乳癌のマウスモデルにおいて腫瘍微小環境における薬剤応答のイメージングを生きる

この手順の全体的な目標は、治療薬の投与に対する薬物の浸透と治療反応をリアルタイムで追跡することです。これは、最初に動物を薬物で治療することによって達成されます。次に、腫瘍を含む鼠径乳腺が皮膚フラップを作成することにより露出します。

次に、マウスを顕微鏡段階に移し、血中酸素飽和度と脈拍数を測定し、液体と薬物または色素の投与のための留置ラインを挿入します。最後に、タイムラプス画像を取得して、後で分析します。最終的には、マウス乳腺腫瘍の回転椎間板共焦点顕微鏡法を通じて、薬物に応答した細胞死または腫瘍間質の相互作用の変化を示す結果を得ることができます。

この方法は、腫瘍のさまざまな間質成分が治療への反応にどのように影響するかなど、腫瘍微小環境分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。開始する前に、薬物投与とイメージングの一般的なスケジュールについて書かれたプロトコルを参照してください。ホットビーズ滅菌器の電源を入れ、摂氏200度以上に到達させます。

歯付き鉗子、鋸歯状の鉗子、はさみ2組などの手術器具を石鹸と水で洗った後、ホットビーズ滅菌器を使用して少なくとも30秒間滅菌します。それから彼らに任せてください。涼しい。手術プラットフォームとして使用する発泡スチロールの蓋の上にラボソーカーを置きます。

実験用テープを使用して、麻酔システムに線付きのノーズコーンをラボソーカーに貼り付け、特定の18ゲージを1インチ半の針でテープを介してノーズコーンの両側の発泡スチロール蓋に貼り付けて、ノーズコーンを所定の位置に固定します。ベタジン滅菌ガーゼを取っておきます。2つの70%イソプロパノールは、顕微鏡スライド、瞬間接着剤、および4枚の半インチ幅のラボテープを拭きます。

動物を誘導室で麻酔した後、深く呼吸しているときに、腹側を上にしてマウスをゆっくりと手術台に移します。高圧を避けるために、麻酔ラインを手術台に開いてから、麻酔ラインを誘導室に閉じます。イソフルランの濃度を4%から2.5%に減らすフットパッドピンチを実行して、麻酔の深さが手術に十分であることを確認してください。

動物が反応しない場合は、4枚の実験用テープを使用して手足を手術台に固定し、電気カミソリを使用して腹面から毛を取り除きます。70%イソプロパノールワイプを使用し、続いて滅菌ガーゼにベタジンを塗布して、はさみと歯の鉗子を使用して動物の腹面を消毒します。尿道の約3ミリメートル上から剣状突起まで皮下腹側正中線切開を行います。

はさみや鋸歯状の鉗子で腹膜に穴を開けたり、切り裂いたりしないように注意してください。画像化する腫瘍を含む鼠径乳腺で腹腔から皮膚を穏やかに剥離したまま付着したまま。マウスをステージに置いたときに腫瘍の大部分が平らになるように、また後肢によって妨げられないように、ガラス顕微鏡スライドを皮膚フラップに当てます。

顕微鏡スライドが適切に配置されたら、瞬間接着剤を使用してスライドを皮膚の外面に取り付けます。動物の手足を固定している実験用テープをはがします。顕微鏡ステージへの麻酔ラインを開き、次に手術台への麻酔ラインを閉じます。

動物を顕微鏡ステージに素早く移す 動物を移し替えたら、麻酔ラインとノーズコーンを位置決めして固定し、マウスが麻酔をかけたままで快適な位置にあることを確認します。イソフルランの濃度を1.5%に下げる腫瘍を露出させて、腫瘍が顕微鏡ステージのガラスで覆われたイメージングポートの1つの上部と中央に配置されるようにします。滅菌PBS生理食塩水またはヨウ化プロピジウムを含む生理食塩水を含む1ミリリットルのシリンジに取り付けられた翼付き注入セットを備えた留置腹腔内ラインを挿入します。.

腹腔内ラインを挿入したら、動物に100マイクロリットルの生理食塩水とヨウ化プロピジウムを注入し、イメージングセッションが完了するまで1時間ごとに50マイクロリットルの生理食塩水をヨウ化プロピジウムに注入し続けます。接眼レンズを使用して、腫瘍が正しく配置され、顕微鏡スライドと腹腔内ラインに優しくテープで留められていることを確認します。スライドは、組織への血流が妨げられないように十分に緩く固定する必要があります。

顕微鏡のスライドをテープで留めると、動物の呼吸によってもたらされる画像アーティファクトを最小限に抑えてタイムラプス画像を取得できます。オープンソースソフトウェアのmicromanagerを使用して、IRISまたはその他の画像解析ソフトウェアを使用して生データをコンパイルおよび分析します。蛍光標識DExT鎖は、組織への薬物送達の代理マーカーとして使用できます。

ここに示されているのは、乳がん細胞の青色蛍光タンパク質を発現するマウスに注入されたfitzy標識2メガダルトンデキストランIVの到着です。薬物が腫瘍に到着した後、血管外漏出と拡散を画像化して、血管内半減期と薬物分布を決定できます。ここでは、乳がん細胞に青色蛍光タンパク質を発現し、骨髄系細胞に緑色蛍光タンパク質を発現するマウスにLOR標識10キロダルトンデキストランIVを注入した際の血管外漏出と分布を示しています。

イメージングは、がん細胞が受ける細胞死の種類に関する情報を提供できます。ここでは、壊死またはアポトーシスを示す構造核変化が、ヒソン2bに結合した緑色蛍光タンパク質を発現するマウスで観察されます。ドキソルビシン治療後、化学療法によって誘発されるがん細胞死は、免疫細胞の腫瘍への反応性動員を頻繁にもたらします。

これは、乳がんと骨髄細胞にそれぞれ青色と緑色の蛍光タンパク質を発現するマウスのドキソルビシンによる急性治療に対するこの間質反応の例です。ここでは、化学療法に対する全体的な間質反応を視覚化するだけでなく、特殊な間質反応も視覚化できます。この壊死性細胞材料による壊死性細胞材料の食作用は、習得すると示される。

この手法は30〜60分で完了し、適切に実行すれば動物を12〜40時間画像化できます。