Name: 上のシステイン残基の溶媒アクセシビリティの分析トウモロコシrayadoフィノウイルスウイルス様粒子 Nicotiana benthamianaの植物と架橋 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 学ぶウイルス様粒子のシステイン残基の溶媒アクセシビリティ分析とペプチド架橋法。トウモロコシrayadoフィノウイルスをNicotiana benthamianaで発現し、ナノテクノロジー応用のための機能化VLPスカフォールドを作成する。

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1。 Nicotiana benthamianaの植物からウイルス接種とVLPの精製<ol><li> ポテトウイルス X（PVX）ベース運ぶベクタープラスミドから頂いた、T7-RNA転写産物を生成MRFV野生型（WT）およびCys変異コートタンパク質（CP）遺伝子12、AmbionのT7-mMessage mMachineキットを使用しています。 </li><li>各T7転写反応には、Nの2の完全展開葉に接種10μlの反応と、25で光（25,000-30,000ルクス）で16時間、60％の湿度で、温室内で10日間インキュベートbenthamianaの植物を20℃と暗8時間℃の</li><li>ハーベストンN. benthamianaのウイルスに感染した葉は10日後に接種（DPI）は、氷の上で植物組織（50グラム）と場所を量る。 </li><li> 0.5Mのクエン酸ナトリウム緩衝液（pH 5.5）（植物組織1グラムあたり緩衝液2mlを使用）の冷却溶液を100mlの存在下でブレンダーで植物材料をホモジナイズする。 </li><li> cheeseclの3つの層を通ってホモジネートをフィルタリングOTH、30分間27000×gで遠心分離することにより明らかにする。冷やしたメスシリンダーに上清を移し、体積を測定した後、冷却した無菌のビーカーに移す。ペレットを廃棄します。 </li><li> 、10％ポリエチレングリコール8000（PEG 8000）を添加することにより上清を処理し、4℃で15分間撹拌し、4℃でさらに45分間インキュベート℃のウイルス様粒子（VLP）-PEGのマトリックスを沈殿させる。 </li><li> 4℃で20分間27000×gで遠心し、上清を除去します。 </li><li> pH5.5のTriton X-100を2％含む、0.05Mクエン酸ナトリウム緩衝液8mlを加えることによってペレットを処理します。渦巻遠心管はよくペレットを解放します。チルド滅菌ビーカーにペレットとバッファを転送します。同じ緩衝液2mlで直ちにチューブをすすぎ、ビーカーに加える。ペレットは（一般的に1時間）に溶解するまで4℃で懸濁液をかき混ぜる。 </li><li> 27000×gで5分間遠心分離することにより明らかにし、ペレットを廃棄し、process 4℃で2時間14万xgで遠心分離により上清℃、 </li><li> 1ミリリットルの0.05Mクエン酸ナトリウム緩衝液（pH 5.5）でペレットを再懸濁し、0.05Mのクエン酸ナトリウム緩衝液（pH 5.5）で行われた百分の10から40のショ糖勾配の上に懸濁液を配置します。 </li><li> 4℃14万xgで3時間勾配を遠心</li><li>遠心管の上に光を当て、管の上部から4 cmの光散乱上部のバンドを集めて、4℃で0.05Mのクエン酸ナトリウム緩衝液（pH 5.5）、14万×gで3時間遠心機で薄める℃の</li><li> 6ヶ月まで4℃で滅菌水、店舗の0.5mlにペレットを再懸濁します。 </li><li> Bradfordタンパク質アッセイを行うことにより、VLPの濃度を定量する。 VLPの収量は植物組織の1〜3μg/ gである。 </li></ol> 2。 VLPのフルオレセイン-5 - マレイミド標識反応<ol><li> 50mMリン酸ナトリウムphosphatにおけるフルオレセイン-5 - マレイミド（427.37グラム/モル）の1mM溶液を調製電子緩衝液（pH7.0）、1 mMのEDTA。ボルテックスを用いて混和し完全に溶解させていることを確認します。アルミ箔を使用して光からチューブを保護します。 </li><li>ステップ1とミックスで生産のVLPにフルオレセイン-5 - マレイミドを追加します。スルフヒドリル基のモル量のフルオレセイン-5 - マレイミドの25倍モル過剰に使用します。一般的に、1μg/μLのとフルオレセイン-5 - マレイミド溶液60μlの濃度でVLPの30μlを使用すると、許容可能な結果を​​生成します。 </li><li> 4℃の室温で、または一晩で2時間反応をインキュベート</li><li> 50mMの最終濃度までジチオスレイトール（DTT）を加えて反応を終了します。 </li><li>削除する非反応は室温で1500×gで2分間脱塩スピンカラム（サーモサイエンティフィック社は、ロックフォードIL）と遠心分離を用いてフルオレセイン。 </li><li> SDS-PAGE分析では、各反応液10μlに2×SDS-PAGEのLaemmliサンプルバッファー10μlを加える。 4℃で光から保護標識タンパク質を格納するまでの1ヶ月間、Cまたは最大3ヶ月まで-20°Cで単回使用アリコートインチ</li></ol> 3。ビオチン定款のラベリング反応と定量<ol><li>水からのリン酸緩衝食塩水（PBS）、ステップ1で作製したVLPのpH7.0に緩衝液交換を実行するために脱塩スピンカラム（サーモサイエンティフィック社は、ロックフォード、IL）を使用します。 </li><li>ピペッティングによりマレイミド-PEG2-ビオチンとミックスを無計量でのPBS 190μlを添加してマレイミド-PEG2-ビオチンの20mMストック溶液を調製します。 </li><li> VLPおよびミックスにマレイミド-PEG2-ビオチンを追加します。 VLPのソリューション≤2 mg / mlのための試薬の10倍モル過剰に使用します。 </li><li> 4時間室温で反応をインキュベートする。 </li><li>マレイミド-PEG2-ビオチンは、室温で1500×gで2分間脱塩スピンカラム（サーモサイエンティフィック社は、ロックフォードIL）と遠心分離法を用いて非反応削除します。 </li><li>ピアースビオチン定量キット（サーモサイエンティフィック）とFOを使用したVLPのモル当たりビオチンのモル数を決定するメーカーの指示に従ってllowing。 </li></ol> 4。 Cysは2-VLPおよびFのペプチドの架橋<ol><li> （2-VLPはCys）は、ステップ2で、架橋のために利用可能なシステイン残基をもたらしVLPは、次のステップで使用されます。ジメチルスルホキシドの680μlのNHS-PEG4-マレイミド架橋剤10mgを溶解させることにより、新鮮な架橋原液（28.63 mM）を準備します。 </li><li> 0.1 mMの濃度で、結合緩衝液50μlの17（F）-アミノ酸長のペプチド（LLPNMOKDKEACAKAPL）（1mM EDTAを1×PBS緩衝液、pH7.2）に溶解する。 </li><li> 1mMの最終濃度（ペプチド溶液の0.1mMのために、10倍モル過剰である）で溶解したペプチド（タンパク質-NH2）50μlに架橋剤の4μlを添加する。 </li><li> 4℃で2時間反応をインキュベート</li><li> 1500 xgで遠心分離により、結合緩衝液（1mM EDTAを1×PBS、pH 7.2）で平衡化した脱塩カラム（サーモサイエンティフィック社は、ロックフォード、IL）を用いて架橋されたペプチドを精製する室温で1分間。 </li><li> VLPは（タンパク質-SH）と反応し、VLPおよびペプチドの間の分子量の差に関与チオールと活性アミンの数によって決定されるモル比で架橋されたペプチド（タンパク質-NH2）を組み合わせた反応混合物を設定します。 </li><li> 4℃で2時間室温で反応混合物をインキュベート</li><li>ウェスタンブロット分析は、Laemmli緩衝液、10分間沸騰させ、結果として得られると共役製品1:1に混ぜて10〜20％Tris-グリシンゲル（Invitrogen）プレキャストのSDS-PAGEに進み、上にエレクトロ続くニトロセルロース膜（Invitrogen社）。 1×PBS緩衝液（pH7.2）、0.05％のTween-20（PBS-Tween）でかつ適切なホスファターゼ標識二次抗体、ペプチド特異的抗体を用いて、5％スキムミルク粉末及びプローブを含有する膜をブロックします。 </li></ol>

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</ol>

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ここで紹介する方法は、植物生産VLPの表面上だけでなく、他のタンパク質複合体上に存在する反応性のシステインの非常に高感度で迅速な分析を可能にします。マレイミドは安定なチオエーテル結合を形成する遊離スルフヒドリル含有分子と反応チオールに特異的な試薬である。この方法は、他のアミノ酸との相互作用に関与していないスルフヒドリル基と反応するマレイミドの特異性を利用している。 VLPのネイティブ構造を維持するのは、全体のプロセスを介して非常に重要です。記述されたアプリケーションでは、反応がVLPの本来の構造を維持するために、ネイティブの条件で、pH 7で実行されます。中性pHにおいて、マレイミドは遊離スルフヒドリル基との最適な反応性を有する。これは、モディフィケーションにアクセス可能なシステインにフルオレセインまたはビオチンのいずれかで、VLPのラベル付けができます。 軽度のpH（6.5から7.5）と緩衝液の条件はまた、架橋に用いられている反応。 VLPは上の官能基の数は、架橋剤とVLPの間の適切な比率を決定する。タンパク質の比が低い架橋剤は多くの官能基が存在する場合に使用することができます。...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>薄肉、超クリアチューブ</td><td>ベックマン</td><td> 344059 </td><td></td></tr><tr><td> mMESSAGE mMACHINE T7キット</td><td>ライフTecnologies </td><td> AM1344M </td><td></td></tr><tr><td>フルオレセイン-5 - マレイミド</td><td>サーモサイエンティフィックライフテクノロジーズ</td><td> 46130 F150 </td><td> 46130は、F150との順序の代用外です</td></tr><tr><td>ピアースビオチンの定量キット</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 28005 </td><td></td></tr><tr><td> EZ-Linkのマレイミド-PEG2-ビオチン、無計量フォーマット</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 21901 </td><td></td></tr><tr><td> SM（PEG）のn個の架橋剤</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 22107 </td><td></td></tr><tr><td> 10から20パーセントトリス - グリシンゲル</td><td>インビトロジェン</td><td> EC61352 </td><td></td></tr><tr><td> Laemmli緩衝液</td><td>バイオ·ラッド</td><td> 1610737 </td><td></td></tr><tr><td>トリスグリシンSDSランニングバッファー</td><td>インビトロジェン</td><td> LC2675 </td><td></td></tr><tr><td>トリスグリシン転送バッファ</td><td>インビトロジェン</td><td> LC3675 </td><td></td></tr><tr><td>ニトロセルロース膜フィルターペーパーサンドイッチ</td><td>インビトロジェン</td><td> LC2001 </td><td></td></tr><tr><td>ウサギIgGに対する抗体を精製ホスファターゼ標識アフィニティ</td><td> Kirkegaardとペリーラボラトリーズ</td><td> 0751516 </td><td></td></tr><tr><td> NBT / BCIPホスファターゼ基質</td><td> Kirkegaardとペリーラボラトリーズ</td><td> 508107 </td><td></td></tr></tbody></table>

上のシステイン残基の溶媒アクセシビリティの分析<em&gt;トウモロコシrayadoフィノウイルス</emで生産&gt;ウイルス様粒子<em&gt; nicotiana benthamianaの</emvlpは、ペプチドの&gt;植物と架橋

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

ウイルスの特性と物理化学的および物理的特性を模倣して、利用することは、世界の最も緊急の課題のいくつかの解決策を提供する可能性を秘めています。薄手の範囲およびそれらの魅力的な特性と相まってウイルスの種類は潜在的にウイルスベースの技術でのアプリケーション用に無限の機会を与える。ウイルスは温度とpH幅広い条件下で離散形状や大きさ、対称性の特異性、多原子価、安定した特性を有する粒子に自己組織化する能力を持っています。驚くことではないが、プロパティのような顕著な範囲で、ウイルスが生体材料9、ワクチン14、15、電子材料、化学ツール、および分子の電子コンテナ4、5、10、11、16、18、12で使用するために提案されている。 ナノテクノロジーでウイルスを利用するためには、それらが新たな機能を付与するために彼らの自然なフォームから変更する必要があります。この挑戦的なPRocessはウイルスゲノムの遺伝子改変を含むいくつかのメカニズムを介して行われ、化学的にウイルス粒子の反応性基を8に外国又は所望の分子を結合することができます。ウイルスを変更する機能は、主にウイルスの物理化学的および物理的特性に依存します。また、遺伝的または物理化学的修飾は、悪影響ウイルスネイティブ構造とウイルス機能に影響を与えずに実行する必要があります。 トウモロコシrayadoフィノウイルス （MRFV）コートタンパク質は、タンパク質-タンパク質によって安定化されて安定しており、空のVLPを生産する大腸菌で自己集合相互作用とそのウイルスベースの技術アプリケーション8で使用することができます。タバコ工場で生産VLPはペプチドの様々な共有結合13に表示することが可能な足場として検討した。ここで、我々は、1）の手順について説明しMODIFIできますウイルスキャプシドの溶剤アクセスシステインの判別陽イオンと、2）修正されたカプシドにペプチドをバイオコンジュゲート。ネイティブまたはmutationally -挿入されたアミノ酸残基および標準カップリング技術を使用することにより、多種多様な材料は、 ブロムモザイクウイルス 3、 カーネーション斑紋ウイルス 12、 ササゲ退緑斑紋ウイルス 6、 タバコモザイクなどの植物ウイルスの表面に表示されているウイルス 17、 カブ黄斑モザイクウイルス 1、MRFV 13。

Nの変異MRFVコートタンパク質（CP）遺伝子の一過性発現PVXベースのベクター生産VLPにおけるbenthamianaの植物は、 図1に記載されている。修正MRFVコートタンパク質遺伝子をPCRで増幅された後、PVX-basedベクター、pP2C2S 2、（D. Baulcombeの贈り物、セインズベリー研究所、ノーリッチ、イギリス）で重複サブゲノムCPのプロモーターの転写制御下に置かれた。 にあるインビトロ RNA転写はその後Nを接種するために使用されるRNA転写産物を生成benthamianaの植物 。感染した植物では（ 図2A）MRFV-CPのサブユニットは容易に精製されたVLP（ 図2B）を形成する 。その後、VLPはペプチドに架橋されています。 MRFVコートタンパク質の反応性アミノ酸の例を<strong...

のシステイン残基のチオール基の溶媒アクセス可能性を分析する手法<em&gt;トウモロコシrayadoフィノウイルス</emペプチド架橋反応が続く&gt;（MRFV）ウイルス様粒子（VLP）が記述されている。メソッドは、特定の反応のためのターゲットに設定することはできないVLPの表面上の複数の化学物質グループの可用性を活用しています。

上のシステイン残基の溶媒アクセシビリティの分析<em&gt;トウモロコシrayadoフィノウイルス</emで生産&gt;ウイルス様粒子<em&gt; Nicotiana benthamianaの</emVLPは、ペプチドの&gt;植物と架橋

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

本実験の全体的な目的は、ウイルス様粒子（VLP）表面のシステイン残基の溶媒露出解析を行い、続いてVLP上のシステインにペプチドを架橋させることです。まず、ジャガイモウイルスXベースのウイルスベクターにトウモロコシレイアドフィノウイルス（MRFV）のコートタンパク質をクローニングします。次に、改変されたウイルスをN. benthamianaに接種し、コートタンパク質から形成されたMRFV VLPを精製します。最後に、ammonia-PEG4-maleimideを用いてVLPとペプチドを架橋し、ウェスタンブロット法で検出します。その結果、ウェスタンブロット解析を通じてVLP-ペプチド複合体の生成が確認されます。この手法は、ナノテクノロジーのための新素材を製造するための、ウイルスおよびウイルス様粒子の表面を化学的に修飾する方法に関する知見を広げるものです。MRFVの野生型およびシステイン変異型外殻タンパク質遺伝子を搭載したジャガイモウイルスXベースのベクタープラスミドからキャップ付きT7-RNA転写物を合成した後、10 µLずつの2つの分注液を用いてN. benthamianaの葉2枚に接種します。植物を温室内で、湿度60％、25 °Cで16時間の明期、20 °Cで8時間の暗期の条件下で10日間培養します。培養終了後、ウイルス感染した葉を採取し、植物組織の重量を測定して氷上に置きます。テキストのプロトコルに従ってウイルス様粒子（VLP）を精製した後、50 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.0、1 mM EDTA）を用いて、1 mMのフルオレセイン-5-マレイミド溶液を調製します。ボルテックスで完全に溶解させ、アルミホイルを使用して溶液を遮光します。1 µg/µLのVLP約30 µLとフルオレセイン-5-マレイミド60 µLを混合し、室温で2時間、または4 °Cで一晩インキュベートします。最終濃度50 mMになるようにDTTを添加し、反応を停止させます。脱塩スピンカラムを用いて、未反応のフルオレセインを除去します。架橋可能なシステイン残基を持つVLPを可視化するため、各反応液10 µLに2xサンプルバッファー10 µLを添加し、SDS-PAGE分析を行います。標識したタンパク質は、遮光して4 °Cで最大1ヶ月間、または単回使用分に分注して-20 °Cで最大3ヶ月間保存してください。10 mgのNHS-PEG4-maleimide架橋剤を680 µLのジメチルスルホキシドに溶解し、新鮮な架橋剤ストック溶液を調製します。17残基の(F)-アミノ酸ペプチドを50 µLのコンジュゲーションバッファーに溶解し、濃度を0.1 mMに調整します。溶解したペプチド50 µLに、最終濃度が1 mMとなるよう架橋剤を4 µL添加します。4 °Cで2時間反応させます。その後、脱塩カラムを用いて反応物を精製します。架橋に使用可能なシステイン残基を持つVLPと、架橋したペプチドを用い、反応に関与するチオール基および活性化アミン基の数と、VLPとペプチドの分子量の差に基づき決定したモル比で反応混合液を調製します。室温で2時間反応させた後、テキストプロトコルに従ってSDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングを行います。MRFVコートタンパク質の反応性アミノ酸の例をここに示します。選択された各アミノ酸は、表面に露出していれば、官能基を結合させるために利用可能です。化学的手法には、リジンのアミノ基のアシル化、システインのスルフヒドリル基のアルキル化、およびカルボン酸残基の活性化と添加アミンとのカップリングといった、従来のバイオコンジュゲーション戦略が含まれます。さらに、チロシンおよびトリプトファンの芳香族基は、ジアゾ化およびアルキル化によるバイオ共役の魅力的な標的となり得ます。ここでは、VLPのCys残基に対するチオール特異的試薬の溶媒アクセシビリティについて示しています。精製された野生型VLP、およびCP遺伝子の107〜111番目と192〜194番目の位置にシステイン残基を持つcys-VLP変異体は、天然条件下ではチオール特異的試薬と反応しません。フルオレセイン-5-マレイミドは、CP遺伝子の125〜129番目の位置にシステイン残基を持つCys-VLP変異体のみにオレンジ色の蛍光を付与します。この結果は、レーン2のVLPが、溶媒に露出した遊離チオール基をもたらすシステイン残基の幾何学的配置を有している一方で、レーン1および3のサンプルのシステイン残基は、おそらくコートタンパク質のフォールディングにおけるジスルフィド結合に関与していることを示しています。マレイミド-PEG2-ビオチンを用いた標識反応と、それに続くビオチン化アッセイは、cys残基の溶媒アクセシビリティ解析のもう一つの例です。ビオチンは比較的小さな分子であるため、VLP上に複数のコピーを共役させることができ、それぞれがここで示されているように1分子のアビジンと結合します。ビオチン化のレベル（タンパク質1モルあたり84.74モルのビオチン）は、VLPに結合したビオチン分子の数、ひいては外表面に提示可能なリガンドの数を示しています。VLP上に複数のチオール基が利用可能であるため、NHS-PEG4-マレイミドを用いた架橋反応によってペプチドを付着させることができます。この試薬は、N-ヒydroキシコハクシミド（NHSエステル）およびマレイミド基などの反応性末端を持つヘテロ二機能性架橋剤であり、アミン含有分子とスルフィドリル含有分子の共有結合的な接合を可能にします。この例では、NHSエステルが一次アミンと反応してアミド結合を形成し、一方でマレイミドがスルフィドリル基と反応して安定したチオエステル結合を形成します。ここで示されているように、架橋反応によってVLP-ペプチド複合体が生成され、ウェスタンブロットにおいて特異的抗体と免疫反応を示します。本開発は、ウイルス学分野の研究者に対し、ウイルス粒子を足場として利用し、多種多様なリガンドを規則的な幾何学的配列で結合させ、数多くのアプリケーションに応用する方法を提示するものです。

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学ぶウイルス様粒子のシステイン残基の溶媒アクセシビリティ分析とペプチド架橋法。トウモロコシrayadoフィノウイルスをNicotiana benthamianaで発現し、ナノテクノロジー応用のための機能化VLPスカフォールドを作成する。

上のシステイン残基の溶媒アクセシビリティの分析

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