Name: 逆行性冠灌流によってブタ心臓の脱細胞化するための手順 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: 学ぶ逆行性冠灌流によるブタ心臓の脱細胞化手法。洗浄液と酵素溶液を用いて細胞成分を除去し、部位特異的心臓細胞外マトリックススキャフォールドを作成する。この方法は組織工学や再生医療への応用が期待される。

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著者はブローガンゲスト、ミシェル·ウィーバー、そしてクリステンリッペルトを承認​​したいと思います。この研究のための資金は、NIHグラントR03EB009237ならびにNIHの訓練助成生体イメージングとバイオの国立研究所からT32EB001026-06とT32HL076124-05によって提供されました。

1。組織の準備と実験セットアップ<ol><li>食肉処理場や研究施設からすぐに安楽死の後に収穫豚の臓器と過剰血を洗い流す。心房と大動脈をそのまま維持し、余分な脂肪や組織の中心部をトリミングします。離れて大動脈から肺動脈を分離する脂肪トリミング。組織内の任意のカットがある場合は、適切に廃棄してください。 </li><li>冷凍庫の紙で個別にそれぞれの心をラップし、完全凍結を確実にするために、少なくとも24時間、-80℃の冷凍庫内のすべての組織を保管してください。 </li><li>ときに使用する（通常3ヶ月未満）、一晩4℃で4リットルのビーカーに沈めタイプ1の雪解け水1そのまま冷凍ブタ心の準備ができて</li><li>心が完全に解凍された後、心が乾いたなで心を量ると、体重を記録する。市場重量豚の心臓部は、約375〜450グラムの重量を量るべきである。 </li><li>とげのある減速機の¼ &quot;最後までサイズで18マスターフレックスチューブを接続します。有刺鉄線減速機を挿入し、大動脈内側チューブ。ちょうど腕頭動脈の下、大動脈周囲に2ホースクランプまたはセキュアジップタイを置きます。減速機とチューブは大動脈弁ので、冠状動脈が灌流することができます（図1）以上を保つ必要があります。 </li><li>タイプIの水でチューブを埋めるために30または60 mlの注射器を使用しています。そのおおよその中点でマスターフレックスローラーポンプのカートリッジ内にチューブを挿入します。流入水2.5リットルを充填した4リットルのビーカーの底にチューブの端とチューブを固定沈める。 </li><li>水、気泡を除去するためにプライムポンプを入れたビーカーに心を置きます。気泡がチューブが挿入されている大動脈から来て認められた場合には、大動脈には、追加の関係で再配置または確保する必要があるかもしれません。気密シールは脱細胞化処理（図2）の間に十分な圧力を維持することが重要です。 </li><li> 0.2パーセントTrypsin/0.05％EDTA/0.05％のNaN 3 Lを含む4リットルのビーカーを置きプレートをかき混ぜ、脱細胞化処理の準備で37℃に温めて上の3ソリューションを提供します。 </li></ol> 2。組織リンス<ol><li>正しいチューブサイズを選択していることを確認、400ミリリットル/分の流量にポンプを設定します。 15から25分間、私は水を入力して心臓をフラッシュします。ポンプが開始されると、心臓が心室から血液を膨潤し、発散させるべきである。新鮮なソリューションは、すべての5〜10分間に置換、あるいは心臓から削除される血液の量に基づいて、必要に応じなければならない。血液は心臓から流出していない場合は、必要に応じてチューブとクランプを調整します。 </li><li>ポンプを停止し、緩衝生理食塩水（PBS）2Xリン酸で満たされた別のビーカーに心を移す。チューブを溶液中に浸漬された後、ポンプを起動し、700 ml / minに流量を増加させる。心臓は、ソリューションごとに5分を変え、15分間溶液中に残るはずです。各ソリューションの変更は、組織とチューブを移動させながら、ポンプを一時的に停止させておく必要があり新しいビーカーに。 </li><li> 10分間、私は水を入力し、750 ml / minに流量を増加するために、心臓を転送します。 </li></ol> 3。脱細胞化とソリューション灌流<ol><li> 0.2パーセントTrypsin/0.05％EDTA/0.05％で、37のNaN 3℃の入ったビーカーに心を移す1200ミリリットル/分にポンプ速度を増加させ、ポンプを起動します。ビーカー中の溶液を循環させるためにビーカーの底に置か攪拌棒を使用しています。心臓は3時間の合計を37℃で0.2パーセントTrypsin/0.05％EDTA/0.05％のNaN 3溶液中に残るはずです。 1時間後、1,500 ml / minにポンプ速度を増加させる。追加の時間後、1,800 ml / minにポンプ速度を増加させる。組織は徐々に条件を組織に増加灌流速度を施し、血管の破裂を防止しています。心臓が膨張し、ほぼプロトコルのこのステップの間にサイズが2倍になります。組織は目を通して心房から頂点へと進行する、その自然な色を失うことになるメールプロトコル（図3）。 </li><li>各ソリューション灌流後、すすぎ2ステップは、細胞破片、化学残留物、援助、細胞溶解を除去するために行われている。すすぎが10分続くタイプI水ですすぎ、10分で構成されてそれぞれが室温で2X PBS溶液ですすいでください。各洗浄は、ソリューションをすすぎ追加、水没心臓を入れたビーカー内に灌流液を循環させ、元のビーカーから溶液の除去で構成されています。 1900ミリリットル/分で0.2パーセントTrypsin/0.05％EDTA/0.05％のNaN 3溶液、水灌流したあと、これを1950ミリリットル/分で2X PBSを灌流する。 </li><li>室温で3％トリトンX-100/0.05％EDTA/0.05％のNaN 3の溶液に心を移してください。 1時間2000ミリリットル/分であり、灌流液にポンプの速度を増加させる。ビーカーから溶液を除去し、新鮮な溶液と交換し、2100 ml / minにポンプ速度を増加させ、さらに1時間半の新鮮な溶液を灌流、合計時間を持ち込む3パーセントトリトンX-100/0.05％EDTA/0.05％NaN 3を 2.5時間に。 </li><li> 10分ごとに2180ミリリットル/分で2150ミリリットル/分と2XのPBSでタイプI水にティッシュを洗い流す。 </li><li>室温で4％デオキシコール酸ナトリウム液に心を移す。 2200ミリリットル/分および3時間灌流液にポンプの速度を増加させる。 </li><li>各ソリューションの5から10分後にソリューションを変更すると、15分ごとに2200ミリリットル/分でタイプIの水でと2X PBS中で組織を洗浄します。説明灌流手順が二回リンス工程を実施し、4℃で一晩添付のチューブと一緒に心を格納することにより、複数の日にわたって分割して、タイプIの水中に沈んでいる可能性があります。 </li><li>次の日は、5分、5分、1,500 ml /分で1×PBSですすぎ、続いて750ミリリットル/分でタイプIの水で洗い流し行う。プロトコルは、その後、適切な解決策で説明流量で継続することができる。 </li></ol> 4。消毒と最終処理<ol><li> 0.1％peracに心を移すETIC酸/ 2200ミリリットル/分で1.5時間、4％のエタノール溶液と灌流液。 </li><li>組織のための最終的なリンスは、すべての2200ミリリットル/分の速度で実行されます。タイプIの水に2分5回洗浄し、15分のための1×PBSで組織を灌流する。リンスのこのシリーズは、溶液灌流手続きを完了するために、もう一度繰り返されます。 </li><li>ポンプの電源をオフにして、心を排出するために、溶液から心臓を削除します。大動脈からの関係を断つ、すべてのチューブを取り外し、1時間排水するために、空のビーカーに心を置く。余分な液体は、定期的に排水する必要があります。完全に心を排出する吸収パッド（図4）に心を置きます。 </li><li>水の大部分が除去された後、心臓の細胞外マトリックス（C-ECM）の重量を記録する。心臓を脱細胞化処理中に、その初期重量の約20〜25％を失うことが予想される。 </li><li>右心室と左心室、ならびにDNA quantificatiための心室中隔を解剖上および組織学的処理の順序で組織の完全な脱細胞（図5）を確認します。 </li><li>凍結乾燥前に少なくとも2時間、-80℃で、C-ECMを凍結。 </li></ol>

<ol><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. Med. 16, 927-933 (2010).</li>
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</ol>

博士ギルバートは、研究が行われている間にACell、Inc。で科学諮問委員会にあったし、最近の研究開発担当副社長となりました。 ACell社は、膀胱行列を販売しており、本研究では商業的な利害関係はありません。

現在の研究では、ブタの心臓の一貫性のある効率的な脱細胞化するための方法論を説明した。プロトコルは、以前に発表した報告書1への変更であり、再現性の高い結果が得られた流量と圧力の上昇に長い露出が含まれていました。結果として脱細胞化組織は、組織2が正常細胞化のために発行基準のすべてを満たした。頻繁なソリューションの変更は組織に細胞物質の再導入を制限するために行われた、各細胞化剤への曝露の期間は、ECMへの悪影響を低減するために最小化されました。プロトコルの初期段階の間、灌流速度は徐々に状態に組織を増加させ、プロトコルの後の段階で、より高い流速を可能にします。早い段階で組織はエアコンなしでは、心臓の血管系が破裂することができ、心臓の血流を不可能。プロトCOLはその効率のために使用したところ、特許請求の範囲は、他のプロトコルを介して、その優位性に加えられません。脱細胞化剤と血流の速度の正確な組成は多分良好な機械的または生物学的特性を持つプロトコルをもたらすために変化しますが、心臓への薬剤の送達のための一般原則が適用されてもよい。 心臓のネイティブな...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>ギブコ</td><td> 15090 </td><td></td></tr><tr><td> EDTAを</td><td>フィッシャー</td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> NaN 3を </td><td>シグマ</td><td> S2002-500G </td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100 </td><td>シグマ</td><td> X100-1L </td><td></td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td>フィッシャー</td><td> BP399-20 </td><td></td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> D6750-500G </td><td></td></tr><tr><td>過酢酸</td><td>ファルツとバウアー</td><td> P05020 </td><td> 35％CAS番号79-21-0 </td></tr><tr><td>エタノール</td><td> Pharmco </td><td> 111000200 </td><td></tD&gt; </tr><tr><td>マスターフレックスポンプドライブ</td><td>コー​​ルパーマー</td><td> SI-07524から50 </td><td></td></tr><tr><td>マスターフレックスチューブ</td><td>コー​​ルパーマー</td><td> 96400から18 </td><td>サイズ18 </td></tr><tr><td>有刺鉄線リデューサー</td><td>コー​​ルパーマー</td><td> EW-30612から20 </td><td></td></tr><tr><td> 4Lビーカー</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 02-540T </td><td></td></tr></tbody></table>

逆行性冠灌流によってブタ心臓の脱細胞化するための手順

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

主に足場のネイティブアーキテクチャを維持しながら、灌流ベースの全臓器の脱細胞化は最近、サイト固有の細胞外マトリックスの足場を作成するための手段として、組織工学の分野で関心を集めています。現在までに、このアプローチは、心臓、肺、肝臓1月5日を含めて、臓器の様々なシステムで利用されている。簡単にアクセスできる血管網なしで組織のための前の脱細胞化法は、界面活性剤、酸、または周囲の細胞外環境6月8日から細胞および核成分を除去するための手段として、酵素処理のソリューションに対する組織の長期の暴露に依存してきた。しかし、拡散を介して組織に浸透するソリューションの能力に応じてこれらの方法ヒンジ式の有効性。 decellularizatiのとは対照的に、自然の血管系による臓器の血流を効果的に拡散距離を減少させ、促進輸送組織のうち、組織および細胞成分にエージェント上。ここで、我々は完全に冠状逆行灌流を通して無傷ブタの心臓をdecellularizeする方法について述べる。プロトコルは、無傷の心臓の3次元構造を完全に脱細胞化された心臓の細胞外マトリックス（C-ECM）の足場を得た。我々の方法は、酵素、界面活性剤、および細胞の溶解および除去を助けるため高張低張とリンスと相まって酸のシリーズを使用していました。プロトコルは、細胞物質の除去を助けるためにTriton X-100およびデオキシコール酸ナトリウム溶液に続くマトリックスから細胞を分離するためにトリプシン溶液を使用していました。説明されたプロトコルはまた、長時間の2リットル/ min以上の灌流速度を使用します。細胞破片の汚染なし、組織への薬剤の輸送許可ソリューションの変更と相まって、高流量、および組織のリンス効果を確実にした。記載された方法はNATIからすべての核物質を除去様々なアプリケーションに使用することができ、サイト固有の心臓ECMの足場を作成VEブタ心臓組織、。

全体ブタの心臓に脱細胞化の効果は自然に大きさの違い、圧力、容器の配置によって変化する。従って、細胞外マトリックス由来の足場の正確な組成は、心臓から心臓に同じにはなりません。説明されたプロトコルの完了は、細胞材料の損失を示す、白色または半透明表示される心臓を得ることができます。しかし、それは広く組織はさらにいくつかの定量的なパラメータ8の組み合わせに基づいて、 &quot;脱細胞化された&quot;と考えることができることが認められている。成功した脱細胞化プロトコルは、組織1mgあたりの二本鎖DNA（図6）に比べ50 ngの行列を生成します。行列の移植の際に宿主免疫応答を回避するために、残りのDNAは、200未満の塩基対（図7）を含める必要があります。これらの知見を確認するには、ヘマトキシリン​​及びエオシン染色は、核の有無を明らかにする必要があります心室と心室中隔の代表的なセクション（図8）で染色。マッソントリクロームは、さらに心臓の筋束とコラーゲンネットワークの保持<strong...

迅速かつ完全に逆行灌流を通して無傷ブタ心臓から細胞成分を除去するための方法が記載されている。この方法は、複数の臨床アプリケーションで使用するための可能性を秘めているサイト固有心筋細胞外マトリックス足場が得られます。

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

この手順の全体的な目標は、逆行性の増殖を通じて無傷のブタの心臓から細胞成分を迅速かつ完全に除去し、部位特異的な心臓細胞外マトリックス足場を生成することです。これは、最初に無傷のブタの心臓の大動脈であるカニューレを挿入することによって達成されます。次に、チューブを蠕動ポンプに取り付け、組織を水と塩溶液で低流量で洗浄します。次に、心臓に一連の洗剤と酵素溶液を徐々に増加させる流量で灌流し、細胞成分を除去します。最後のステップは、消毒液を灌流することです。チューブを取り外し、心室壁を切り取って処理します。最終的に、心臓を分析して、組織から細胞物質と核物質が完全に除去されたことを確認します。チューブの正確な位置が実験の成功の鍵となるため、カニューレ挿入と初期重複ステップを学ぶのが難しいため、この方法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。ブタの臓器は、安楽死の直後に食肉処理場または研究施設から入手されます。余分な血液を洗い流すことから始めます。次に、心房と大動脈を無傷に保ちながら、余分な脂肪と組織の心臓を切り取ります。追加の脂肪を切り取ることにより、肺動脈を大動脈から分離します。トリミングしたら、各ハートを個別に冷凍紙で包み、摂氏マイナス80度で少なくとも24時間保存して、完全に凍結します。使用する準備ができたら、タイプ1の水を入れた4リットルのビーカーに心臓を沈めて解凍し、摂氏4度で一晩放置します。心臓が完全に解凍されたら、パッドをして乾かし、その重量を記録します。市場体重の豚の心臓の体重は約375〜450グラムであるべきです。心臓の準備ができたら、サイズ18のマスターフレックスチューブをとげのあるレデューサーの4分の1インチの端に接続します。次に、とげのあるレデューサーとチューブを大動脈の内側に挿入します。腕頭幹のすぐ下の大動脈の周りに2つのホースクランプまたは固定ジップタイを配置します。レデューサーとチューブは、冠状動脈を灌流できるように、大動脈弁の上に留まる必要があります。次に、シリンジを使用してチューブにタイプ1の水を入れ、マスターフレックスローラーポンプのカートリッジのほぼ中間点に挿入します。次に、チューブの流入端を心臓と一緒に2.5リットルの水で満たされたビーカーの底に沈め、固定します。この手順の最も難しい側面は、心臓の適切なカニューレ挿入と、手順全体で適切なポンプ速度を維持することです。私たちは、手術中に組織の気泡を目視検査し、手術中に心室からの適切な滲出液を維持することで、実験の成功を保証します。ポンプをプライミングして、チューブから気泡を取り除き、気泡が観察された場合は、大動脈とチューブの周りに追加のタイを再配置するか、固定します。気密シールは、脱細胞化プロセス中に適切な圧力を維持するために重要です。この時点で、脱細胞化プロセスの準備として、3リットルの塩バランストリプシン溶液を含む4リットルのビーカーを温めます。まず、ポンプを毎分400ミリリットルの流量に設定し、正しいチューブサイズが選択されていることを確認します。ポンプを始動し、15〜25分間タイプ1の水で心臓を洗い流すと、心臓が腫れて心室からの血液が拡散し、新鮮な溶液が5〜10分ごとに、または必要に応じて置き換えられます。血液が除去された後、ポンプを停止し、心臓を2つのXPBSで満たされた別のビーカーに移します。チューブを沈めます。流量を毎分700ミリリットルに増やし、ポンプを始動します。心臓を溶液に15分間放置し、5分ごとに溶液を交換します。準備ができたら、心臓を1つの水に10分間移し、流量を毎分750ミリリットルに増やします。脱細胞化プロセスを開始するには、温かい塩分バランストライイン溶液を含むビーカーに心臓を移します。速度を毎分1200ミリリットルに上げ、ポンプを始動します。ビーカーの底に攪拌棒を置いて循環させ、心臓をこの溶液に3時間放置します。灌流速度はゆっくりと上げられ、組織をコンディショニングし、血管の破裂を防ぎます。1時間後、ポンプ速度を毎分1500ミリリットルに上げます。さらに1時間後、ポンプ速度は毎分1800ミリリットルに増加します。心臓は腫れ、サイズがほぼ2倍になるはずです。組織は、心房から頂点に向かって進行する自然な色を失うはずです。各溶液の灌流後、細胞の破片、化学物質の残留物を除去し、細胞溶解を助けるために2段階のすすぎが行われます塩バランスのトリップと溶液の後、毎分1900ミリリットルで水を灌流し、次に毎分1950ミリリットルで2つのXPBSをそれぞれ10分間灌流します。次に、心臓をTriton X 100の室温の塩バランス溶液に移します。ポンプ速度を毎分2000ミリリットルに上げ、1時間灌流します。新鮮な溶液を補充した後、ポンプ速度を毎分2100ミリリットルに上げ、さらに1時間半灌流します。次に、前に示したように、ポンプ速度を上げて組織をすすぎます。次の灌流は、室温の4%デオキシナトリウムコートです。ポンプ速度を毎分2200ミリリットルに上げ、3時間灌流します。3時間後、すすぎ手順を繰り返し、5〜10分後に溶液ごとに溶液を交換します。最終灌流後、心臓を0.1%パラセチン酸、4%エタノール溶液に移し、同じポンプ速度で毎分2200ミリリットルで1.5時間灌流し、組織に1つのXPBSを15分間灌流した後、タイプ1の水で5分間の洗浄を2回行います。もう一度繰り返して溶液の灌流手順を完了し、ポンプをオフにして、溶液から心臓を取り出します。大動脈からネクタイを切ります。すべてのチューブを取り外し、心臓を空のビーカーに入れて1時間排水します。1時間後に定期的に余分な液体を取り除きます。.心臓を吸収パッドの上に置いて、さらに排水します。ほとんどの水が取り除かれたら、心臓の最終的な重量を記録します。心臓は、脱細胞化プロセス中に初期重量の約20〜25%を失う可能性があります。このプロセスの終わりに、心臓は白くまたは半透明に見えるはずで、細胞物質の喪失を示しています。次に、心室中隔と右心室と左心室を分離し、DNA用に予約します。定量および組織学的処理により、サンプルは低温摂氏80度で凍結され、凍結乾燥の前に少なくとも2時間凍結されます。ここで、脱細胞化の成功は、天然の心室と比較した場合のDNA含有量の大幅な減少によって実証されています。このゲルは、膀胱マトリックスまたはUBMと比較した場合、脱細胞化した心室にほとんど残存していないことを示しています。この例では、ヘマットインとエオシンの染色により、心室から核物質が完全に除去されていることが示されています。マッソンの染色は、この手順を試みている間、心筋束の喪失とコラーゲンネットワークの保持をさらに確認します。組織と冠状動脈を頻繁に目視検査することが重要です。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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マウスからの心筋細胞分離のための前向きの灌流法

我々は、ブタ異所性心臓移植モデルにおける心臓同種移植片全体への治療薬の送達のために、正常温熱 エクスビボ...

心臓同種移植への治療薬の送達のためのブタヘテロトピック心臓移植プロトコル

プロトコルは、カスタマイズされた灌流バイオリアクター内のフラップ血管系を介したドデシル硫酸ナトリウム界面活性剤の灌流による血管化ブタフラップの外科的調達とその後の脱細胞化について説明しています。...

カスタマイズされた灌流バイオリアクターにおけるブタ血管化フラップの調達と灌流-脱細胞化

冠動脈疾患のスクリーニングは、基準が拡張されたドナー心臓の調達を増やす可能性があります。 ex-situ...

ブタモデルにおけるex-situ心臓灌流中の冠動脈造影

ここでのプロトコルは、同種移植片の ex vivo 灌流を利用した循環死後の提供後の心臓移植の高忠実度ブタモデルについて説明しています。...

循環器死後の提供後の同所性心臓移植の高忠実度ブタモデル

学ぶ逆行性冠灌流によるブタ心臓の脱細胞化手法。洗浄液と酵素溶液を用いて細胞成分を除去し、部位特異的心臓細胞外マトリックススキャフォールドを作成する。この方法は組織工学や再生医療への応用が期待される。

逆行性冠灌流によってブタ心臓の脱細胞化するための手順

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