ニワトリ胚における軸索軌道とシナプスターゲットを追跡する後脳のエレクトロ

この手順の全体的な目標は、ニワトリ後脳のニューロンの特定のサブセットを標識し、それらの軸索の軌跡と標的を追跡することです。これは、最初に胚の日の中心に小さな楕円形の窓を開くことによって達成されます.2.75。卵の次のDNAプラスミドは、後脳内腔に注入されます。

次に、後脳を片側にエレクトロポレーションして、目的のニューロン群と孵化した卵子で構築物を発現させます。最後に、脳幹を全胚から解剖し、フラットマウント調製または組織切片化を行います。最終的には、免疫蛍光染色と顕微鏡分析を通じて、さまざまな発達段階における後部、脳内、小脳の軸索突起とシナプス標的を示す結果を得ることができます。

この方法は、特定の神経細胞が胚発生中にどのように軸索を投影し、シナプス接続を形成するかなど、発生神経生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。エレクトロポレーションの準備として、ステージ16〜17に達するまで、摂氏37〜38度半で65〜70時間インキュベートします。卵が孵化している間、プルガラスキャピラリーは、アダプターホルダー付きの曲がったL字型の金電極をパルスナレーターに接続します。

エレクトロポレーションパラメータを25ボルト、5パルス番号、45ミリ秒のパルス長、300パルス間隔に設定します。マウスピペット、10ミリリットルのシリンジニードルパラフォームストリップ、柔らかいブラシ、鋭利な解剖ハサミ、および25ミリリットルの滅菌PBSを準備します。DNAプラスミドの適切な混合物を調製し、注入されたDNAを視覚化するために高速緑色色素を添加します。

卵が適切な発達段階に達したら、卵をインキュベーターから取り出し、水平位置に保ちます。卵の殻をきれいにするために70%エタノールを使用してください。胚の曝露を最小限に抑えるために、一度に1つの卵子を扱います。

ハサミの先で空気を抜く時間です。卵極に穴を開け、注射器で3〜4ミリリットルのアルブミンを取り除きます。解剖はさみを使用して、卵殻の上部水平ポールに小さな楕円形の窓を開きます。

プロセス全体を通して、乾燥を防ぐために胚の上にPBSを数滴滴下します。マウスピペットを使用して、少量のDNA混合物をガラスキャピラリーにロードします。次に、胚を後端を間接図にして配置します。

次に、毛細血管を約45度保持して、コドル後脳を貫通します。気泡を形成せずに胚の周りから膜を取り除かないでください。慎重に息を吐き、DNA溶液を後脳内腔に注入します。

溶液はDNA注入直後に前方に広がります。平行電極を正確な標的APおよびDV後脳の位置に配置します。心臓に触れずに、電極を少し腹側に押して、エレクトロをパルスします。

電極は、導電性を示すために気泡で覆い、電極を慎重に取り外し、PBSを数滴滴下して胚を冷却し、気泡を除去する必要があります。インキュベーション中の乾燥を防ぐために、パーフィルストリップを使用して卵の開口部を適切に密閉し、柔らかいブラシとPBSで電極を洗浄し、卵をインキュベーターに希望の時間置きます。胚の生存率は、エレクトロポレーション後約90%2〜3日で、エレクトロポレーション後12日で最大50%減少します。

後脳のフラットマウント調製を行うには、胚を慎重に解剖し、周囲の膜や血管から分離します。PBSを含む小さなシリコンコーティングされたペトリ皿に胚を置き、胚を背に向けています。タングステンピンを使用して皿に取り付けます。

次に、鋭利なガラスキャピラリーを使用します。後頭部の屋根板に鋭いピンセットとマイクロハサミで背側にスリットを入れます。頭の上部を持ち、後脳組織を吻側からよちよち歩きまで非常に慎重に引っ張ります。

後脳を分離した後、残りの腹側組織を切除します。後脳を4%パラホルムアルデヒドまたはPFA溶液で室温で1〜2時間インキュベートします。その後、PBTで洗浄してPFAを取り除きます。

テキストプロトコルに記載されている免疫蛍光調製を行った後、後脳を背側に向けてスライドガラスの上に置きます。後脳に蛍光封入剤を添加し、ガラスキャピラリーまたはタングステン針を使用してスライド上の後脳を平らにします。カバースリップによるティッシュの圧迫を防ぐために、各コーナーに少量のグリースを追加します。

後脳の上にカバースリップを慎重に置き、気泡が付着しないようにします。カバーガラスの端にマニキュアを追加します。脳幹のクライオ切片は、E 6.5以降のどの発達段階でも行うことができます。

それらは、非常に厚くなる平らに取り付けられた胚の軸索を視覚化するのが難しいため、好ましい方法であるべきです。さらに、シナプスのデモンストレーションには、組織の切片化と顕微鏡下での高倍率ビューが必要です。クライオ切片用のサンプルを調製するには、胚を解剖し、脳を取り巻くすべての組織を切除します。

PBSですすいでください。次に、マイクロハサミと鋭利なピンセットを使用して、髄質のコドル領域で胚を切断します。小脳と中脳の間に広く切開し、脳幹全体を切除します。

組織には、髄橋と小脳emが含まれている必要があります。以下の例では、チェック後脳のニューロン間ニューロンの1つのサブグループであるDAで発現するエンハンサーエレメントをクリーリコンビナーゼの上流にクローニングし、クリー依存性細胞質GFPレポータープラスミドと共エレクトロポレーションした。ステージE 4.5でのフラットマウント調製は、発達の後期段階でDA 1間ニューロンの軸索突起をマッピングするための2つの対側の上行軸索投影パターンを明らかにします。

プレコンの無条件GFPレポーターカセットを、A TOH one creen enhancerおよびtranspose vectorとともに、2本のピギーバックアームの間にクローニングしました。この戦略により、エレクトロポレーションCプレコンコンディショナルMG FPがニワトリ染色体に組み込まれ、その結果、ストップカセットがD 1ニューロンのみに除去され、GFPの長期発現が可能になります。DAでは1つのセル。

GFPのメシル化形態は、細胞質で希釈されるのではなく、軸索膜に沿って局在するように、GFPを膜につなぎます。E 13.5で採取され、矢状切片で分析された脳幹。DA one 軸索は小脳に蓄積し、ZI one 陽性細胞によって特徴付けられる外部顆粒層または EGL に向かって伸びることがわかりました。

また、小脳内のD one 軸索のシナプス標的も解析した。E 2.75胚をシナプス小胞タンパク質2レポータープラスミド、H one Creeエンハンサー、およびピギーバックトランスポーズでエレクトロポレーションした。この方法により、シナプス前DAの1軸索末端におけるGFPレポーターの発現が可能になります。

小脳はE 13.5で切片化され、一般的なシナプス前マーカーであるシナプスタマンと、ビキニ層を標識するカルビンジンで染色されました。切片の高倍率表示は、ビキニ層を含む複数の小脳領域におけるSVの2つのGFP陽性シナプス小胞を示しています。この結果は、DAのシナプス接続を明らかにします 1つの後脳脳小脳間ニューロン

このビデオを見た後、ニューロン細胞のサブセットを特異的に標識するために、胚の2日目のポイント75で鳥のHeinにDNAを電気操作する方法をよく理解しているはずです。この手順により、標識されたニューロン細胞の軸索突起とシナプス結合を複数の発生段階で追跡することができます。