Name: 3D原子力組織の変化を研究するために3D保存状態間期核に組み合わさ免疫やDNA FISH (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 55 s
Description: 学ぶ 3D共焦点顕微鏡を用いてクロマチン修飾とDNA配列を同時検出する手法。免疫蛍光とDNA FISHを組み合わせ、3D保存状態の核内でヒストン修飾とゲノム領域の関連を可視化する。

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我々は、議論とコメントのためのスザンナ·ヒューイット、特に、Skokラボのメンバーに感謝したいと思います。この作品は、健康補助金総合研究所R01GM086852、RC1CA145746（JAS）によってサポートされています。 JASは白血病リンパ腫協会の学者です。 JCは、がん研究所のア​​ーヴィング研究所フェロー。 MMは、国立科学財団助成統合大学院教育研究見習（NSF IGERT 0333389）によってサポートされています。

1。フルオロフォアとのDNAプローブのラベリング：ニック翻訳（〜6時間） <ol><li>クリーンBAC DNA（マキシプレップにより調製）またはプラスミドやPCR産物は、H 2 Oに再懸濁した全てが、標識に使用することができます注堅牢FISHの信号については、プローブは少なくとも10キロバイトに及ぶべきであること。 </li><li> 37℃（全ての試薬 ​​を表1に記載されています）で30分間のRNaseのDNAインキュベートする。 </li><li> 16℃（ 表2、表3を参照）で2時間、ニックトランスレーション反応をインキュベートする。直接標識の代替方法は、（：魚タグ、インビトロジェン例）を使用することができる。 </li><li> -80℃で1時間反応を不活性化する-20℃℃または一晩</li><li> 2％アガロースゲル上でプローブサイズを決定します。塗抹標本は、約300から500塩基対（Cy5でプローブのスミアが表示されていないことに注意してください ）での過半数で、100〜1,000 bpの間でなければなりません。 DNAが十分に消化されていない場合は、それ以上のDNA Pol IはとDNase Iを反応に添加し、16℃でさらに2時間インキュベートすることができます</li><li>暗闇の中で2時間、H 2 0で埋め2リットルビーカーで0.025ミリメートルフィルター上のプローブを精製する。 </li><li>次のようにプローブにブロッキング要因を追加します：COT-1 DNA、Hybloc10μgのDNAとDNAプローブ10μgのためのサケ精子の100μg10μgの。 -20℃で保存されたDNAプローブ</li></ol> 2。プローブ降水量/変性/プレアニーリング（3-4時間） <ol><li> 0.3μgおよびDNAプローブ1μgの間には、カバースリップあたりに使用されます。ミックス-80℃で1時間インキュベート3M NAACの0.1倍量（pH5.2）との100％エタノールを2.5倍量のプローブ、℃または-20℃で一晩、4℃、13,000 rpmでスピンダウン℃で30分間。 DNAプローブの量はDNAとハイブリダイゼーションの核領域の品質に応じて調整することができることに注意してください。直接標識の代替方法は、減少した量の使用を許すかもしれませんプローブ。 1スライド上の複数のDNA FISHシグナルの検出のために、異なるプローブ（反復配列のようなプレアニーリングしてはならないプローブを除く）一緒に沈殿させることができる。同時に行われ、いくつかの実験のためのプローブも一緒に析出させることができる。ペレットを軽く（プローブの少量が沈殿している場合は、ペレットが見えないかもしれません）を使用する蛍光団によると着色することがあります。 </li><li>乾燥ペレットと37から45℃（約20分間）で暗所（エッペンドルフサーモミキサーを使用して）を振とうしながらカバースリップあたり（ 表4を参照）15μlのハイブリダイゼーション緩衝液で再懸濁します。 </li><li> 75から95で5分間変性プローブ​​℃、 </li><li> 30〜60分間、37℃でプローブをプレアニール。プレアニールの長さは、プローブの複雑さと品質に応じて調整することができる。 </li><li>一晩ハイブリダイゼーション用のカバーガラス（セクション3を参照）にプローブを適用します。 </li></ol> 3。 3次元DNA魚 - 一日目（〜3時間） <ol><li>非接着細胞を1×PBS（カバースリップあたり5〜10μlの1×PBS中〜2×10 5細胞）を少量に濃縮し、ポリ-L-リジンコートカバースリップの中央にドロップされます。接着細胞は、少なくとも24時間（〜70％コンフルエント）（カバーガラスを0.1％ゼラチンでコーティングしてもよい）のカバースリップ上で培養されるべきである。スクエア18×18に24〜24ミリメートルのカバーを6ウェルプレートに配置され、プロトコル全体、各溶液2ミリリットルを（あるいはラウンド1.5mmのカバーガラスが12/24-wellプレートに配置することができます）ウェルあたりに使用されます。 </li><li> RT（4％PFAの株式は-20℃で保存し、等分することができます）で10分間、2％パラホルムアルデヒド/ 1×PBS、pHが7から7.4で細胞を固定してください。パラホルムアルデヒド（16％）溶液で購入することができ、または4％の原液を粉末/プリルから調製することができる。パラホルムアルデヒド粉末を調整し、氷の上で&gt; 60℃（pHは溶解を容易にするために8-9に増加させることができる）、冷却されたダウンで1X PBSに溶解さED pHが7から7.4にし、濾過し、ハヤブサに分注し、-20℃で週間保存</li><li> 1X PBSで3回洗浄した後、氷上で5分間冷やした冷0.4パーセントトリトン-X-100 / 1X PBSで細胞を透過。透過処理の長さは、細胞型に応じて調整することができるNBは ：DNAのFISHは免疫と組み合わされている場合は、免疫染色は（ セクション4を見てください）、この段階で行うべきである。 </li><li> 37℃で1時間、1×PBS、1×PBS中の0.1μg/μLのRNase Aを持つインキュベート細胞内で3回洗浄した後℃にカバースリップをパラフィルムで解決策または湿潤チャンバー内のスライドの100μlの上にドロップセル側を下に配置されます。カバースリップを慎重にピンセットで除去されます。任意の抵抗が発生した場合は、カバーガラスは、細胞の損傷を避けるために、1×PBSでフラッディングされなければなりません。 </li><li> 1X PBSで3回洗浄した後、氷上で10分間冷やした冷0.7パーセントトリトン-X-100 / 0.1M HCl中で細胞を透過。 </li><li> 3回洗浄した後、私nを1×PBS、室温で30分間1.9 M塩酸で変性細胞。交互に、細胞を少なくとも30分間75から80℃で50％ホルムアミド/ 2×SSC中で変性させることができます。ハイブリダイゼーション長（および温度）細胞型に応じて最適化することができることに注意してください 。 </li><li>氷冷1X PBSで3回洗浄した後、℃の暗多湿室で37℃で一晩プローブを用いて細胞をハイブリダイズする。カバーガラスをスライド上のプローブの15μlの上にドロップセル側を下に置かれ、ラバーセメントで封止されている。 </li></ol> 4。 3次元免疫魚 - 初日（6月7日〜HR） <ol><li>組み合わせた免疫蛍光DNA /魚のため、免疫染色は、0.4％トリトンX-100（ ステップ3.3）で透過処理した後に実行されるべきである。 </li><li>室温で30分（2.5％ウシ血清アルブミン（BSA）、10％正常ヤギ血清、0.1％のTween-20）のためにブロッキング溶液中で細胞をインキュベートします。ブロッキング溶液を濾過し、1.5mlのEppendorfsに等分し、mに格納されている-20℃でonths </li><li>湿潤チャンバー内の室温で1時間、タンパク質またはブロッキング溶液で希釈した関心のヒストン修飾に対して惹起された一次抗体を用いて細胞を培養する。ここでは、H2AXのリン酸化セリン-139（;詳細については、 表5を参照して 、γ-H2AX、ミリポア）に対する抗体の一例を示す。カバースリップをパラフィルムで解決策または湿潤チャンバー内のスライドの100μlの上にドロップセル側を下に配置されます。カバースリップを慎重にピンセット（必要に応じて1×PBSで水浸し）で削除されます。希釈およびインキュベーション長は抗体および細胞型の品質に応じて調整することができることに注意してください。 </li><li>振とうしながら、0.2％のBSA / 0.1％のTween-20/1×PBS、室温で3時間5分で細胞を洗浄します。 </li><li>暗くて湿ったチャンバー内で室温で1時間ブロッキング溶液で希釈した適切な蛍光色素標識二次抗体を用いて細胞をインキュベートします。ここでは、との検出の例を示す二次ヤギ抗マウス抗体（のAlexa Fluor 488または555、インビトロジェン、詳細については表5を参照）。ハプテン標識二次抗体（ビオチン、ジゴキシゲニン、等）を使用することもできる。この場合、適切な検出（ストレプトアビジン、抗DIG、etc）のための余分なステップは一晩、DNA-FISHハイブリダイゼーションの前または後に実行することができます。 </li><li>暗闇の中で振とうしながら、0.1％のTween-20/1×PBS、室温で3時間5分で細胞を洗浄します。 </li><li>暗闇の中で室温で10分間、2％パラホルムアルデヒド/ 1X PBSでポストフィックス細胞。 </li><li>前述のRNase A（ ステップ3.4）中でのインキュベーションからのDNA FISHを続ける。 </li></ol> 5。 3次元DNA FISH /免疫魚 - 2日目（〜2時間） <ol><li>慎重にラバーセメント、2X SSCと洪水のカバーを取り外し、慎重にピンセットで除去し、洗浄液を含むウェルの中に置いてください。 </li><li> 37℃で30分間振とうしながら、暗闇の中でCの2×SSC中で細胞を洗浄します。</li><li>振盪しながら、暗闇の中で、室温で30分間2×SSC中で細胞を洗浄します。 </li><li>振盪しながら、暗闇の中で、室温で30分間1×SSC中で細胞を洗浄ホルムアミドと変性の場合には、洗浄は、次のように置き換えなければならないことに注意してください：50％ホルムアミド/ 2×SSCおよび2x SSC、5で3回洗浄で3回洗浄37℃で、それぞれをmin℃に </li><li>全DNAの対比は1.5μg/ mlのDAPI（4,6 - ジアミジノ-2 - フェニル）を含むゴールドマウンティングメディウムを延長で細胞をマウントします。カバーガラスをスライド上に媒体をマウントの10〜15μlのドロップにセル側を下に配置し、マニキュアで封止されている。スライドは、-20℃で数ヶ月の​​ために保持されてい</li></ol> 6。 3D顕微鏡と分析<ol><li> 3D画像は、異なる顕微鏡システムで取得することができます。我々の実験では、0.3μm以下で区切ら光学切片はライカSP5 AOBS共焦点システム（音響光学ビームスプリッタ）で収集されます。 視神経の間の分離に注意してくださいリットルプレーンは分析の種類に応じて調整することができる。 </li><li> 3D画像スタックは、さまざまなソフトウェアやツールを用いて分析することができる。我々は、関心のある遺伝子座の間の距離の測定値を評価するために、サブ核コンパートメントまたはタンパク質と興味のある遺伝子座の協会の様々なタイプを分析するイメージJソフトを使用しています。 </li><li>異なる種類の細胞やステージ間の比較は、目的の異なる遺伝子座の間の比較：すべての統計分析は意義のペアごとの評価（複数可）と2（またはそれ以上）の異なる生物学的条件を比較するために行われている。 1.00E-3≤P≤1.00E-2 *;すべての統計的検定では、P値≤5.00E-2（= 0.05）（1.00E-2≤*著しいP≤5.00E-2重要であると解釈される*非常に重要な、P &lt;1.00E-3 ***非常に重要）。 </li></ol> 二つの対立遺伝子間の距離の全体の分布の統計解析。我々は最初のc我々はノンパラメトリック二標本コルモゴロフ·スミルノフ（KS）のテスト13,14を使用する実証的対立遺伝子間の距離の分布の差の有意性を評価する2 alleles.To間で測定された距離の範囲全体にわたって累積分布の周波数曲線をonstruct。 カットオフの最適な距離を使用して、2つの対立遺伝子の密接な関連の統計解析（すなわちペアリング）。二つの対立遺伝子または遺伝子座の間の距離で最も堅牢な差の範囲を指定するには、我々は2つのテールフィッシャー正確確率検定15秒のシリーズをご使用ください。すなわち、それぞれの測定距離で、我々は一つの条件が大幅に2つのサンプル間の短い距離で過剰表現されているかどうかをテストします。 P値の分布の最小値は、二つの対立遺伝子の密接な関連のカットオフ（ すなわちペアリング）として考慮されるべきである距離の範囲を示しています。続いて2テールフィッシャー正確確率検定は、tを使用されている同定されたカットオフ値15で2つの対立遺伝子のペアリングの意義を評価O。多重検定補正は16を実行フィッシャーテストの総数を考慮するために適用されます。 サブ核コンパートメントまたはタンパク質と目的の遺伝子座の協会の統計分析は、2つのテールフィッシャー正確確率検定は、異なる区画またはタンパク質15を用いて目的の遺伝子座の協会の意義を分析するために使用されます。

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</ol>

著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

上記の詳細テクニックは、リンパ球の30,31を開発中の免疫グロブリンおよびTCRA / D座のV（D）J組み換えの規制を分析するために私たちの研究室で使用されていた。我々は、この技術は、異なる細胞型では、様々な核タンパク質、核コンパートメントと遺伝子座の検出に適応させることができると確信しています。プロトコルの修正が必要になることがあり、この場合に集中する主な手順は次のとおりです。まず、透過処理の長さは、細胞型に応じて調整することができる。一次抗体のインキュベーションの第2の長さはまた、抗体の質と目的のタンパク質（例えば、いくつかのケースでは、インキュベーションを4℃で一晩行うことができる）の豊富さに応じて調整することができる。重要なのは、変性ステップを適応させることができ、HCl処理は、DNA FISH 20のホルムアミド3,4,34とNaOHで変性することによって置き換えられる可能性があります。また繰り返す液体窒素のED凍結融解サイクルは、DNA FISH単独で4,34のために固定化/透過処理後に細胞に適用する...

エピジェネティックなメカニズムトリガ成立と発達と細胞型特異的転写プロファイルの継承。 1レベルでこれは、アクティブまたはサイレントゲノム領域を定義クロマチン包装の変調を伴う。大規模に、ゲノムと核構造のグローバル3D組織はまた、転写パターンの制御に役割を果たしています。したがって、これらのepigenomic機能の解剖は、遺伝子が6-11を規制されている方法を完全に理解するために不可欠です。 組み合わせた免疫蛍光法および3DのDNA FISHは、特異的な相互作用/核内のDNA配列および/またはタンパク質の関連を評価することによって、分子および生化学的解析を補完するユニークな機会を提供します。さらに、このようなクロマチン免疫沈降（ChIP-seq）が染色体またはキャプチャのコンフォメーションなどのゲノムワイドなハイスループット技術は深いシーケンシングと相まってしばらく（4C-SEQ、5Cは、Hi-C）にグローバルdatを提供細胞集団は12日 、免疫蛍光/ DNA FISHの技術は、単一細胞レベルでの解析を可能にします。 ここでは、3D顕微鏡や分析（3D免疫FISH）が続いたDNA FISHによって免疫蛍光法およびDNA配列によってヒストン修飾の同時検出のためのプロトコルを記述します。このプロトコルの利点は、DNAやタンパク質の構造の保全を組み合わせた視覚化したものです。この分野での我々の経験では、既存のプロトコルを改善し、簡素化することができるようになりました。我々は組換えを受けてリンパ球におけるDNA二本鎖切断を検出するには、このプロトコルを使用していたが、この方法は、他のタンパク質と他の細胞型に適用することができます。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td>フィッシャー</td><td> ＃BP2470 </td><td></td></tr><tr><td>アーゼ</td><td>シグマ</td><td> ＃R4642 </td><td></td></tr><tr><td>のdNTP </td><td>シグマ</td><td> ＃DNTP100 </td><td></td></tr><tr><td>アレクサdUTPを</td><td>インビトロジェン</td><td> C-11401に＃C11397 </td><td></td></tr><tr><td> Cy3またはCy5 dUTPを</td><td>フィッシャー</td><td> ＃45-001-XXX </td><td></td></tr><tr><td> DNase Iを</td><td>ロッシュ</td><td> ＃04536282001 </td><td></td></tr><tr><td> DNA Pol Iは</td><td>バイオラボズ</td><td> ＃M0209 </td><td></td></tr><tr><td> 0.025μmフィルター</td><td> Millipor電子</td><td> ＃VSWP02500 </td><td></td></tr><tr><td> COT-1 DNAを1 mg / mlの</td><td>インビトロジェン</td><td> ＃18440 </td><td></td></tr><tr><td> Hybloc DNAを1 mg / mlの</td><td>応用遺伝学</td><td> ＃MHB </td><td></td></tr><tr><td>サケ精子</td><td>シグマ</td><td> ＃D1626 </td><td>粉末をH 2 O中に10 mg / mlで再懸濁される</td></tr><tr><td> NAAC（酢酸ナトリウム、pH 5.2緩衝液） </td><td>シグマ</td><td> ＃S7899 </td><td></td></tr><tr><td>フィコール400（モルBIOLグレード） </td><td>フィッシャー</td><td>第525位</td><td></td></tr><tr><td>ポリビニルピロリドン（MOL BIOLグレード） </td><td>フィッシャー</td><td> ＃BP431 </td><td></td></tr><tr><td>デキストラン硫酸パウダー</td><td>シグマ</td><td> ＃D8906 </td><td></td></tr><tr><td> SSPE（生理食塩水リン酸ナトリウム、EDTA）を20倍ソリューション</td&gt; <td>フィッシャー</td><td> ＃BP1328 </td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>フィッシャー</td><td> ＃BP227 </td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>フィッシャー</td><td> ＃12-548-B </td><td></td></tr><tr><td>スライド</td><td>フィッシャー</td><td> ＃12から550 </td><td></td></tr><tr><td> 6ウェルプレート</td><td>フィッシャー</td><td> ＃0720080 </td><td></td></tr><tr><td> 10×PBS、 </td><td>フィッシャー</td><td> ＃MT-46-013-CM </td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン溶液</td><td>シグマ</td><td> ＃P8920 </td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド、プリル、95％ </td><td>シグマ</td><td> ＃441244 </td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100、MOL BIOLグレード</td><td>シグマ</td><td> ＃T8787 </td><td></td></tr><tr><td> BSA（ウシ血清アルブミン）フラクションV </td><td>フィッシャー</td><td> ＃BP 1600 </td><td></td></tr><tr><td>正常ヤギ血清</td><td>ベクトルラボ</td><td> ＃S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20を、モルBIOLグレード</td><td>シグマ</td><td> ＃P9416 </td><td></td></tr><tr><td> SSC（食塩クエン酸ナトリウム）20倍ソリューション</td><td>フィッシャー</td><td> ＃BP1325 </td><td></td></tr><tr><td> Gold退色防止試薬を延長</td><td>インビトロジェン</td><td> ＃P36930 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI（4 &#39;、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール） </td><td>シグマ</td><td> ＃D9542 </td><td></td></tr><tr><td>最高のテスト1コートラバーセメント</td><td>アートやオフィス用品店</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表1に特異的な試薬及び小型機器。 </td></tr></tbody></table>

3d原子力組織の変化を研究するために3d保存状態間期核に組み合わさ免疫やdna fish

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

3D共焦点顕微鏡（3DのDNA FISH）を、続いて3次元的に保存核にDNAプローブを用いた蛍光 in situハイブリダイゼーションは、個々の細胞における遺伝子座の位置、サブ領域の染色体または全体の領土を視覚化するための最も直接的な方法を表しています。このタイプの分析は、核のグローバルアーキテクチャだけでなく、核空間内の特定のゲノム遺伝子座や地域の行動への洞察を提供します。免疫蛍光法は、他の一方で、核タンパク質の検出（修正ヒストン、ヒストンバリアントと修飾、転写機構や要因、原子力サブコンパートメントなど）を許可します。免疫蛍光法および3DのDNA FISHを組み合わせるにおける主要な課題は核の3Dアーキテクチャと同様に抗体によって検出されるエピトープを保持する一方であり、他方では、DNAプローブの浸透が検出できるように遺伝子座や染色体テリトリーの1月5日。ここでは、3D保存核内ゲノム遺伝子座とクロマチン修飾の可視化を組み合わせたプロトコルを提供します。

DNAと免疫FISHはBおよびTリンパ球の開発時に抗原受容体遺伝子座のV（D）J組み換えのプロセスに関連付けられている核の組織の変化を研究するためにSkokラボで使用されています。私に私たちを有効にする）遺伝子座の両端（収縮）の間の測定距離は上記の詳細技術ⅱ）対立遺伝子または遺伝子座の間の測定距離（ペアリング）、iii）は座、静脈内で発生するDNA損傷を解析するには）対立遺伝子の位置を評価すると（我々の研究では抑圧的なセントロメアヘテロクロマチン）サブコンパートメント核、およびvの相対座は）対立遺伝子と遺伝子座（我々の研究では、γ-H2AXのリン酸化ヒストンの協会）に核タンパク質の関連を評価する。特に、我々はB細胞の17から30を開発中の免疫グロブリン遺伝子座の V（D）J組換えの制御における軌跡ダイナミクスの役割を分析し、CD4 +およびCD8 + Tの間に系譜コミットメントの調節にセル14。我々はまた、コンビナーゼタンパク質RAG2 31の変異型を運ぶT細胞の開発には、T細胞受容体遺伝子...

ここでは、3D顕微鏡や分析（3D免疫DNA FISH）が続いたDNA FISHによる蛍光抗体法およびDNA配列によるヒストン修飾の同時検出のためのプロトコルを記述します。

3D原子力組織の変化を研究するために3D保存状態間期核に組み合わさ免疫やDNA FISH

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

この手順の全体的な目標は、3D共焦点顕微鏡を使用してクロマチン修飾とDNA配列を同時に検出し、最初に特定のDNAプローブを生成することです。一方、実験細胞はパーメを固定し、免疫染色します。関心のあるヒストンマーカー用。その後、細胞は変性し、体内で一晩中蛍光を発します。ハイブリダイゼーションまたは魚類は、1つ以上のDNAプローブを用いて行われる。最後に、細胞を洗浄し、3D蛍光のためにマウントします。得られた画像の顕微鏡分析により、関心のある遺伝子座の核局在と、特定の彼の石の修飾との関連が明らかになりました。この技術の主な利点は、3D保存核内のゲノム遺伝子座を持つ結石を含む核タンパク質の可視化を組み合わせ、クロマチンエピジェネティックな核組織化または遺伝子調節の分野における重要な質問に答えることができることです。この手順では、バックプラスミドまたはPCR産物のいずれかを標識に使用できます。これらは、付属のテキストで説明されているように準備する必要があります。堅牢な魚のシグナルを得るには、プローブが少なくとも 10 キロベースペアを費やす必要があることに注意してください。この手順は、1マイクログラムのDNAと0.17マイクログラムのRNA Aをマイクロ遠心チューブで組み合わせることから始めます。摂氏37度で30分間インキュベートします。インキュベーション後、氷上でRNA Aを短時間不活性化し、適切な量のNick翻訳を加えます。16°Cで2時間、冷蔵水浴またはクールブロックでインキュベートし、反応を不活性化します。チューブをマイナス80°Cで1時間、またはマイナス20°Cで一晩置きます。次に、2%agrosゲル上のプローブサイズを決定します。塗抹標本は101、000塩基対の間で、大多数は約300〜500塩基対である必要があります。SFプローブの汚れは見えないことに注意してください。サイズが決まったら、0.02の透析でプローブを精製します。水で満たされた2リットルのビーカーに5ミリメートルのフィルター。200 μgのプローブを各フローティングフィルターの中央に静かにピペットで移し、暗所で2時間インキュベートします。インキュベーション後、ピペットを使用して、プローブをフィルターから新鮮なマイクロ遠心チューブに穏やかに移します。次に、次のようにプローブにブロッキングファクターを追加します。1マイクログラムのCO 1D NA。1マイクログラムのハイブロックDNAと10マイクログラムのサケ精子を1マイクログラムのDNAプローブと混合物に対して、DNAプローブをマイナス20°Cで保存します。魚の手順の日に、プローブは沈殿し、使用のために準備されます。ビデオのこのセクションで説明する手順は、次のセクションの手順と並行して実行する必要があります。プローブを沈殿させるには、プローブを追跡し、pH 5.2で0.1容量の3モル酢酸ナトリウムと組み合わせ、2.5容量の100%エタノールをマイナス80°Cで1時間インキュベートします。インキュベーション後、プローブを摂氏4度でGの16, 000倍で30分間回転させます。スピン後、上清を捨て、ペレットを暗所で風乾します。プローブの量と色によって、ペレットが見える場合と見えない場合があります。Resusは、試験条件ごとに15マイクロリットルのハイブリダイゼーションバッファーにペレットを懸濁し、37〜45°Cの暗闇でeinorサーモミキサーを使用して約20分間振とうします。次に、プローブを変性させるために、摂氏75度から95度で5分間インキュベートします。次に、プローブをプレインするために、サーモミキサーで摂氏37度で30〜60分間インキュベートします。インキュベーションの直後に、ビデオの次のセクションで説明するように、プローブをカバースリップ上の細胞に適用します。次のステップでは、使用する抗体と細胞のインキュベーション時間を必要に応じて変更する必要があることに注意してください。ビデオのこのセクションで説明する手順は、付属のテキストで説明した前のセクションの手順と並行して実行する必要があります。非接着性細胞をポリリジンコーティングしたカバースリップの上に6つのウェルプレートのウェルに滴下し、5分間接着させます。次に、2ミリリットルの2%パラホルムアルデヒドをPBSに静かに加え、インキュベーション後、室温で10分間インキュベートします。各ウェルをPB S3ですすぎ、次いで細胞を透過性にし、PBS中に0.4%Triton X 100の氷冷2ミリリットルを加え、氷上で5分間インキュベートする。透過性溶液を吸引した後、DNAフィッシュを免疫蛍光法と組み合わせた場合は、次のように進めます。まず、100マイクロリットルのブロッキング溶液を加湿チャンバー内のパラムにピペットで移します。カバースリップセルを下にしてブロッキング溶液に置き、室温で30分間インキュベートします。次に、転送します。カバーは、ブロッキング溶液で希釈した一次抗体の100マイクロリットル滴に滑り込みます。ここで用いる抗体は、H2 A xまたはγ H two A xのリン酸化シリア1 39を認識し、室温で1時間加湿チャンバー内でスライドをインキュベートする。インキュベーション後、鉗子を使用してカバースリップを慎重に取り外します。カバースリップを拾いにくい場合は、PBSを氾濫させて再度お試しください。各スライドを6のウェルに移します。PBS中に0.2%BSA 0.1%tween 20を2ミリリットル含有するウェルプレートは、カバースリップを本溶液中で室温で5分間3回、振盪しながら洗浄し、次いでブロッキング溶液で希釈した適切なフルオロフォア標識二次抗体と細胞を室温で1時間、暗くて湿度の高いチャンバーでparam上でインキュベートします。インキュベーション後、前と同様に、細胞を0.1%tween 20 in PB S3で室温で5分間、暗所で洗い流し、細胞をポストフィックスし、2mLの2%パラホルムアルデヒドにPBSに浸して室温で10分間暗所で沈めます。細胞が染色されたら、または染色されていない場合は、PBSでカバースリップを3回すすいでDNAフィッシュを続けます。次に、カバーをセル側を下にして、100マイクロリットルの0.1ミリグラム/ミリリットルの滴下に置きます。加湿チャンバー内でparam上のRNAをインキュベートし、摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、カバーをPBSで3回すすぎ、その後、氷冷した0.7%Trix 100、0.1モル塩酸溶液中で細胞を暗所の氷上で10分間透過させます。PBSで3回すすぎた後、1.9モル塩酸で細胞を室温で30分間、暗闇で変性させ、次に氷冷PBSでさらに3回洗浄して、プローブと細胞をハイブリダイズします。このビデオの前のセクションで準備したプローブの15マイクロリットル滴にカバーをスライドセルを下にして顕微鏡スライドに置き、スライドをゴムセメントで密封し、暗い加湿チャンバーで摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、鉗子を使用して、スライドからゴムセメントを慎重に取り除きます。次に、2つのActs SSCでカバースリップをインフルエンザにかけ、鉗子を使用して細胞でカバースリップを慎重に取り除きます。次に、洗浄液が入ったウェルに入れます。次に、37°Cで30分間のXSSCを2個、室温で30分間のXSSCを2個、室温で30分間のXSSCを1個、暗所で振とうしながら以下の洗浄を行い、スライドをマウントするためにスライドをマウントし、カバースリップセル側を下にして、1.5ミリグラム/ミリグラム/ミリリットルDPIシールを含む10〜15マイクロリットルの金封入剤の長期滴下にマニキュアで置きます。スライドはマイナス20°Cで数ヶ月間保存できます。スライドの準備ができたら、0.3ミクロン間隔で光学切片を3D画像として収集し、添付の文書に記載されているように解析して、抗原受容体遺伝子座の2つの対立遺伝子の関連の変化がリンパ球発生中のVDJ組換えプロセスの調節と関連しているかどうかを判断し、野生型および変異体細胞のリコンビナーゼタンパク質ラグ1に欠損したリコンビナーゼタンパク質ラグ1を使用して、DNAを使用して目的の遺伝子座を調べましたゲノム領域を包含する約200キロベースペアに及ぶ背部から生成された魚のプローブ。対立遺伝子間の距離は、3D画像スタックの破線の円、輪郭の核形状の各バックシグナルの重心間で測定されました。示されているスケールバーは、野生型細胞および変異体細胞で測定された2つの対立遺伝子間の距離の全範囲を示すために、次いで生成された1ミクロンの累積周波数分布曲線である。次に、ノンパラメトリックな2サンプルKS検定を使用して、2つの分布間の差の有意性を評価しました。対立遺伝子間距離の最も堅牢な差の範囲は、青い点で示された一連の 2 テール フィッシャーの正確確率検定を使用して評価されました。高い点で示される最も堅牢なP値は、1ミクロン付近の距離で見つかりました。したがって、2つの対立遺伝子の密接な会合または対のカットオフは、1ミクロンに設定されました。ここに示す累積周波数曲線は、2つの異なる生物学的条件で2つの対立遺伝子が0から1.5ミクロンまで近接する距離の範囲を示しています。2つの対立遺伝子のペアの重要性は、1ミクロンでのカットオフについて、Two Tail Fisherの正確確率検定を使用して評価されました。このグラフは、突然変異状態では、2つの対立遺伝子が野生型のように高頻度に関連付けられていないことを示しています。したがって、欠落しているタンパク質のぼろきれは、inicペアリングに関与しています。このビデオを見れば、免疫蛍光法とDNAフィッシュの組み合わせ方法についてよく理解できるはずです。この技術は、核構造の地球規模の変化、核空間内の特定のゲノム遺伝子座と領域の振る舞い、およびこれらの領域内の特定の核タンパク質の関連についての洞察を提供することで、研究者に道を開きました。また、この手順に続くさまざまな疾患の根底にあるメカニズムを理解するのに役立ちます。クロマチン、免疫沈降、チップシーク、染色体捕捉確認などのゲノムワイドアイススループット技術などの他の方法や、フォアファイブCやICなどのディープシーケンシングを組み合わせることで、細胞集団に関するグローバルデータを提供することができます。

combined-immunofluorescence-dna-fish-on-3d-preserved-interphase

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このプロトコルは、非放射性の関係...

二重蛍光その場で</em新鮮な脳切片における>ハイブリダイゼーション

この記事では、シングルセルFISH、割球の核の拡散技法、およびin...

着床前遺伝子診断のためのFISH

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四次元（4D）画像化は、脊椎動物の神経末端を生体内エンドソームの2種類のうちの挙動および相互作用を研究するために利用される。これらの小さな構造の移動は、例えばエンドソーム融合およびエキソサイトーシスなどのイベントの確認を可能にする、三次元を特徴としている。...

4次元蛍光イメージングと住んでいる神経末端におけるエンドソームダイナミクスの可視化

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全体のマウント蛍光In Situハイブリダイゼーション、免疫組織の結合されたプロトコルを介してゼブラフィッシュにおける Multiciliated の細胞を可視化します。

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学ぶ 3D共焦点顕微鏡を用いてクロマチン修飾とDNA配列を同時検出する手法。免疫蛍光とDNA FISHを組み合わせ、3D保存状態の核内でヒストン修飾とゲノム領域の関連を可視化する。

3D原子力組織の変化を研究するために3D保存状態間期核に組み合わさ免疫やDNA FISH

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