生細胞中のタンパク質凝集の4Dイメージング

この実験システムは、生細胞内の高解像度3D蛍光画像を取得し、タンパク質フォールディング品質管理の時空間ダイナミクスを監視およびアッセイします。まず、急速に移動するタンパク質複合体を研究するために細胞を準備します。高Z解像度で画像のZスタックを取得します。

次にザックスで構成される時系列を取得し、結果の画像を3Dムービーでレンダリングして、結果の画像を分析します。最終的に、4Dイメージングは、さまざまな条件で細胞内の動的および一過性現象を追跡することを可能にします。広視野顕微鏡やタイムラプスなどの既存の方法と比較した場合の4Dイメージングの主な利点は、細胞内のタンパク質の全集団のダイナミクスと空間的時間分布を高解像度で同時に視覚化できることです。

この方法は、タンパク質の凝集、品質管理、およびタンパク質のフォールディングに関する細胞生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。これらは非常に動的で一時的なプロセスです。したがって、高い時間的および空間的解像度がなければ、それらの多くは観察不可能です。

この手法により、アグリゲーションの品質管理に関する洞察を得ることができます。また、タンパク質の相互作用とダイナミクスの研究に革命をもたらす可能性もあります。一般に、この方法に不慣れな個人は、内因的にタグ付けされたタンパク質または低発現タンパク質の3Dムービーを撮影するにはシステムの安定性が必要であるため、苦労するでしょう。

高感度・低光退色 UBC nineの温度感受性変異体のように、細胞質フォールディングセンサータンパク質に結合したFluorの融合タンパク質の発現プラスミドで酵母株を形質転換します。2%ラフィノースを含む合成培地で酵母を24時間増殖させ、その後、2%ガラクトース含有培地に希釈し、クエリ株を約0.2のOD 600に一晩希釈し、イメージングの30分前に0.8〜1.0のOD 600に達するまで4〜6時間培養しますイメージングの30分前に。2%グルコースを添加した合成培地で発現を抑制します。

このステップでは、発現タンパク質のすでに翻訳およびフォールディングされたプールのみをモニタリングできます。次に、摂氏37度で細胞に20分間熱衝撃を与えます。ミスフォールディングを誘発するには、4回のD.Imaging撮影中にピントを維持するための適切なプレートを選択します。

プレートの底を0.25ミリグラム/ミリリットルのcon Aで10分間覆います。Con Aは、細胞をスライドに接着するために使用され、これにより、単一の細胞を経時的に追跡することができます。con Aとarrowを吸引し、ケミカルフードでプレートを乾燥させます。

次に、200マイクロリットルの酵母サンプルを追加します。15分間インキュベートして、細胞がプレートに接着できるようにします。培地で3回の洗浄を行い、酵母イメージング用の細胞の単層を得ます。

共焦点顕微鏡は、添付のテキストで詳しく説明されているように、いくつかの非標準的な変更を加えて使用してください。この酵母イメージングシステムは、最大4つのレーザーとフィルターを備えた最大4つの光増倍管を使用します。私たちのイメージングのほとんどは、EGFP用の緑色フィルターセットと、mチェリーとTDトマト用の赤色フィルターセットで行われています。

また、共焦点にpi nano pizoステージパーフェクトフォーカスシステムを装備し、ガルバンOスキャナーとレゾナントスキャナーの両方が目的の温度に達するまで顕微鏡システムを平衡化します。イメージング媒体とサンプルの媒体の屈折率に基づいてイメージングする前に、適切な対物レンズの水、油、または空気を選択します。プレートの厚さに応じて修正カラーを調整します。

レンズワイプとエタノールを使用して対物レンズを清掃します。また、サンプルを運んでいるスライドを清掃します。プレートをステージホルダーにしっかりと置き、サンプルホルダーの安定性を確認して、すべてのサンプルに正しい設定があることを確認します。

蛍光ビーズを使用しながら補正環を調整し、アイポートでの点像拡げ機能を可視化します。酵母の位置と向きを決定します。次に、必要な蛍光灯のエピライトをオンにし、関連する表現型を示す細胞に焦点を合わせます。

次に、明視野を使用して、細胞の生存率を評価するための形状とテクスチャに従って細胞の健康と生存率を評価します。TD トマトフローラ Fluor を SV 40 および LS シグナルに融合させて核を可視化します。TFPはGFPの2倍の大きさです。

核の拡散限界を超えているため、核マーカーとして非常にうまく機能します。GFPと同時に緑色の4 88ナノメートルレーザーでTFPを励起しますが、スペクトル分解能のために緑と赤の放射を2つの別々のPMTに収集します。ノイズと飽和を最小限に抑えるには、付属の原稿に詳述されているように、レーザー出力とピンホールの直径を調整します。

異なるフローラ力が合同波長を放出する場合、仮想フィルターの選択を可能にするスペクトル検出器機能を使用して、実験デザインに従ってタイムラプス画像を取得し、ミスフォールドタンパク質U BBC nine Tsは、時間と空間にわたる凝集品質管理を追跡するためのモデルシステムを提供します。許容温度のサイトゾルでは、UBC nine Tsは、熱によるミスフォールディングにより、核とサイトゾルで折り畳まれて拡散します。それは最初に、プロテアソーム分解のために処理される急速に拡散する小さな細胞質凝集体涙点を形成します。

プロテアソームが部分的に阻害されると、これらのプンクタは約2時間かけてジャンク品やiPodのインクルージョンに変換されます。通常の条件下では、GFP UBC nine Tsは天然に折り畳まれており、この緑色で見られるように、細胞質核内でびまん性に局在しています。温度が摂氏37度に変化すると、融合タンパク質は誤って折り畳まれ、摂氏23度の熱ショックから回復すると細胞質涙点凝集体を形成します。

熱変性したG-F-P-U-B-C nine Tsは、蛍光レベルの低下によって示されるように劣化します。原子核はN-L-S-T-F-Pで赤くラベル付けされています。摂氏37度への温度シフトがプロテアソーム阻害と組み合わされると、G-F-P-U-B-Cの9つのTは誤って折りたたまれ、ジャンクとiPodのインクルージョンに処理されます。

ここでは、ユビキチンプロテアーゼ4が過剰発現してユビキチン化を阻害し、ユビキチン化の阻害を阻害するとともに、温度シフトの結果、G-F-P-U-B-C nine TsがiPod Inclusionに処理される。4分間隔で撮影されたこれらのタイムラプス画像は、ジャンクとiPodの形成のダイナミクスをはっきりと描いています。この手法は、UBC nine Tsをフォールディングセンサーとして使用することにより、細胞のタンパク質スタシスを経時的に監視するために使用できます。

4Dイメージングは、哺乳類細胞やC Eleganceなどの他のモデルシステムでも行うことができます。また、4Dイメージングでは、可溶性凝集体ストレス病巣の形成とダイナミクス、ジャンクやiPodコンパートメントへの凝集体の送達など、凝集品質管理における他の微妙なイベントについての洞察も可能になります。