Name: 蛍光パターンを調査するための凍結セクショニング酵母コミュニティ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 学ぶ 酵母コミュニティの凍結・凍結切片法による蛍光細胞の空間分布解析。メタノール固定とOCT包埋で蛍光タンパク質を保持し、蛍光顕微鏡でコミュニティ内部の細胞配置を可視化する手法です。

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我々は彼らのクライオスタットを使用するための許可フレッドハッチンソンがん研究センターのジョナサン·クーパーラボに感謝したいと思います。この作品は、NIHとWMケック財団によってサポートされていました。 BMは、ライフサイエンス研究財団のゴードンとベティ·ムーア仲間です。私達は私達と彼の固定プロトコルを共有するためのダニエルGottschlingに感謝しています。

1。酵母のコミュニティを修正<ol><li>メンブレンフィルター（; 図2A 例えば 、ミリポアMF膜フィルター）に酵母のコミュニティを育てています。このプロトコルは、6mm径のメンブレンフィルター上の未満2×10 8個の細胞の典型的な地域に対応しています。 </li><li>ウェル1センチ直径（ 図2B）の底をカバーする541ワットマン濾紙を使用しています。このワットマン紙は後の段階でコミュニティを転送するためのキャリアとして使用されます。ウェルに1ミリリットル100％メタノールを追加し、平衡化するために、温度を-20でよく℃を残す。 </li><li>デュワーに液体窒素を入れてください 。ピンセット（ 図2C）を使用して、液体N 2中で少なくとも15秒間コミュニティを浸漬することにより、液体窒素中でコミュニティをフリーズします。 </li><li> -20℃メタノール（ 図2D）のウェルに凍結コミュニティを転送します。メタノールでそれを浸すとき社会が水平に保たれていることを確認します。20分待ってください。 MF膜フィルターは、メタノール中で崩壊し始めます。 </li><li>よくメタノールの蒸発（ 図2E）は-20℃で保た冷たいペトリ皿にメタノールからコミュニティの担体を用いて541ワットマンろ紙を転送します。転送する場合は、キャリアWhatmanフィルターの上にコミュニティを維持し、寒いペトリ皿に入れる前に厚いワットマン紙の別の部分を用いてメタノールの余分な水滴を離れて描画します。これは蒸発時間は、サンプルとサンプルの間の一貫性があることを保証します。 </li><li>キャリアWhatmanフィルターが乾燥して見えるまで蒸発のために4から6時間待ちます。不十分な蒸発はセクショニングと干渉残留メタノールを残します。過乾燥は、地域社会に亀裂や変形が生じる。 </li><li> -20℃の冷凍庫からサンプルを取り出します。コミュニティで覆われていないワットマン541濾紙を切り取った。 </li><li>サンプルはから少なくとも約2 mmのマージンを持っているような十分な大きさの長方形の立方体のアルミ箔コンテナを作るそれぞれの側（ 図2F）。アルミ箔容器の底面にコミュニティを置き、すぐに3〜10月でサンプル〜コミュニティの高さ上記4ミリメートルをカバーしています。重要な場合は、試料の配向が容器の側面に関連して、このステップで調整することができます。 10分待ってください。 </li><li>凍結するドライアイス上に金属板の上に10月包埋サンプルを置きます。 -20℃または-80℃の冷凍庫で凍結コミュニティを保管してください。 </li></ol> 2。蛍光イメージング用冷凍コミュニティセク<ol><li> -25℃に凍結切片室の温度を設定し、その温度が室内の温度に達するまでチャンバー内のサンプルのままにしておきます。 </li><li>台紙に10月のドロップを適用した後にクライオマウントにサンプルをマウントします。 10月の厚さが2-3 mmであるように、露出したワットマン濾紙（容器の底部）で試料の側面に均一に10月を広げた。 10月はSE前クライオスタット室の内部に凍結しましょうctioning。サンプルのすべての側面に2〜3mmの10月のマージンを確保することは、セクションの整合性を維持するのに役立ちます。 </li><li> 10月のサンプルブロックの辺はサンプルを整列させるために使用することができます。サンプルがブレードに対して位置合わせされていない場合は、セクション化は、サンプルのコーナーやサイドからスタートします。ブレードはサンプルブロックの完全に垂直（もしくは水平）面をカットしていることを確認するためにマウントを調整します。 </li><li>酵母のコミュニティのための典型的なセクションでは、〜14μmの厚さである。セクションをカットした後、ゆっくりと切断部にスライドを接近して、セクションを収集するために室温に保っ顕微鏡スライドを使用しています。セクションでは、溶融し、顕微鏡スライドに移ります。最大18のセクションには、1つのスライドに転写することができる。 </li><li>好ましくは-20低温、℃、イメージングの前でスライドを格納します。 4℃で1週間保持する際、信号の損失が最小限に抑えられます最大蛍光シグナルは、イメージングは​​、好ましくは、セクショニングの直後に行われます。 </li></ol>

<ol><li>Tolker-Nielsen, T., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Organization+of+Microbial+Biofilm+Communities%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities.</a> Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).</li>
<li>Moller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+In+Situ+Gene+Expression+in+Mixed-Culture+Biofilms%3A+Evidence+of+Metabolic+Interactions+between+Community+Members%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)"> In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).</li>
<li>Lepp, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanogenic+Archaea+and+human+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Methanogenic Archaea and human periodontal disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).</li>
<li>Váchová, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+developing+multicellular+yeast+colony%3A+spatio-temporal+expression+of+Ato1p+ammonium+exporter%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter.</a> Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).</li>
<li>Mináriková, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+Gene+Expression+in+Cells+within+Yeast+Colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies.</a> Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).</li>
<li>Shou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+cooperation+in+engineered+yeast+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synthetic cooperation in engineered yeast populations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).</li>
<li>Momeni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+generates+a+unique+spatial+signature+in+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities.</a> , Submitted (2012).</li>
<li>Kiernan, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKiernan%2C+J+%22Histological+and+Histochemical+Methods%3A+Theory+and+Practice%22">Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice</a>. ed, , 4th, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 4(2008).</li>
<li>Piccirillo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rim101p%2FPacC+Pathway+and+Alkaline+pH+Regulate+Pattern+Formation+in+Yeast+Colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies.</a> Genetics. 184 (3), 707-716 (2010).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

ここで紹介する手順は、酵母のコミュニティの内部構造を検査する方法を提供します。メタノール固定工程は8リジッド酵母コロニーを作り、コロニーの整合性を維持しますが、それはまた、結果を解釈する際に考慮すべき8収縮を引き起こす。我々は通常、直接9を固定せずに 10月中に埋め込 ​​まれたコロニーに比べて酵母のコロニーの高さの約30％収縮を参照してください。 収縮を回避するために、凍結セクショニングのための代替的アプローチは、直接10月にコミュニティを埋め込み、それらを凍結することである。蛍光を直接埋め込むことに基づく方法で保存されますが、欠点は、各セクション内の細胞が結合していないことです。その結果、先にセクションのフロート、およびセクションの端で細胞の一部は、切削プロセスの障害（ 図4）を被る可能性が高くなります。彼に焦点を当てていないものの再度、酵母社会の断面の明視野像はまた私達のコミュニティ9内の細胞の状態に関する有用な...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> 100％メタノール</td><td> JTベーカー</td><td> 9070から01 </td><td></td></tr><tr><td>組織 - Tek社のOCTコンパウンド</td><td> Andwin科学</td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td>ワットマングレード541号定量濾紙</td><td>ワットマン</td><td> 1541-047 </td><td></td></tr><tr><td>ミリポア-MFメンブレンフィルター</td><td>ミリポア</td><td> HAWP04700 </td><td></td></tr><tr><td>低温保持装置</td><td>ライカ</td><td> CMは1510年のS </td><td></td></tr></tbody></table>

蛍光パターンを調査するための凍結セクショニング酵母コミュニティ

Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

微生物は、一般的に地域社会に住んでいます。コミュニティ内での細胞の空間的な組織は、コミュニティ1の生存と機能に影響を及ぼすと考えられている。焦点と二光子顕微鏡を含む光学セクショニング技術は、細菌や古細菌群集2,3の空間組織を観察するために有用であることが証明されています。酵母のコロニーの共焦点イメージングおよび物理的なセクショニングの組み合わせは、セル4の内部組織を明らかにした。しかし、共焦点や2光子顕微鏡を用いた直接的な光学セクショニングは、酵母のコロニーの奥深くまで少数の細胞層に到達することができるだけであった。この制限があるため4酵母細胞からの光の強い散乱の可能性があります。 ここでは、固定及びSaccharomyces cerevisiaeのコミュニティ内で蛍光細胞の空間分布を得るために、凍結セクショニングに基づく方法を提案する。我々は、定着剤としてメタノールを使用細胞の空間分布を保存する方法について説明します。固定されたコミュニティはクライオスタットにおけるOCT化合物、冷凍、および凍結切片を浸透されています。セクションの蛍光イメージングは​​、コミュニティ内の蛍光細胞の内部組織を明らかにする。 赤と緑の蛍光タンパク質を発現する株から成る酵母コミュニティの例としては、同様に酵母のコロニー2,3内の遺伝子発現の場合と蛍光細胞の空間分布を明らかにするために凍結セクショニング法の可能性を実証している。我々の焦点は、Saccharomyces cerevisiaeのコミュニティになっているにもかかわらず、同じ方法を用いて、潜在的に他の微生物群集を検討するために適用することができる。

赤と緑のタグを付けた競争力のある集団6を含む酵母群集の垂直断面の蛍光画像を図3に示します。これらのコミュニティは2原栄養酵母の菌株とスペースを含む共有リソースのための彼らの競争から成り、それらの垂直断面に表示されているように、円柱状のパターンに7をリードしています 。単一細胞の解像度ダウン、クロスセクションで解決することができます。 図3は図1のプロトコールに従ってして（下）と（上）、メタノール固定せずに得られた複写社会の断面を比較します。固定せずに酵母コミュニティを凍結セクショニングの場合、プロトコルは、ステップ1.8から始めて続いている。蛍光シグナルは固定せず、コミュニティセクションに保存されますが、コミュニティの完全性が損なわれます。結果として、（1）いくつかのセルは、セクションのエッジの周りに離れて浮かぶと、（2）全体的な義ELD（ すなわち 、セクションの数分のセクショニング手順のアーティファクトによって乱されていない）は、一定の社会に比べて低くなっています。 <p c...

我々は、蛍光細胞の内部のパターンを観察するために酵母コミュニティを凍結および凍結セクショニングするためのプロトコルを提示します。この方法は、メタノール固定に依存しており、コミュニティ内での蛍光タンパク質を不活性化することなく、細胞の空間的な分布を維持するために10月エンベディング。

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

次の実験の全体的な目標は、酵母群集の断面を作成し、群集内のさまざまな蛍光細胞集団の空間分布を調べることです。これは、最初にコミュニティを凍結し、次にメタノールを使用してコミュニティ内の細胞の空間分布を維持するために固定することによって達成されます。第2のステップとして、メタノールを蒸発させて、包埋OCT化合物の浸透を可能にする。その後、埋め込まれたコミュニティは凍結切片の準備として凍結されます。次に、クライオオメのセクションです。コミュニティと断面は蛍光顕微鏡で画像化できますコミュニティ内の蛍光細胞集団の空間分布を示す結果が得られます。光学セクショニングなどの既存の方法に対するこの手法の主な利点は、これらのコミュニティの奥深くにある集団の空間分布を明らかにすることです。この手順を開始するには、メンブレンフィルターで酵母群集を成長させます。このプロトコルは、マイナス20°Cの冷凍庫で次に直径6ミリメートルのメンブレンフィルター上の8つの細胞の2×10未満の典型的なコミュニティに対応します。蛍光をより多く保持するには、直径1センチメートルの底を覆うためにワットマン5 4 1濾紙を使用します。さて、この濾紙は、コミュニティを移動させるためのキャリアとして使用されます後の段階で、マイナス20°C、100%メタノールの1ミリリットルをウェルに追加し、温度が平衡化するためにウェルをマイナス20°Cに保ちます。次に、ピンセットを使用して、メンブレンフィルターをコミュニティと一緒に液体窒素に少なくとも15秒間浸すことにより、酵母コミュニティを凍結します。次に、凍結したコミュニティをマイナス20°Cの井戸に移します。冷凍庫内のメタノールは、コミュニティが水平に保たれるようにします。メタノールに浸すと、20分間待つと、メンブレンフィルターがメタノール中で崩壊し始めます。20分後、メタノールウェルのキャリアワトマン濾紙を使用して、摂氏マイナス20度に保たれた冷たいシャーレにコミュニティを移します。転送するときは、コミュニティをキャリアのワトマンフィルターの上に置きます。冷たいペトリ皿に入れる前に、別の厚いワットマンペーパーを使用して余分なメタノールを引き出します。これにより、メタノールの蒸発時間がサンプルごとに一貫していることが保証されます。メタノールが蒸発するまで4〜6時間待ちます。適切なタイミングで蒸発を終わらせることは、この手順を成功させるために重要です。サンプルの過剰乾燥を避けるために、メタノールが蒸発している間、蒸発中に酵母群集の状態を定期的に確認してください。サンプルが各辺から少なくとも約2ミリメートルのマージンを持つように十分に大きい長方形の立方体のアルミホイル容器を作成します。この容器の底にOCTを一滴垂らして、サンプルが四方からOCTで囲まれるようにします。蒸発が完了したら、マイナス20°Cの冷凍庫からサンプルを取り出します。濾紙の酵母菌群集で覆われていない部分を切り取ります。この手順は迅速に実行することが重要です。サンプルの乾燥しすぎを防ぐため。アルミホイル容器の底面にコミュニティを置き、すぐにサンプルをOCTでコミュニティの高さから3〜4ミリメートル上に覆います。10 分待ちます。最後に、OCTに埋め込まれたサンプルをドライアイス上の金属プレートに置き、凍結したコミュニティを摂氏マイナス20度または摂氏マイナス80度で凍結保存します。凍結したコミュニティの切片化に備えて、クライオ切片チャンバーの温度を摂氏マイナス25度に設定します。サンプルの温度がチャンバーの温度に達するまで、サンプルをチャンバー内に置いておきます。次に、サンプルからホイルを取り除き、余分なOCTを切り取ります。クライオマウントにOCTを一滴垂らし、サンプルをクライオマウントにマウントします。OCTの厚さが2〜3ミリメートルになるように、露出したワットマン濾紙でサンプルの側面にOCTを均一に広げます。サンプルのすべての側面で2〜3ミリメートルのOCTマージンを確保することで、切片の完全性を維持するのに役立ちます。切片化する前に、OCTをクライオスタットチャンバー内で凍結させます。OCTサンプルブロックの側面を使用して、ブレードに対してサンプルを位置合わせします。サンプルがブレードに対して位置合わせされていない場合、切片化はサンプルの角または側面から開始されます。マウントを調整して、ブレードがサンプルブロックの完全に垂直な面を切断するようにします。酵母群集の典型的な切片は、厚さが約14マイクロメートルです。切片を切断した後、室温に保たれた顕微鏡スライドを使用して切片を採取します。スライドをゆっくりと切断部に移動すると、切片が溶けて顕微鏡に移ります。1枚のスライドに最大18セクションまで転写できます。スライドは低温、できればマイナス20°Cで保存してからイメージングしてください。シグナルの損失は、4°Cで1週間保持すると、蛍光シグナルが最大になります。イメージングは切片化後すぐに行う必要があります。同じ条件下で増殖した酵母群集の垂直断面の代表的な蛍光画像をここに示します。このコミュニティは、蛍光タンパク質でタグ付けされた2つの光向性ビジエ株で構成されています。赤で視覚化されたMチェリーと緑の競争として視覚化されたY-E-G-F-Pは、スペースを含む共有リソースの競争として視覚化され、垂直断面に表示されるように柱状のパターンにつながります。1つのセルまでの分解能は、断面で解決できます。この図は、底面パネルにメタノール固定法を適用した場合と、上面パネルにメタノール固定しない場合で得られた断面を比較したものです。蛍光シグナルは固定されずにコミュニティセクションに保存されますが、コミュニティの完全性が損なわれます。その結果、一部の細胞はセクションの端の周りで浮遊し、固定コミュニティと比較して全体的な収量が低くなります。メタノール固定はコミュニティ細胞を一緒に保ちますが、コミュニティの高さの減少で観察されるように収縮を引き起こします。この図は、DS REDおよびYFP蛍光タンパク質でティードされた2つのProtopic株からなる酵母群集の代表的な明視野および蛍光垂直断面を示しています。コミュニティの上にある細胞は、母細胞とは異なるように見えるクラウンを形成し、明視野での散乱が強く、蛍光が明るいことを特徴としています。これらのパターンは、酵母コロニーで報告されている分化パターンと一致しています。このビデオを見た後、酵母群集内の蛍光su空間パターンを調べるために凍結切片を使用する方法をよく理解しているはずです。

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