Name: 脳から隔離された白血球の単離と解析マラリアベルゲイ ANKA感染マウス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: 学ぶ脳血管から炎症性白血球を単離する方法。Plasmodium berghei ANKA感染マウスを用いてフローサイトメトリーで免疫表現型解析を行い、脳マラリアの病態メカニズムを解明する。

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著者は、技術支援のためにミスリアナMackiewiczに感謝したいと思います。この作品は、ビクトリア州政府業務インフラのサポートとオーストラリア政府は国立保健医療研究評議会IRIISSとプロジェクト無償1031212により可能となった。

1。 P.によるマウスの感染ベルゲイ -ANKA <ol><li>霜凍結保存Pのアリコートベルゲイ ANKA PRBC。 </li><li>両手拘束技術を用いて、脳マラリア耐性のBALB / cドナーマウス（8-12週齢）を抑制する。 1mlのインスリン注射器（28G針）を使用して、PRBCの100から200μlでマウスを注入します。日常的に、1-2ドナーマウスが注入される。 </li><li>感染後4-5日で（pi）をケージからドナーマウスを削除して、ワークステーションまたは使い捨て作業パッドの上に置きます。 </li><li>ゆっくり尾の端でマウスを抑制し、小さなハサミを使用する（約1mm）尾の先端をカットします。代わりに、25 Gの針を使って小さな尾穿刺を行うことができた。 </li><li>曇らされたエンド顕微鏡スライドの終わり近くにマウスの尾静脈から血液を一滴。 </li><li> 45°の角度で第2のスライド（スプレッダー）を配置し、一滴の血にそれをバックアップしてください。血液はエッジに沿って広がりたら、スプレッダー-スライド前夜をプッシュ血液塗抹標本を作るために顕微鏡スライドを越えnly。スミアが空気乾燥させてください。 </li><li> 30秒間100％メタノールに血液塗抹標本を修正してから10分間、新たに調製した染色でスライドを染色する。 </li><li> 1分間流水で血液塗抹標本をすすぎ、空気乾燥することができますし、顕微鏡（100倍、油浸）の下のスライドを調べる。千赤血球内PRBCを列挙し、パーセント寄生虫を計算します。彼らは実験動物の感染症のために血を流したことができる前にドナーマウスは百分の2.5から5の間に寄生虫のレベルに到達する必要があります。 </li><li>ヘパリン処理マイクロヘマトクリット毛細管を用いて眼窩出血によってドナーマウスから血液を採取します。全ての実験は、ウォルター·エリザホール研究所動物倫理委員会の要件に準拠して行われます。地元の動物倫理委員会の要件に応じて、他の出血の手順は、使用されるかもしれません。 1X10 6 pRBC/0.2 mlの最終濃度でRPMI培地中で血液の必要量を溶かす。それを考えてみましょう正常なマウスのヘマトクリット値は、〜6×10 9赤血球/ 1ミリリットルです。 </li><li>腹腔内（ip）に1×10 6 pRBC/0.2ミリリットルを注入することにより、実験のC57BL / 6マウス（8-12週齢）に感染。 </li><li>感染マウスの寄生虫レベルを監視するために、ステップ1.3から1.8に従ってください。寄生虫は、2日目または3πから始まる2〜3日ごとに決定されるべきである</li><li> C57BL / 6マウスにおける重症マラリアの発症は猫背外観、エリマキ毛皮や低活性として現れることがあります。一部のマウスには、この段階で回復するかもしれませんが、自己立ち直り反射の消失への進行が不可逆的な疾患や動物を安楽死させなければならないことを示します。 </li></ol> 2。マウスと脳抽出の心臓内灌流<ol><li> 60 cmのカラムスタンドの上部に取り付けられたカラムホルダーに500mlの貯水池を確保することにより、手動重力灌流システムを組み立てる。貯水池の底端部にプラスチックのチューブを接続し、バッファの流れを制御するためのチューブクランプを固定します。 23Gの針にチューブを取り付けます。 FILPBSでリザーバー（22℃に保た℃）までのlは、クランプとバッファはすべての気泡を除去するためにチューブを介して実行できるように開きます。 </li><li>安楽死P. CO 2吸入によってベルゲイ ANKA感染マウス。ペダル、軌道や呼吸器の応答の有無によって死亡を確認します。 </li><li>背プラスチックトレイに格納されている発泡スチロールの解剖ボード上の後ろ足と前足で安楽死させたマウスをピン。地元の動物倫理委員会の要求に応じて麻酔が心臓内pefusionの事前の開始を投与することができる。 </li><li> 70％エタノールで腹側を拭きます。 </li><li>胸腔を露出するように正中線に沿って皮膚を開くために、大きなハサミとピンセットを使用しています。両側に折り、ピン肌。 </li><li>細かい鉗子で胸骨を押しながら、横隔膜をカットし、胸骨の両側に沿ってリブを切断する。任意の大血管を傷つけないように注意してください。 </li><li>頭の横に緩く胸骨によって胸郭をピン。 </li><li>心室のウィットを保持hは細かい鉗子と細かいはさみで慎重に切開右心房。 </li><li> PBSが実行されている間上行大動脈に向かって左心室に重力灌流システムに接続されている23Gの針を挿入します。針先端のわずか0.5センチメートルを挿入します。 </li><li> 5分間または排水が透明になるまでマウスを灌流する。 </li><li>固定を解除し、マウスとその腹部の上に横たわっていた。 70％エタノールで頭を拭いてください。 </li><li>大きなハサミを使って、ちょうど頸髄領域の上のカットを行う。 </li><li>頭蓋骨を露出するために離れて正中仙骨-吻側頭蓋底から始まるカット、剥離皮膚を作るために微細なハサミを使用します。 </li><li>頭を抱え、それぞれの軌道の空洞に小さなハサミの刃を配置し、軌道の間のカットを行います。 </li><li>矢状縫合に沿って長手方向の切り込みを入れ、慎重に外側にそれぞれの脳半球上の頭蓋骨をはがします。 </li><li>へらを使って、そっと脳を持ち上げ、RPMI培地を含む10mlの遠心管に入れてください。 </li></ol>3。脳隔離白血球の単離（BSL） <ol><li>安全キャビネットでの作業、場所がたてたRPMI組織培養培地の3-5 mlを入れたペトリ皿の中でのステンレス鋼のセルストレーナー（40-60メッシュサイズ）の上に脳を収穫した。 </li><li>小片に脳組織を切り取ります。 </li><li>クリスタルプランジャーを使用してセルストレイナーで脳組織の小片を押してください。 </li><li> 4℃で10分、250×gで10 mlのチューブと遠心分離機に脳ホモジネートを転送</li><li> 0.05パーセントコラゲナーゼDと2U/ml DNアーゼIを含むRPMI培地3ml中でペレットを溶解</li><li>室温で30分間混合物を回転させます。 70μmナイロンセルストレイナーでおよび/または5分間氷上でインキュベートすることにより、混合物を押すことにより、細胞の破片を取り除きます。 </li><li>室温で20分間、400×gで（ノーブレーキ）で7ミリリットル30％パーコールクッションと遠心分離機に脳ホモジネートを置きます。 </li><li> 5分〜氷上で赤血球溶解バッファーとインキュベート1ml中のペレットを再懸濁し心臓内灌流により脳から削除できませんでした付着PRBCを、溶解する。 </li><li> RPMI培地を9mlを加え、4℃で10分間、250×gで遠心分離し、細胞を洗う</li><li> RPMI培地とエッペンドルフチュー​​ブに移す細胞の50〜100μLに再懸濁し、BSL-含有ペレット。 </li><li>生細胞の同定のためにトリパンブルーで細胞サンプルを1:2の5〜10μlのアリコートを希釈します。 </li><li>血球計数器を用いて顕微鏡下で生細胞をカウントします。 6日目以降はπ、Pからベルゲイ ANKA感染マウスは20,000-100,000 BSLsを回収することができる、神経症状が表示されます。 </li></ol> 4。マルチカラーフローサイトメトリーによるBSLの免疫表現<ol><li> 4℃で10分間、250×gで遠心し、染色緩衝液50μl（PBS、1％ウシ胎児血清（FCS）、2mMのEDTA）に懸濁し、上清とペレットを吸引除去する。 </li><li> anti-CD16/32抗体（Fcblock）を精製し、1μlを添加する。 </li><li> 1細胞をインキュベート氷の上で0分。 </li><li>染色緩衝液1mlで細胞を洗浄します。 4℃で10分間、250×gで遠心し、上清を吸引除去する。 </li><li>必要な蛍光抗体、 すなわち抗CD4、抗CD8、抗TCRと抗NK1.1の所定の最適な希釈を含む染色緩衝液50μlの再懸濁します。 </li><li>氷上で1時間インキュベートする。 </li><li>染色緩衝液1mlで細胞を洗浄します。 4℃で10分間、250×gで遠心し、上清を吸引除去する。 </li><li> 100μlのPBSに細胞を再懸濁する。 </li><li>フローサイトメトリー用プラスチックチューブに細胞を移します。 </li><li>フローサイトメーターを使用して、少なくとも5,000〜10,000のイベントを取得する。必要に応じて適切な染色細胞のコントロールおよび蛍光補正のサンプルが含まれるべきである。 </li><li>適切なフローサイトメトリー·ソフトウェアを使用して結果を分析します。 </li></ol>

<ol><li>Brian de Souza, J., Riley, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+malaria%3A+the+contribution+of+studies+in+animal+models+to+our+understanding+of+immunopathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis.</a> Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).</li>
<li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nature. 5, 722-735 (2005).</li>
<li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenic+basis+of+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415, 673-679 (2002).</li>
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<li>Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((West+Nile+virus%3A+immunity+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">West Nile virus: immunity and pathogenesis.</a> Viruses. 3, 811-828 (2011).</li>
<li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+pathogenic+role+of+brain-sequestered+alphabeta+CD8%2B+T+cells+in+experimental+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).</li>
<li>Campanella, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+receptor+CXCR3+and+its+ligands+CXCL9+and+CXCL10+are+required+for+the+development+of+murine+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).</li>
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<li>Nie, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IP-10-mediated+T+cell+homing+promotes+cerebral+inflammation+over+splenic+immunity+to+malaria+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection.</a> PLoS pathogens. 5, e1000369(2009).</li>
<li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+malaria+parasite+sequestration%3A+CD36+is+the+major+receptor%2C+but+cerebral+pathology+is+unlinked+to+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).</li>
<li>Nitcheu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin-dependent+brain-infiltrating+cytotoxic+CD8%2B+T+lymphocytes+mediate+experimental+cerebral+malaria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunololgy%22%5BJournal%5D)">Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis.</a> Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).</li>
<li>Lundie, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-stage+Plasmodium+infection+induces+CD8%2B+T+lymphocytes+to+parasite-expressed+antigens%2C+largely+regulated+by+CD8alpha%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells.</a> Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

BSLの単離と解析、特性評価および実験マウスモデルにおける組織損傷または感染に反応して脳への移行の炎症性細胞の定量化を可能にする方法です。臓器の抽出とそれに続く細胞単離の前に血液区画の除去のための心臓内灌流ステップの導入は、非炎症性の循環白血球と炎症細胞の汚染を防止するのに有用である。これは、炎症細胞が脳実質5を貫通しているようなマウス脳脊髄炎ウイルスなどの神経向性感染に不可欠な要件であるが、感染赤血球及び炎症性白血球が残っている血管に隔離ではなく、脳組織に浸潤している、げっ歯類のマラリアに特に関連していない可能性があり。従って、マラリア感染マウスの心臓内灌流のみBSLの分析のために推奨されるべきではないだけでなく、ために有用かもしれない寄生虫組織隔離10,11の評価。非炎症性の循環白血球と同様に、マラリア原虫の未熟なフォームが血管内皮に付着することができないと灌流手順で削除する必要があります。これとは対照的に、付着したPRBC（成熟シゾント）は、脳の血管内に留まるように見えます。P.ルシフェラーゼを発現ベルゲイ ANKAトランスジェ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ソリューションおよびバッファ </td></tr><tr><td>ギムザアズールエオシンメチレンブルー液</td><td>メルクミリポア</td><td> 1.09204.0500 </td><td>蒸留水で1:10に希釈</td></tr><tr><td> RPMI培地</td><td></td><td></td><td>マウス張</td></tr><tr><td>マウス張PBS </td><td></td><td></td><td> 20 mMリン酸ナトリウム、0.149のNaCl、pH7.3の</td></tr><tr><td> 0.4％トリパンブルー</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T-8154 </td><td> 1:2希釈</td></tr><tr><td>コラゲナーゼD </td><td>生化学ワージントン</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deoxyribonuclease（DNアーゼ）私</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D4263-5VL </td><td>ウシ膵臓由来</td></tr><tr><td>パーコール</td><td> GEヘルスケア</td><td> 17-0891-01 </td><td> PBS中30％溶液</td></tr><tr><td>純トリス</td><td>インビトロジェン</td><td> 15505-020 </td><td></td></tr><tr><td>塩化アンモニウム（NH 4 Cl） </td><td> AnalaR </td><td> 10017 </td><td></td></tr><tr><td>赤細胞溶解バッファー</td><td></td><td></td><td> 17 mMトリス、14nMのNH 4 Cl、pH7.2の</td></tr><tr><td> FCS </td><td>ギブコ</td><td> 1009 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA二ナトリウム塩</td><td>メルク</td><td> 10093.5V </td><td> 0.1M、pH7.2の</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 抗体とコンジュゲート </td></tr><tr><td>抗マウスCD16/CD32（FCブロック）、クローン2.4G2 </td><td> BDファーミンジェン</td> &lt;TD&gt; 553142 </td><td> 50μLの染色緩衝液で1μL（0.5mg/50ミリリットル） </td></tr><tr><td> FITC-抗マウスCD4、クローンH129.19 </td><td> BDファーミンジェン</td><td> 553651 </td><td></td></tr><tr><td> PE-抗マウスNK1.1、クローンPK136 </td><td> BDファーミンジェン</td><td> 553165 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5抗マウスCD8、クローン53-6-7 </td><td> BDファーミンジェン</td><td> 551162 </td><td></td></tr><tr><td> APC-抗マウスTCR-β、クローンH57-597 </td><td> BDファーミンジェン</td><td> 553174 </td><td></td></tr><tr><td> PE-抗マウスCXCR3、クローン220803 </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> FAB1685P </td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化抗マウスCCR5、クローンC34-3448 </td><td> BDファーミンジェン</td><td> 559922 </td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン-も、PerCP-Cy5.5 </td><td> BDファーミンジェン</td><td> 551419 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 機器と材料 </td></tr><tr><td> SuperFrost顕微鏡スライド</td><td>ボシュロムメンツェル-グレイザー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖用ピンセット、はさみ</td><td> REDA Instrumente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 500ミリリットルのPBS貯水池</td><td>ナルゲン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゴムチューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 23G針</td><td> BD PrecisionGlide </td><td> 302008 </td><td></td></tr><tr><td>金属ふるいを含む細胞解離キット</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> CD-1 </td><td></td></tr><tr><td> 70μmのナイロン細胞ストレーナー</td><td> BDファルコン</td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td>血球計</td><td> GmbHはノイバウアー</td><td> 717810 </td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメトリー管</td><td> BDファルコン</td><td> 352008 </td><td></td></tr></tbody></table>

脳から隔離された白血球の単離と解析<em&gt;マラリアベルゲイ</em&gt; anka感染マウス

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

我々はPの脳血管から付着炎症細胞の単離および特性評価のための方法を説明ベルゲイ ANKA感染マウス。実験的脳マラリア、人間1,2における熱帯熱マラリア原虫媒介重症マラリアの再現する一定の重要な側面、その神経学的症候群の誘導にこの寄生虫のひずみの結果と感受性マウス系統の感染。血液段階のマラリアの成熟型は、それらが血管内皮細胞に結合することができます感染赤血球の表面に寄生するタンパク質を発現している。このプロセスでは、低酸素症および出血3、その結果、血流に障害を誘発し、また寄生虫隔離のサイトに炎症性白血球の動員を刺激する。 他の感染症とは異なり、すなわちneutrotopicウイルス4-6、両方マラリア寄生赤血球（PRBC）ならびに関連inflammatory白血球は血管内ではなく、脳実質に浸潤するより隔離のままである。したがって、非炎症性の循環細胞、臓器の抽出と組織の処理の前に感染したマウスの大規模な心臓内灌流による隔離白血球の汚染を避けるために、血液区画を削除する場合は、この手順が必要になります。灌流後、脳を採取し、小片に解剖した。組織構造は、さらにその結果脳ホモジネートは、その後ミエリンおよび他の組織片から脳隔離された白血球の分離（BSL）が可能パーコール勾配に遠心分離されるコラゲナーゼDとDNase Iで酵素処理によって破壊されています。単離された細胞は、その後、フローサイトメトリーによってその後の分析のための蛍光抗体と血球計数器とステンドを使用してカウントし、洗浄する。 この手順では、炎症性白血球の包括的な表現型の特徴は、再の脳への移行を可能にするストロークだけでなく、ウイルスや寄生虫感染症を含む様々な刺激に応答特性。この方法はまた、前臨床動物モデルにおける新規抗炎症治療の評価のための便利なツールを提供します。

図の結果。 2に示す比率と灌流したりunperfusedマラリアに感染し、ナイーブ対照マウスの脳から回収された別のBSLの人口の絶対数。議定書のテキストに示されているように隔離されたBSLは、PE-抗NK1.1およびAPC-抗TCR-β抗体で染色した。 7月9日以前の知見と一致して、αβTCR+ T細胞は、灌流しマラリア感染マウス（6日目PI）の脳におけるBSLプールの高い割合を占めている。この集団は著しく（図2A-B）の非灌流した動物の脳内に過小評価であるように見えた。これらの動物では（図2A-B）の非灌流した脳内T細胞の頻度の明らかな減少がかなり高い割合とダブルネガティブ細胞の総数- （ - NK1.1αβTCR）と関連していた。 unperfused脳内ダブルネガティブ細胞で高い割合と数字のみがマラリアに感染したマウスではなく、NA＆IUにも検出されなかったミリリットル、VEのコントロール、これらの細胞は、心臓内の血流が行われていない場合は炎症細胞と一緒に回収される脳血管中に存在する非炎症性白血球であることを示唆している。 <p class="jove_co...

の脳血管から付着炎症性白血球を単離するための方法<em&gt;マラリアベルゲイ</em&gt; ANKA感染マウスが記載されている。この方法は、フローサイトメトリーによって蛍光抗体とその後の分析で染色した後に定量化ならびに単離された白血球の表現型の特徴を可能にします。

脳から隔離された白血球の単離と解析<em&gt;マラリアベルゲイ</em&gt; ANKA感染マウス

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

この手順の全体的な目標は、マラリア原虫の眼に感染したマウスの脳血管から付着性炎症性白血球を分離して、実験的脳マラリアを誘発することです。マウスに注射によりマラリア原虫に感染させ、眼に寄生した赤血球を投与します。マウスが病気の兆候を示し始めた後、マラリアに感染したマウスの循環細胞は経口灌流によって除去されます。その後、脳を採取し、炎症性白血球を分離するために酵素で組織を消化します。次に、マルチカラーフローサイトメトリーを免疫表現型に対して実施します。脳隔離された白血球 得られたデータの解析により、マラリアに感染したマウスの脳に移動する白血球の割合と絶対数が明らかになりました。この方法は、感染した動物の脳内の寄生虫隔離部位にどのような種類の炎症細胞がさまざまな実験条件下で移動するのかなど、マラリアの病因分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この方法の視覚的なデモンストレーションは重要です。灌流の手順は、大きな血管を傷つけないようにスピードと注意の両方が必要なため、習得するのが困難です この手順の一部を示すのは、動物技術者のLeanna Mcic氏、博士課程の学生であるVictoria氏、博士課程のRick氏、および私の研究室のポスドクであるLisa Aez博士です。このプロトコルは、マウスをp berge eye ancaに感染させ、P berge eye ancaの凍結保存されたアリコートを解凍し、赤血球またはpbcsを室温に戻すことから始めます。生後8〜12週齢のドナーマウスをケージから取り出し、ワークステーションに置きます。人差し指と親指で首筋をつかみます。マウスを裏返し、100〜200マイクロリットルのマラリア原虫ベルゲアイを腹腔に注入します。定期的に2匹のドナーマウスにPBCsを注射します。注射後、感染後4〜5日でマウスをケージに入れます。ドナーマウスをケージから取り出し、ワークステーションに置きます。マウスの尾静脈から一滴の血液を、つや消しにした端の顕微鏡スライドの端近くに置きます。2 番目のスライドを 45 度の角度で置き、血滴に戻します。血液が端に沿って広がったら、スプレッダースライドを顕微鏡スライド全体に均等に押して、血液を塗抹させます。塗抹標本を風乾させて、血液塗抹標本を固定します。スライドを100%メタノールに30秒間沈めます。次に、新たに調製したGIM ZAでスライドをGIM ZAで10分間染色し、スライドを流水で30秒間すすぎます。スライドを自然乾燥させてから、100 x 油浸レンズを使用して顕微鏡で観察します。1000の赤血球内のPRBCを列挙し、ドナーマウスが2.5〜5%の必要なレベルに達した場合、パラグラフの割合を計算しますParsit 麻酔下での心臓穿刺またはヘパリン化マイクロヘマトクリット毛細血管を使用した眼窩後出血により、ドナーマウスから血液を収集します。マウスあたり0.2ミリリットルあたり6PRBCの1倍の最終濃度でRPMI培地に血液を溶解します。正常なマウスのヘマトクリット値は、1ミリリットルあたり10の9番目の赤血球の約6倍であると考えてください。実際、8〜12週齢の実験用C57黒6匹マウスに、従来通り0.2ミリリットルの腹腔内投与に6回目のPRBCに1回10を注射した。感染したマウスのパラレベルを監視するには、以前と同様に血液塗抹標本を準備します。パラは、感染後2日目または5日目から3日目から2〜3日ごとに決定する必要があります。感染後。マウスは、パラレベルが5%を超えると、重度のマラリアの兆候がないか毎日監視され、マウスは感染後6日目頃に神経学的症状を示します。感染したマウスは、CO2吸入により安楽死させ、添付文献に記載されているように直ちにPBSを灌流する。この手順の最も難しい側面は、心臓内灌流です。一連のトラブルシューティングのヒントは、マウスを発泡スチロールの解剖ボードに固定した状態でここで概説されています。解剖トレイ内。腹側を70%エタノールで拭き、次に大きなはさみと鉗子を使用して正中線に沿って皮膚を開き、胸腔を露出させ、皮膚を折りたたんで側面に固定します。細い鉗子で胸骨を保持し、横隔膜と胸骨の両側に沿って切断し、肋骨を切断します。大きな血管を傷つけないように注意してください。胸郭を頭の横の胸骨でゆるく固定します。細い鉗子で心室を保持し、細かいハサミで右心房を慎重に切開します。重力灌流システムに取り付けられた23ゲージの針を、上行大動脈に向かって左心室に挿入します。PBSが動作している間、針先の0.5センチメートルだけをマウスに挿入し、5分間または廃液が透明になるまで灌流します。インター パーフューチュアに続いて、脳を解剖し、RPMI を含む 10 ミリリットルの遠心分離チューブに入れます。中程度。3〜5ミリリットルのRPMI組織培養培地が入ったペトリ皿に、40〜60メッシュサイズのステンレス製セルストレーナーの上に、採取したばかりの脳を置きます。脳組織を細かく切ります。次に、クリスタルプランジャーを使用して、脳組織の小片をセルストレーナーに押し込みます。脳内ホモジネートを10ミリリットルのチューブに移し、Gの250倍で摂氏4度で10分間遠心分離します。スピン後、上清を捨て、ペレットを3ミリリットルのRPMIに溶解します。コラゲナーゼDとDNAスワンを含む培地。混合物を室温で30分間回転させます。混合物を70ミクロンのナイロンセルストレーナーに押し込んで、細胞の破片を取り除きます。その後、インキュベーション後5分間、10ミリリットルのチューブで氷上でインキュベートします。7ミリリットルの30%/コールクッション遠心分離機に脳のホモジネートを400倍Gで室温で20分間慎重に重ねます。上清を捨てた後、ペレットを1ミリリットルの赤血球溶解液に再懸濁し、緩衝液に浸し、氷上で5分間インキュベートします。口腔内灌流によって脳から除去されない付着性PBCを溶解する。9ミリリットルのRPMI培地洗浄細胞を添加し、Gの250倍で摂氏4度で10分間遠心分離します。Resusは、脳に隔離された白血球またはBSL含有ペレットを50〜100マイクロリットルのRPMI培地に懸濁し、ヘモサイトメーターとトライアンブルー排除を使用して顕微鏡下で生存細胞をマイクロ遠心チューブに細胞を移します。感染後6日で、生存細胞数が得られたら、20、000〜100、000BSLを回復できます。細胞は、フローサイトメトリーによる分析のために調製されます。この手順の詳細は付属ドキュメントに記載されていますが、最初にここに要約します。各脳から単離されたすべての細胞を1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブで遠心分離し、抗CD16およびCD32ブロッキング抗体を含む染色バッファーに再懸濁します。氷上で10分間インキュベートした後、細胞を染色バッファーで洗浄し、再度遠心分離し、抗CD 4、抗CD 8、抗TCRおよび抗NK 1.1蛍光抗体を含む染色バッファーに再懸濁します。細胞を氷上で1時間インキュベートし、染色、緩衝液および遠心分離機で洗浄します。スピン後、細胞はPBSに再懸濁され、フローサイトメーターで少なくとも5, 000〜10, 000のイベントが取得されます。得られたデータは、適切なフローサイトメトリーソフトウェアを使用して分析されます。BSL集団は、灌流マウスまたは国連灌流マウス、マラリア感染マウス、およびナイーブコントロールマウスの脳から回収され、pe、抗NK 1.1、およびPC抗TCRベータ抗体で染色されました。これらのドットプロットは、NK細胞、Tリンパ球、NK 1.1陽性TCR陽性細胞、およびダブルネガティブ細胞の割合を示しています。灌流または未融合のマラリア感染マウスおよびナイーブコントロールマウスにおけるNK 1.1陰性のTCR陰性は、以前の知見と一致しています。アルファベータTCR陽性T細胞は、感染後6日目に灌流マラリア感染マウスの脳内のBSLプールの高い割合を占めていました。この集団は、灌流されていない動物の脳で有意に過小評価されているように見えました。灌流されていない脳におけるT細胞頻度の明らかな減少は、これらの動物における二重陰性細胞の割合および総数がかなり高いことと関連していた。灌流されていない脳の二重陰性細胞の割合と数が高いことは、マラリアに感染したマウスだけでなく、ナイーブコントロールでも検出され、これらの細胞が脳血管に存在する非炎症性白血球であり、心臓内灌流が行われない場合に炎症細胞と一緒に回復することを示唆しています。この手順を試みる際には、隔離された白血球が非炎症性循環細胞で汚染されるのを避けるために、臓器摘出の前に感染したマウスの広範な心電位内増殖を行うことを覚えておくことが重要です。このビデオを見た後、Plasmodium virgaに感染したマウスから脳に隔離された白血球を流動的な形状で分離および分析する方法を十分に理解しているはずです。

isolation-analysis-brain-sequestered-leukocytes-from-plasmodium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

軟膜微小循環の時間的空間的血行動態および炎症性イベントに追従するように生体顕微鏡。...

クローズ頭蓋窓を使用してマウス脳の微小循環の生体顕微鏡

マウス脳から浸潤白血球を得るために迅速な方法が記載されている。この方法は連続Percoll勾配と白血球に富む層を選択し、精製する不連続フィコール勾配を利用しています。分離された白血球は、フローサイトメトリー測定によって特徴付けることができる。...

脳浸潤白血球の分離

このビデオでは、脳マラリアの実験的なマウスモデルの生成を示しています。Plasmodium bergheiに感染した雌の蚊から分離されたスポロゾイトは、拘束されたマウスの尾静脈に注入され、血液脳関門の破壊と脳の炎症を引き起こし、脳マラリアを引き起こします。この感染マウスモデルは、脳マラリアに関連するin...

宿主蚊由来スポロゾイトを用いた実験的脳マラリアのマウスモデル作製

このビデオは、弱毒化した生きたスポロゾイトでマウスモデルを免疫するためのアッセイを示しています。放射線が弱毒化されたマラリア原虫スポロゾイトは、マウスの耳の背側に注入されます。両耳の複数の場所に注射した後、マウスは回復します。...

マウスモデルにおける生弱毒スポロゾイトによる皮内免疫

ここでは、マウスの皮膚から骨髄細胞を分離し、マラリア原虫のスポロゾイトの皮内注射後にリンパ節を排出するためのプロトコルについて説明します。採取した細胞のフローサイトメトリーは、寄生虫に対する皮膚およびリンパ節の炎症反応を特徴付けるための信頼性の高いアッセイを提供します。...

弱毒で皮内免疫後のマウスの皮膚及び排出リンパノードから骨髄性細胞の単離<em&gt;マラリア原虫</em&gt;スポロゾイト

私たちは、実験的な脳マラリアのマウスモデルを記述し、磁気共鳴画像法を用いて生体内で炎症性および微小血管の病理をどのように追跡できるかを示します。...

磁気共鳴映像法を用いた実験的大脳マラリアモデルにおける浮腫発生と微小血管病変のin vivo追跡

ヒトマラリア寄生虫に対するげっ歯類マラリア寄生虫のライフサイクルと生物学の顕著な類似性により、げっ歯類マラリアモデルはマラリア研究に欠かせないものとなっています。ここでは、野生型およびトランスジェニックげっ歯類マラリア種の表現型分析に用いられる最も重要な技術のいくつかを標準化した。...

げっ歯類マラリア寄生虫の現象分析無性および性的血液段階と蚊の段階

このプロトコルの全体的な目標は、マウスアストロサイトおよびミクログリア細胞を中枢神経系から抽出、維持、解離し、続いて原虫寄生虫に感染する方法を指示することである。...

原虫性原虫感染に対する原発星およびミクログリアの同時分離

マラリアは、感染した蚊による マラリア原虫 のスポロゾイト段階の接種によって伝染します。トランスジェニックマラリア原虫は、マラリアの生物学をよりよく理解することを可能にし、 マラリア ワクチン開発の取り組みに直接貢献しています。ここでは、トランスジェニック マラリア原虫...

遺伝子組換え マラリア原虫ベルヘイ ・スポロゾイトの生成

これまでのところ、すべての主要な中枢神経系常在細胞タイプを同じマウスから同時に単離するためのプロトコルは、満たされていない需要です。プロトコルはneuroinflammationの間に複雑な細胞ネットワークを調査し、同時に必須のマウス数を減らすために素朴で、実験的な自己免疫の脳脊髄炎のマウスで適当なプロシージャを示す。...

成体自己免疫性脳脊髄炎マウスからの主要な中枢神経系常在細胞型の同時単離

マラリア原虫の性的発達は、蚊の中腸で起こります。寄生虫の性段階を標的にすることは、感染をブロックするための有望な戦略です。私たちは、受精卵形成後にナノルシフェラーゼを発現するトランスジェニックP.bergheiであるOoklucを開発し、伝達阻害化合物のハイスループットスクリーニングを可能にしました。この記事では、Ooklucを使用したスクリーニングの方法について詳しく説明します。...

Ookluc: Plasmodium berghei 系統による感染阻止化合物の同定

学ぶ脳血管から炎症性白血球を単離する方法。Plasmodium berghei ANKA感染マウスを用いてフローサイトメトリーで免疫表現型解析を行い、脳マラリアの病態メカニズムを解明する。

脳から隔離された白血球の単離と解析

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