ローカスの神経活動を特徴づけるためにマルチユニット記録方法（

この手順の全体的な目標は、昆虫の嗅覚経路の最初の3つの信号処理センターからの匂いが取り消されたマルチユニット神経活動を記録することです。これは、最初にカスタム設計の部屋でイナゴを拘束し、電気生理学的記録のためにそのアンテナの1つを安定させることによって達成されます。2番目のステップは、ガラスマイクロ電極を作製し、それを太陽の根元に挿入して、臭気誘発反応を監視することです。

次に、イナゴの脳からの神経活動を記録します。多段階の解剖手順に従って神経組織を露出させ、嗅覚ニューロンからの入力を処理します。最後のステップでは、バッタとアンテナローブ、およびキノコ体からのアンサンブル神経活動を記録するために、マルチ電極アレイを適切に配置します。

最終的に、ここで実証された細胞外記録法は、昆虫の嗅覚経路に沿った最初の3つの処理センターで匂い誘発応答を特徴付けるために使用されます。この方法は、比較的単純な無脊椎動物の嗅覚系における匂い誘発性神経応答の特徴を明らかにするために使用されてきましたが、他の神経系のアンサンブル活動を調べるためにも適応させることができます。この手順のいくつかの重要な側面、例えば電極の配置や一部の解剖手順などは習得が非常に難しいため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。

さらに、これらの方法はほとんどが定性的であり、さまざまなラボが時間の経過とともに異なる方法で完成させてきました。この手順を開始するには、完全に成長した翼を持つ、ただし交配段階に先立つ、密集したコロニーからいずれかの性別の若い成虫のバッタを選択します。次に、イナゴの足を切断して拘束します。

切断部位を組織接着剤でシールします。次に、ローカストをカスタムデザインのチャンバーに固定し、胸部に小さな電気テープを掛けます。解剖顕微鏡で、アンテナを配置するためのワックスプラットフォームに浅い溝を作ります。

アンテナを溝に置き、アンテナの両端にバティワックスを使用して固定します。その後、接地電極を胸部に挿入します。バティックワックスを使用して、切開部位をシールし、アース線を所定の位置に保持します。

次に、安定化したローカストアンテナを実体顕微鏡の下に設置し、防振テーブルに置きます。臭気ボトルの出口ラインを臭気供給チューブに接続します。送液されたアンテナから数センチ以内に臭気送達チューブを配置すると、バウンドベイパーはローカストアンテナの約10センチ後ろに配置された真空漏斗によって除去されます。

次に、マイクロピペット極性を備えたバースケイ酸ガラスキャピラリーを使用してガラス電極を作製し、ガラス電極にイナゴ生理食塩水を充填します。次に、ガラス電極を電動マイクロマニピュレーターに取り付けられたマイクロピペットホルダーに入れます。記録シンの基部が顕微鏡ではっきりと見えることを確認してください。

電極をsynの基部にそっと挿入します。その後、信号を 10, 000 回増幅します。ACアンプを使用します。

信号を 0.3 から 10.0 kHz の間でフィルタリングし、15 kHz のサンプリング レートで集録します。データ収集システムを使用すると、電極が適切に配置されている場合、自発的な神経活動を検出できます。刺激誘発反応は、臭気送達チューブを通じて臭気パルスを送達することによって監視することができる。

アンテナの近くに位置して細胞外活動の変化を追跡し、前述の拘束手順に従いました。イナゴをカスタムデザインのチャンバーに配置します。イナゴの頭の周りにワックスカップを作ることから解剖プロセスを開始します。

イナゴの頭の両側に2つのワックスタワーを建設し、アンテナの高さまで到達します。次に、ゴム製ガスケットにしっかりとはまる小さなポリエチレンチューブに各アンテナを挿入します。次に、ガスケットをワックスタワーに取り付けて、プラスチックチューブがアンテナの基部に向かって自由にスライドできるようにし、アンテナが移動するのを防ぎます。

次に、顕微鏡下で、イナゴの頭の周りにワックスカップを作り始めて、解剖手順中および解剖後に生理食塩水の灌流を可能にします。ワックスカップは口の部分のすぐ上から始まり、両方のワックスタワーを囲み、複眼を超えて伸びている必要があります。ワックスカップが完全に構築されたら、エポキシ樹脂を使用してアンテナの基部をプラスチックチューブの下端に取り付けます。

これにより、周囲のキューティクルが取り除かれた後でもアンテナが所定の位置に保持されます。この時点から、ワックスカップを生理食塩水で満たしたままにします。次に、2 つの間の中央の四角形領域を削除します。

アンテナ。その後、アンテナの基部にある複眼やキューティクルを乱さずに、隣接する領域のキューティクルを取り除きます。細い鉗子を使って、脳を囲むエア袋と脂肪体をやさしく取り除きます。

これで、イナゴの脳がはっきりと見えるはずです。嗅覚情報を処理する脳領域は、この2つの間に位置しています。触角で腸をそっと引っ張り、細いハサミで切ります。

次に、翼を取り外し、直腸のすぐ上の腹部に小さな切開を行います。粗い鉗子で後腸を引っ張って腸を取り出します。このステップにより、腸の動きが製剤を不安定にしないことを確認します。

生理食塩水の漏れを防ぐため。腹部を切開部位のすぐ前方に縫合糸で結びます。次に、ワックスの細かい層でコーティングされた細いワイヤーループで作られた小さなプラットフォームを使用して、脳を持ち上げ、電気生理学的に安定させます。

脳の記録は半透明のシースで保護されており、録音する前にシースを取り外す必要があります。鞘を弱めるには、ワックスカップを部分的に排出し、少量のプロテアーゼを脳の表面に注意深く広げます。酵素を約5〜10秒間適用した後、生理食塩水で脳を十分にすすいでください。

次に、超微細な鉗子でシースを非常に優しくつまんで引き上げ、シースを引き裂いて開いて記録部位を露出させます。この手順では、イナゴの準備物を防振テーブル上の実体顕微鏡の下に置きます。生理食塩水の灌流速度を毎時約40ミリリットルに一定に保ちます。

実験全体を通して、生理食塩水で満たされたワックスカップに浸した塩化物銀線を接地電極として使用します。シングルセンサー記録実験と同様の臭気配信セットアップを準備します。実験に先立ち、電極に金を電気メッキして、インピーダンスを200〜300キロの範囲にします。

主要なニューロンの記録には、16チャンネルのシリコンプローブを使用します。顕微鏡下で。電極をアンテナローブの表面に近づけ、手動のマイクロマニピュレータを使用して組織に静かに挿入すると、理想的な記録部位で細胞外信号が複数の記録チャネルによって拾われ、高い信号対雑音比が得られます。

ケニオンセルの記録では、カスタムメイドのツイストワイヤーテロが電気めっきの手順に従ってテロに電気めっきされます。次に、シリコンプローブはテロをキノコ本体の表面に置きます。ケニアの細胞のサマラはこの領域の表層に限定されているため、主要なニューロンとケニアの細胞の両方を同じイナゴ調製物から同時に記録することができます。

記録場所を特定したら、電極が安定するまで少なくとも15分待ちます。次に、15キロヘルツで細胞外信号を取得します。0.3〜6キロヘルツの間でフィルタリングし、16チャンネルのACアンプを使用して

アンテナローブ内の投射ニューロンからのマルチユニット神経活動を観察することができます。2つの異なる匂いに対する嗅覚受容体ニューロンの応答を示す生の細胞外電圧トレース。ここには、2つのオクタルと1つのHエタノールが示されています。

ここには、マルチユニットアンテナローブ記録からの代表的な細胞外トレースが示されています。この電圧トレースでは、異なる原理ニューロンに由来するさまざまな振幅の活動電位またはスパイクを観察できます。灰色のボックスで示されている期間中に4秒間の臭気パルスが適用されたことに注意してください。

キノコ体の細胞外記録の例を以下に示します。嗅覚受容体ニューロンや主要ニューロンとは異なり、昆虫キノコ体内のケニヨン細胞はベースライン活性が低く、匂いにまばらかつ選択的に反応します。これらのマルチユニット記録から単一ユニットの応答を分離するために、公開されたソフトウェアを使用してオフラインでスパイクソーティング手順を実行します。

主要なニューロンとケニアの細胞スパイクソーティングの例は、このビデオを見た後、ここに示されています。挿入嗅覚経路に沿った最初の3つの嗅覚センターのアンサンブル神経活動を特徴付けるために、細胞外マルチユニット録音を実行する方法について十分に理解している必要があります。