細胞内病原体によって引き起こされる液胞破裂のシングルセル測定

この実験は、単一細胞内の細胞内病原体によって誘発されるVA破裂をモニターします。まず、細胞エステラーゼによって切断されたCCF 4:00 AM色素を細胞にロードします。次に、FL神経細菌を調製してCCFに適用し、4つの負荷を受けた細胞をインキュベートし、宿主細胞への細菌侵入のために細胞を摂氏37度でインキュベートします。

次に、450ナノメートルと535ナノメートルのチャネルで放出される強度の比率を決定します。結果は、サイトゾルに病原体が存在することを示しています ハイスループットライへの適応性のため。この技術は、宿主病原体の相互作用における細菌の細胞内局在化の重要な問題に対処することにより、新規抗生物質の同定を容易にします。

同僚のTran Vanuとともに、細胞内病原体を高い時間分解能で調べるアプローチの開発に興味を持っていました。これにより、CCF 4 ベータラクタマーゼの定期的な ular 破裂アッセイが確立されました。今日、このアプローチは、研究室の2人の大学院生、Nora MellUとCharlotte Kellerによって実験的に発表されます 野生型と変異細菌株をTCSBの8ミリリットルに接種し、アンピシリンのミリリットルあたり50マイクログラムを含むTCSBの8ミリリットルに培養物を置きます 摂氏37度のシェーカーに培養物を置きます ウェルごとに10倍10回 ウェルあたり。

100マイクロリットルのDMEMに10%ウシ胎児血清1%ペニシリンストレプトマイシン培養液を含有し、翌日5%二酸化炭素インキュベーター内の細胞をTCSBで100分の1希釈で細菌を継代培養し、アンピシリンの1ミリリットルあたり50マイクログラムを補充し、摂氏37度のシェーカーで2時間半増殖します。次に、hela細胞をロードするために、CCF 4:00 AM色素をemバッファーで調製し、細胞をPBSで一度洗浄します。次に、25マイクロリットルのCCF 4:00 AMローディングミックスをウェルあたり室温で2時間30分間、室温でウェルごとに2時間30分間ローディングミックスして、感染ペレット1ミリリットルの細菌を調製し、500マイクロリットルのPBSリジン10マイクログラム/ミリリットルのポリオールリジンとベータラクタマーゼ1ミリリットルあたり40マイクログラムを補給

室温で回転ホイール上で10回インキュベートし、次に500マイクロリットルのPBSで1回洗浄し、各細菌ペレットを500マイクロリットルの1ミリモルプロベネシッドのEMバッファーに再懸濁し、細胞を150マイクロリットルの1ミリモルプロブで1回洗浄します。次に、10マイクロリットルの細菌を1ミリモルプローブ溶液100マイクロリットルに希釈し、ヘラ細胞の各ウェルに分配します。室温で暗所で15分間インキュベートした後、プレートを摂氏37度に1時間移します。

1ミリモルのプロビット溶液150マイクロリットルで1回洗浄します。次に、50マイクロリットルの4%パラフォームアルデヒドを1ミリモルのPro溶液に10分間暗所で固定します プロベネシド溶液で1回洗浄した後、最適な細胞セグメンテーションのために30マイクロリットルの10マイクロモル核色素drac fiveを追加します。細胞を30分間インキュベートし、一度洗浄し、1ミリモル溶液100マイクロリットルを加えて、倒立型エピ蛍光顕微鏡で画像を取得します。

励起波長は405ナノメートルでご使用ください。透過光の露光時間を5ミリ秒にして、450ナノメートルと535ナノメートルのフィルターで発光を検出します。535ナノメートルで1000ミリ秒、450ナノメートルで500ミリ秒。

フォーカスキャリブレーションデバイスと自動顕微鏡を組み合わせることで、複数のウェルで数十の異なる位置を同時に取得することができます。共焦点顕微鏡を使用する場合は、450ナノメートルで240ミリ秒、405ナノメートルレーザーの場合は535ナノメートルで360ミリ秒、640ナノメートルレーザーの場合は640ミリ秒の露光時間を使用します。個々の細胞の蛍光シグナルの自動スコアリングを可能にするコンピューターアルゴリズムによってデータを分析します。

たとえば、metamorph や acapella などのソフトウェアを使用して、450 ナノメートルと 535 ナノメートルの発光信号の比率を測定するスクリプトを作成します。このアッセイでは、最終容量2ミリリットルで10〜5番目の細胞を2回使用してHELOC培養を開始します。感染のための細菌を準備し、CCFでヘラ細胞をロードします 4:00 AM摂氏37度の加熱チャンバー内にNプランの空気対物レンズを備えたコンボ顕微鏡を配置します。

405ナノメートルのレーザーを設定し、450ナノメートルと535ナノメートルのフィルターを介して発光します。また、透過光の露光時間を 5 ミリ秒に入力します。535ナノメートルの場合は200ミリ秒、450ナノメートルの場合は100ミリ秒。

データ集録を60分以上90秒ごとに設定します。次に、細胞を2ミリリットルの1ミリモルのプロベネシド溶液で1回洗浄します。emバッファーに1ミリリットルの1ミリリットルを追加します。

次に、皿を顕微鏡のステージに取り付け、6分後に取得を開始します。買収を保留にします。細胞の上に250マイクロリットルの細菌再懸濁液を追加し、取得後の分析のために取得を再開します。

Velocity metamorphまたはimage J.各細胞について450〜535ナノメートルの強度比を取得します。CCF 4:00 AM β-ラクタマーゼアプローチは、HELOC 細胞感染時のゲルフレクスネリなどの細胞内病原体の破裂を追跡するための堅牢で感度の高い方法です。非侵襲的なBS 176 AFA 1ひずみを1時間使用すると、CCF 4フレットプローブは無傷のままで、緑色の信号を発します。

対照的に、毒性の強いM 90 TFA I株は、比メトリックシグナルを決定するために、サイトゾルのプローブ切断と一致するシグナルを青色に切り替えます。私たちは、535ナノメートルと450ナノメートルのチャネルの細胞の検出と測定を自動化するためのメタモルフおよびアカペラソフトウェアのスクリプトを開発しました。細胞の核と細胞質は、DR 5チャネルを使用してセグメント化されます。

その後、アルゴリズムは450ナノメートルと535ナノメートルの陽性細胞集団を検出し、定量化することができます。計算された平均比は、変異株では低く、毒性株では高くなっています。実験は、Gila上皮細胞やTHP 1マクロファージ細胞のような細胞など、さまざまなヒト細胞タイプで実行できます。

どちらの細胞タイプも、感染下で放出されるシグナルを緑色から青色に切り替えることにより、毒性の強いM 90 T AFA one cha株に応答します。非侵襲的株では、緑色信号はメタモルフソフトウェアで開発されたスクリプトを使用して定量化を持続し、Excelで開発されたマクロは、細胞分布の関数として円形破裂のヒストグラムを示します。この方法は、さまざまな細菌の感染力を理解するためにうまく適応させることができます。

たとえば、このデータセットはマイコバクテリウム・ボビスを示しています。BCGは、持続的な緑色の信号で示されるように、実験の全過程にわたってファゴソームに存在します。対照的に、結核菌は、感染の7日後にTHP 1マクロファージでvaga omal膜破裂を誘発し、同じアルゴリズムを使用して感染の7日後に450ナノメートルの信号の出現によって強調されます。

エラによるバラー破裂の研究については、結核菌に感染した細胞は、感染から7日後にマイコバクテリウム・ボビスBCGよりも450〜535ナノメートルの比率が高いことがわかりました。このビデオを見た後、あなたはよく理解しているはずですCCLの4つのベタラクタマーゼアッセイで病原体によるウラル破裂を研究する方法習得すると、このプロトコルは4時間で実行できますが、覚えておいて、プロトコル中に各バッファーにproceを追加する必要があります。電子顕微鏡や膜分画などの既存の方法と比較した場合のこの手法の主な利点は、生化学的処理なしでリアルタイムで実行できることです。

アクチン標識やゲンタマイシン保護アッセイなどのさらなる分析を実施して、宿主細胞内の細菌の取り込みと増殖を評価することができます。