3D原子力組織の変化を研究するために3D保存状態間期核に組み合わさ免疫やDNA FISH

この手順の全体的な目標は、3D共焦点顕微鏡を使用してクロマチン修飾とDNA配列を同時に検出し、最初に特定のDNAプローブを生成することです。一方、実験細胞はパーメを固定し、免疫染色します。関心のあるヒストンマーカー用。

その後、細胞は変性し、体内で一晩中蛍光を発します。ハイブリダイゼーションまたは魚類は、1つ以上のDNAプローブを用いて行われる。最後に、細胞を洗浄し、3D蛍光のためにマウントします。

得られた画像の顕微鏡分析により、関心のある遺伝子座の核局在と、特定の彼の石の修飾との関連が明らかになりました。この技術の主な利点は、3D保存核内のゲノム遺伝子座を持つ結石を含む核タンパク質の可視化を組み合わせ、クロマチンエピジェネティックな核組織化または遺伝子調節の分野における重要な質問に答えることができることです。この手順では、バックプラスミドまたはPCR産物のいずれかを標識に使用できます。

これらは、付属のテキストで説明されているように準備する必要があります。堅牢な魚のシグナルを得るには、プローブが少なくとも 10 キロベースペアを費やす必要があることに注意してください。この手順は、1マイクログラムのDNAと0.17マイクログラムのRNA Aをマイクロ遠心チューブで組み合わせることから始めます。

摂氏37度で30分間インキュベートします。インキュベーション後、氷上でRNA Aを短時間不活性化し、適切な量のNick翻訳を加えます。16°Cで2時間、冷蔵水浴またはクールブロックでインキュベートし、反応を不活性化します。

チューブをマイナス80°Cで1時間、またはマイナス20°Cで一晩置きます。次に、2%agrosゲル上のプローブサイズを決定します。塗抹標本は101、000塩基対の間で、大多数は約300〜500塩基対である必要があります。

SFプローブの汚れは見えないことに注意してください。サイズが決まったら、0.02の透析でプローブを精製します。水で満たされた2リットルのビーカーに5ミリメートルのフィルター。

200 μgのプローブを各フローティングフィルターの中央に静かにピペットで移し、暗所で2時間インキュベートします。インキュベーション後、ピペットを使用して、プローブをフィルターから新鮮なマイクロ遠心チューブに穏やかに移します。次に、次のようにプローブにブロッキングファクターを追加します。

1マイクログラムのCO 1D NA。1マイクログラムのハイブロックDNAと10マイクログラムのサケ精子を1マイクログラムのDNAプローブと混合物に対して、DNAプローブをマイナス20°Cで保存します。魚の手順の日に、プローブは沈殿し、使用のために準備されます。ビデオのこのセクションで説明する手順は、次のセクションの手順と並行して実行する必要があります。

プローブを沈殿させるには、プローブを追跡し、pH 5.2で0.1容量の3モル酢酸ナトリウムと組み合わせ、2.5容量の100%エタノールをマイナス80°Cで1時間インキュベートします。インキュベーション後、プローブを摂氏4度でGの16, 000倍で30分間回転させます。スピン後、上清を捨て、ペレットを暗所で風乾します。

プローブの量と色によって、ペレットが見える場合と見えない場合があります。Resusは、試験条件ごとに15マイクロリットルのハイブリダイゼーションバッファーにペレットを懸濁し、37〜45°Cの暗闇でeinorサーモミキサーを使用して約20分間振とうします。次に、プローブを変性させるために、摂氏75度から95度で5分間インキュベートします。

次に、プローブをプレインするために、サーモミキサーで摂氏37度で30〜60分間インキュベートします。インキュベーションの直後に、ビデオの次のセクションで説明するように、プローブをカバースリップ上の細胞に適用します。次のステップでは、使用する抗体と細胞のインキュベーション時間を必要に応じて変更する必要があることに注意してください。

ビデオのこのセクションで説明する手順は、付属のテキストで説明した前のセクションの手順と並行して実行する必要があります。非接着性細胞をポリリジンコーティングしたカバースリップの上に6つのウェルプレートのウェルに滴下し、5分間接着させます。次に、2ミリリットルの2%パラホルムアルデヒドをPBSに静かに加え、インキュベーション後、室温で10分間インキュベートします。

各ウェルをPB S3ですすぎ、次いで細胞を透過性にし、PBS中に0.4%Triton X 100の氷冷2ミリリットルを加え、氷上で5分間インキュベートする。透過性溶液を吸引した後、DNAフィッシュを免疫蛍光法と組み合わせた場合は、次のように進めます。まず、100マイクロリットルのブロッキング溶液を加湿チャンバー内のパラムにピペットで移します。

カバースリップセルを下にしてブロッキング溶液に置き、室温で30分間インキュベートします。次に、転送します。カバーは、ブロッキング溶液で希釈した一次抗体の100マイクロリットル滴に滑り込みます。

ここで用いる抗体は、H2 A xまたはγ H two A xのリン酸化シリア1 39を認識し、室温で1時間加湿チャンバー内でスライドをインキュベートする。インキュベーション後、鉗子を使用してカバースリップを慎重に取り外します。

カバースリップを拾いにくい場合は、PBSを氾濫させて再度お試しください。各スライドを6のウェルに移します。PBS中に0.2%BSA 0.1%tween 20を2ミリリットル含有するウェルプレートは、カバースリップを本溶液中で室温で5分間3回、振盪しながら洗浄し、次いでブロッキング溶液で希釈した適切なフルオロフォア標識二次抗体と細胞を室温で1時間、暗くて湿度の高いチャンバーでparam上でインキュベートします。

インキュベーション後、前と同様に、細胞を0.1%tween 20 in PB S3で室温で5分間、暗所で洗い流し、細胞をポストフィックスし、2mLの2%パラホルムアルデヒドにPBSに浸して室温で10分間暗所で沈めます。細胞が染色されたら、または染色されていない場合は、PBSでカバースリップを3回すすいでDNAフィッシュを続けます。次に、カバーをセル側を下にして、100マイクロリットルの0.1ミリグラム/ミリリットルの滴下に置きます。

加湿チャンバー内でparam上のRNAをインキュベートし、摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、カバーをPBSで3回すすぎ、その後、氷冷した0.7%Trix 100、0.1モル塩酸溶液中で細胞を暗所の氷上で10分間透過させます。PBSで3回すすぎた後、1.9モル塩酸で細胞を室温で30分間、暗闇で変性させ、次に氷冷PBSでさらに3回洗浄して、プローブと細胞をハイブリダイズします。

このビデオの前のセクションで準備したプローブの15マイクロリットル滴にカバーをスライドセルを下にして顕微鏡スライドに置き、スライドをゴムセメントで密封し、暗い加湿チャンバーで摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、鉗子を使用して、スライドからゴムセメントを慎重に取り除きます。次に、2つのActs SSCでカバースリップをインフルエンザにかけ、鉗子を使用して細胞でカバースリップを慎重に取り除きます。

次に、洗浄液が入ったウェルに入れます。次に、37°Cで30分間のXSSCを2個、室温で30分間のXSSCを2個、室温で30分間のXSSCを1個、暗所で振とうしながら以下の洗浄を行い、スライドをマウントするためにスライドをマウントし、カバースリップセル側を下にして、1.5ミリグラム/ミリグラム/ミリリットルDPIシールを含む10〜15マイクロリットルの金封入剤の長期滴下にマニキュアで置きます。スライドはマイナス20°Cで数ヶ月間保存できます。

スライドの準備ができたら、0.3ミクロン間隔で光学切片を3D画像として収集し、添付の文書に記載されているように解析して、抗原受容体遺伝子座の2つの対立遺伝子の関連の変化がリンパ球発生中のVDJ組換えプロセスの調節と関連しているかどうかを判断し、野生型および変異体細胞のリコンビナーゼタンパク質ラグ1に欠損したリコンビナーゼタンパク質ラグ1を使用して、DNAを使用して目的の遺伝子座を調べましたゲノム領域を包含する約200キロベースペアに及ぶ背部から生成された魚のプローブ。対立遺伝子間の距離は、3D画像スタックの破線の円、輪郭の核形状の各バックシグナルの重心間で測定されました。示されているスケールバーは、野生型細胞および変異体細胞で測定された2つの対立遺伝子間の距離の全範囲を示すために、次いで生成された1ミクロンの累積周波数分布曲線である。

次に、ノンパラメトリックな2サンプルKS検定を使用して、2つの分布間の差の有意性を評価しました。対立遺伝子間距離の最も堅牢な差の範囲は、青い点で示された一連の 2 テール フィッシャーの正確確率検定を使用して評価されました。高い点で示される最も堅牢なP値は、1ミクロン付近の距離で見つかりました。

したがって、2つの対立遺伝子の密接な会合または対のカットオフは、1ミクロンに設定されました。ここに示す累積周波数曲線は、2つの異なる生物学的条件で2つの対立遺伝子が0から1.5ミクロンまで近接する距離の範囲を示しています。2つの対立遺伝子のペアの重要性は、1ミクロンでのカットオフについて、Two Tail Fisherの正確確率検定を使用して評価されました。

このグラフは、突然変異状態では、2つの対立遺伝子が野生型のように高頻度に関連付けられていないことを示しています。したがって、欠落しているタンパク質のぼろきれは、inicペアリングに関与しています。このビデオを見れば、免疫蛍光法とDNAフィッシュの組み合わせ方法についてよく理解できるはずです。

この技術は、核構造の地球規模の変化、核空間内の特定のゲノム遺伝子座と領域の振る舞い、およびこれらの領域内の特定の核タンパク質の関連についての洞察を提供することで、研究者に道を開きました。また、この手順に続くさまざまな疾患の根底にあるメカニズムを理解するのに役立ちます。クロマチン、免疫沈降、チップシーク、染色体捕捉確認などのゲノムワイドアイススループット技術などの他の方法や、フォアファイブCやICなどのディープシーケンシングを組み合わせることで、細胞集団に関するグローバルデータを提供することができます。