振って、膝蓋骨の膜を割ってください。ひび割れると、胚はメタノールに沈みます。

上相と割れていない胚を捨て、1ミリリットルのメタノールを加えます。次に、チューブを5秒間短く振って、胚をメタノールで3回洗います。洗浄後、胚はマイナス20°Cで数ヶ月間保存することができます。

まず、各胚に500マイクロリットルのPKを加え、サンプルを室温で10分間振とうせずにインキュベートします。プロテインa kでサンプルを過剰に消化したり、ずさんな操作でサンプルを損傷したりしないように細心の注意を払ってください。PKインキュベーション中は、ピペットで胚を噴射して2分ごとに胚を混合します。

10分後、胚を氷の上に1時間置きます。1時間後、室温でPK溶液を取り出します。胚をPBT中のグリシンで2分間2回洗浄します。

次に、サンプルをPBT中の3.7%ホルムアルデヒドの1ミリリットルに20分間固定します。PBTで5回のすすぎでホルムアルデヒドを洗い流します。次に、胚を等量のPBTおよびHI溶液1ミリリットルで洗い流し、混合物を0.5〜1ミリリットルの純粋な溶液と交換します。

この時点で、胚は摂氏マイナス20度で数日から数週間保存できます。96ウェルプレートでは、ウェルあたり10〜15マイクロリットルの沈殿した胚をアリコートします。胚の損傷を避けるために、幅の広いボアチップを使用してください。

次に、サンプルごとに100マイクロリットルのハイプ溶液を沸騰させて、プレハイブリダイゼーション溶液を調製します。5分間、Pre-Hype溶液を氷上で5分間冷却し、次に胚サンプルを含む各プレートウェルに100マイクロリットルを加えます。調製した RNA プローブを NanoDrop 分光光度計で定量します。

また、プローブの品質を確認するために、プローブを1〜2マイクロリットルのアグロゲルに流します。次に、各サンプルについて、約100ナノグラムのプローブを100マイクロリットルのHI溶液で希釈します。RNAフリーの条件下での作業は重要です。

プローブを取り扱うとき。溶液を摂氏80度に3分間加熱します。次に、氷の上で少なくとも5分間冷却します。

数時間冷やしておくことができます。プレートを回収し、Pre-Hype溶液を胚から吸引して除去します。次に、RNAプローブを含む100マイクロリットルのハイプ溶液をそれぞれに加えます。

翌日、プローブを摂氏56度で12〜16時間ハイブリダイズします。一連の5つの溶液は、摂氏56度で予温されています。1つ目は純粋な誇大広告ソリューションで、最後は純粋なPBTです。

他の3つは、HIのPBTへの希釈です。温めたら、すぐにサンプルを純粋な誇大広告溶液で一度すすいでください。次に、希釈が最も少ないハイプ溶液から始めて、連続して希釈するたびに、15分間の洗浄を3回行います。

最後に、サンプルを純粋なPBTで5分間4回洗浄します。次に、サンプルを室温に戻します。次に、抗体アプリケーションを進めてプローブを検出し、サンプルの混合を改善します。

これらのステップの間に、プレートは、記載されたプロトコルを使用して変異ミキサーに取り付け可能な小さな箱に入れることができ、古典的なペアルール遺伝子ラントを胚形成の異なる段階で分析した。魚類の分析により、胚の4番目の胚の中央部での最初の広範な発現が、どのように分節化された縞模様に精製されるかが明らかになりました。後の段階では、魚は、0〜4時間齢のショウジョウバエ胚にハイブリダイズされた様々なdiggenおよび標識アンチセンスRNAプローブを使用して行われた。

ハイブリダイズプローブは、ビオチン化抗原とHRPおよびセラミドに特異的な抗体連鎖球菌との逐次インキュベーションによって検出されました。サンプルをマウントし、蛍光顕微鏡で分析しました。この手順を試みる間、RNAプローブの保護やRNAフリー条件下での作業による分解、およびRNAフリーの供給を使用することなど、さまざまなステップで魚の結果の広範なモザイクが観察されました。

この基本を習得すると、同じサンプル中の異なる RNA または特定のタンパク質マーカーを可視化するために、マルチラベリング体験を行うためのステップをメソッドに追加できます。このビデオを見た後、Drosophilaの胚形成Happy Fishing中にお気に入りのRNAの発現または細胞内局在ダイナミクスを文書化するために、C twoハイブリダイゼーションで蛍光を実行する方法についてよく理解できます。