脳から隔離された白血球の単離と解析マラリアベルゲイ ANKA感染マウス

この手順の全体的な目標は、マラリア原虫の眼に感染したマウスの脳血管から付着性炎症性白血球を分離して、実験的脳マラリアを誘発することです。マウスに注射によりマラリア原虫に感染させ、眼に寄生した赤血球を投与します。マウスが病気の兆候を示し始めた後、マラリアに感染したマウスの循環細胞は経口灌流によって除去されます。

その後、脳を採取し、炎症性白血球を分離するために酵素で組織を消化します。次に、マルチカラーフローサイトメトリーを免疫表現型に対して実施します。脳隔離された白血球 得られたデータの解析により、マラリアに感染したマウスの脳に移動する白血球の割合と絶対数が明らかになりました。

この方法は、感染した動物の脳内の寄生虫隔離部位にどのような種類の炎症細胞がさまざまな実験条件下で移動するのかなど、マラリアの病因分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この方法の視覚的なデモンストレーションは重要です。灌流の手順は、大きな血管を傷つけないようにスピードと注意の両方が必要なため、習得するのが困難です この手順の一部を示すのは、動物技術者のLeanna Mcic氏、博士課程の学生であるVictoria氏、博士課程のRick氏、および私の研究室のポスドクであるLisa Aez博士です。

このプロトコルは、マウスをp berge eye ancaに感染させ、P berge eye ancaの凍結保存されたアリコートを解凍し、赤血球またはpbcsを室温に戻すことから始めます。生後8〜12週齢のドナーマウスをケージから取り出し、ワークステーションに置きます。人差し指と親指で首筋をつかみます。

マウスを裏返し、100〜200マイクロリットルのマラリア原虫ベルゲアイを腹腔に注入します。定期的に2匹のドナーマウスにPBCsを注射します。注射後、感染後4〜5日でマウスをケージに入れます。

ドナーマウスをケージから取り出し、ワークステーションに置きます。マウスの尾静脈から一滴の血液を、つや消しにした端の顕微鏡スライドの端近くに置きます。2 番目のスライドを 45 度の角度で置き、血滴に戻します。

血液が端に沿って広がったら、スプレッダースライドを顕微鏡スライド全体に均等に押して、血液を塗抹させます。塗抹標本を風乾させて、血液塗抹標本を固定します。スライドを100%メタノールに30秒間沈めます。

次に、新たに調製したGIM ZAでスライドをGIM ZAで10分間染色し、スライドを流水で30秒間すすぎます。スライドを自然乾燥させてから、100 x 油浸レンズを使用して顕微鏡で観察します。1000の赤血球内のPRBCを列挙し、ドナーマウスが2.5〜5%の必要なレベルに達した場合、パラグラフの割合を計算しますParsit 麻酔下での心臓穿刺またはヘパリン化マイクロヘマトクリット毛細血管を使用した眼窩後出血により、ドナーマウスから血液を収集します。

マウスあたり0.2ミリリットルあたり6PRBCの1倍の最終濃度でRPMI培地に血液を溶解します。正常なマウスのヘマトクリット値は、1ミリリットルあたり10の9番目の赤血球の約6倍であると考えてください。実際、8〜12週齢の実験用C57黒6匹マウスに、従来通り0.2ミリリットルの腹腔内投与に6回目のPRBCに1回10を注射した。

感染したマウスのパラレベルを監視するには、以前と同様に血液塗抹標本を準備します。パラは、感染後2日目または5日目から3日目から2〜3日ごとに決定する必要があります。感染後。

マウスは、パラレベルが5%を超えると、重度のマラリアの兆候がないか毎日監視され、マウスは感染後6日目頃に神経学的症状を示します。感染したマウスは、CO2吸入により安楽死させ、添付文献に記載されているように直ちにPBSを灌流する。この手順の最も難しい側面は、心臓内灌流です。

一連のトラブルシューティングのヒントは、マウスを発泡スチロールの解剖ボードに固定した状態でここで概説されています。解剖トレイ内。腹側を70%エタノールで拭き、次に大きなはさみと鉗子を使用して正中線に沿って皮膚を開き、胸腔を露出させ、皮膚を折りたたんで側面に固定します。

細い鉗子で胸骨を保持し、横隔膜と胸骨の両側に沿って切断し、肋骨を切断します。大きな血管を傷つけないように注意してください。胸郭を頭の横の胸骨でゆるく固定します。

細い鉗子で心室を保持し、細かいハサミで右心房を慎重に切開します。重力灌流システムに取り付けられた23ゲージの針を、上行大動脈に向かって左心室に挿入します。PBSが動作している間、針先の0.5センチメートルだけをマウスに挿入し、5分間または廃液が透明になるまで灌流します。

インター パーフューチュアに続いて、脳を解剖し、RPMI を含む 10 ミリリットルの遠心分離チューブに入れます。中程度。3〜5ミリリットルのRPMI組織培養培地が入ったペトリ皿に、40〜60メッシュサイズのステンレス製セルストレーナーの上に、採取したばかりの脳を置きます。脳組織を細かく切ります。

次に、クリスタルプランジャーを使用して、脳組織の小片をセルストレーナーに押し込みます。脳内ホモジネートを10ミリリットルのチューブに移し、Gの250倍で摂氏4度で10分間遠心分離します。スピン後、上清を捨て、ペレットを3ミリリットルのRPMIに溶解します。

コラゲナーゼDとDNAスワンを含む培地。混合物を室温で30分間回転させます。混合物を70ミクロンのナイロンセルストレーナーに押し込んで、細胞の破片を取り除きます。

その後、インキュベーション後5分間、10ミリリットルのチューブで氷上でインキュベートします。7ミリリットルの30%/コールクッション遠心分離機に脳のホモジネートを400倍Gで室温で20分間慎重に重ねます。上清を捨てた後、ペレットを1ミリリットルの赤血球溶解液に再懸濁し、緩衝液に浸し、氷上で5分間インキュベートします。

口腔内灌流によって脳から除去されない付着性PBCを溶解する。9ミリリットルのRPMI培地洗浄細胞を添加し、Gの250倍で摂氏4度で10分間遠心分離します。Resusは、脳に隔離された白血球またはBSL含有ペレットを50〜100マイクロリットルのRPMI培地に懸濁し、ヘモサイトメーターとトライアンブルー排除を使用して顕微鏡下で生存細胞をマイクロ遠心チューブに細胞を移します。

感染後6日で、生存細胞数が得られたら、20、000〜100、000BSLを回復できます。細胞は、フローサイトメトリーによる分析のために調製されます。この手順の詳細は付属ドキュメントに記載されていますが、最初にここに要約します。

各脳から単離されたすべての細胞を1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブで遠心分離し、抗CD16およびCD32ブロッキング抗体を含む染色バッファーに再懸濁します。氷上で10分間インキュベートした後、細胞を染色バッファーで洗浄し、再度遠心分離し、抗CD 4、抗CD 8、抗TCRおよび抗NK 1.1蛍光抗体を含む染色バッファーに再懸濁します。細胞を氷上で1時間インキュベートし、染色、緩衝液および遠心分離機で洗浄します。

スピン後、細胞はPBSに再懸濁され、フローサイトメーターで少なくとも5, 000〜10, 000のイベントが取得されます。得られたデータは、適切なフローサイトメトリーソフトウェアを使用して分析されます。BSL集団は、灌流マウスまたは国連灌流マウス、マラリア感染マウス、およびナイーブコントロールマウスの脳から回収され、pe、抗NK 1.1、およびPC抗TCRベータ抗体で染色されました。

これらのドットプロットは、NK細胞、Tリンパ球、NK 1.1陽性TCR陽性細胞、およびダブルネガティブ細胞の割合を示しています。灌流または未融合のマラリア感染マウスおよびナイーブコントロールマウスにおけるNK 1.1陰性のTCR陰性は、以前の知見と一致しています。アルファベータTCR陽性T細胞は、感染後6日目に灌流マラリア感染マウスの脳内のBSLプールの高い割合を占めていました。

この集団は、灌流されていない動物の脳で有意に過小評価されているように見えました。灌流されていない脳におけるT細胞頻度の明らかな減少は、これらの動物における二重陰性細胞の割合および総数がかなり高いことと関連していた。灌流されていない脳の二重陰性細胞の割合と数が高いことは、マラリアに感染したマウスだけでなく、ナイーブコントロールでも検出され、これらの細胞が脳血管に存在する非炎症性白血球であり、心臓内灌流が行われない場合に炎症細胞と一緒に回復することを示唆しています。

この手順を試みる際には、隔離された白血球が非炎症性循環細胞で汚染されるのを避けるために、臓器摘出の前に感染したマウスの広範な心電位内増殖を行うことを覚えておくことが重要です。このビデオを見た後、Plasmodium virgaに感染したマウスから脳に隔離された白血球を流動的な形状で分離および分析する方法を十分に理解しているはずです。