皮質ニューロンにおける経験依存性分子の変化の in vivo二光子イメージングにおける

ニューロンにおける依存性分子変化の経験は、脳が行動上の課題に反応して適応する能力に不可欠です。ここでは、遺伝的にコードされたレポーターを介して個々の皮質ニューロンにおけるそのような分子変化の追跡を可能にするin vivo 2光子イメージング法が記載されている。確立された経験豊富な依存遺伝子の1つは、活性調節細胞骨格関連タンパク質またはアークです。

ARCの転写は、神経細胞の活動の激化によって急速かつ高度に誘導される 2つの光顕微鏡による生きたニューロンのアーク発現の検査を可能にするために、我々は、GFPレポーターが内因性アークプロモーターの制御下に置かれたノックインマウスラインを利用する。このプロトコルは、生きた動物のニューロン集団における経験された従属性アークGFP発現パターンを追跡するための外科的調製物およびイメージング手順を説明しています。まず、この技術に必要な動物の準備について説明します。

アークGFP動物は頭蓋窓手術を受け、約2週間で手術から回復します。次に、頭蓋窓の品質がチェックされ、それを介してニューロンを画像化できる場合、動物は行動および2つの光子イメージング実験の開始まで準環境に置かれます。次に、これらの動物を2つの写真顕微鏡で繰り返し画像化します。

数日間かけて目的の行動パラダイムが完成したら、ホットビーズ滅菌器ですべてのツールを洗浄します。無菌手術の前に、70%エタノールで手術部位を洗浄し、清潔なドロップクロスを置きます。腹腔内 1.2 ミリリットル/グラムで与えられる 1.2% エバートン溶液で動物を麻酔します。

尻尾またはつま先をつまんで麻酔レベルを確認し、完全な鎮静を確保します。動物の目を滅菌眼軟膏で覆い、デキサメタゾン0.2ミリグラム/キログラムとカルプロフェン5ミリグラム/キログラムを皮下に注射します。.耳の間の頭蓋骨の上の髪を剃り、ベタジンスクラブと70%エタノールの3つの交互の綿棒で皮膚を滅菌し、動物を定位固定手術段階で動物にマウントします 動物の下に水循環加熱パッドが付いた耳バーで37度に設定された。

動物の麻酔レベルを定期的にチェックし、必要に応じて元の麻酔薬の投与量を補充します。頭皮の皮膚の下に200マイクロリットルの0.5%マルカインを注入して、その領域を麻痺させ、皮膚を切開し、頭蓋骨の上の皮膚フラップを取り除きます。骨膜を取り外し、清潔な綿棒でその部分を乾かします。

0.5ミリメートルのバリが付いた高速デンタルドリルを使用して、ニーズに応じて、関心のある脳領域に直径3〜5ミリメートルの円の輪郭を緩やかに描きます。滅菌済みの0.9%生理食塩水で掘削部位を定期的に濡らし、清潔な綿棒で骨の粉塵を取り除きます。骨から出血した場合は、滅菌生理食塩水にあらかじめ浸したジェルフォームを使用して出血を拭き取り、出血が止まるのを待ちます。

最後の骨層に到達したら、先端の細かい鉗子で骨の島を持ち上げて取り除きます。骨の一番下の棚に硬膜の付着部があるかもしれません。窓が骨縫合糸と交差している場合は、これらをそっと取り除く必要があります。

骨のフラップが持ち上げられたら、露出した硬膜の上に湿らせて泡をそっとゲル化して表面をきれいにし、硬膜出血が止まるのを待ちます。あなたの関心領域が硬膜が特に厚い場所の下にある場合、その上の硬膜を取り除く必要があるかもしれません。その場合は、非常に細い鉗子で硬膜を下のPIAからそっと分離します。

持ち上げた硬膜に別の細い鉗子で小さな切開をします。次に、切り口をつかみ、デュラをそっと分割します。硬膜は細いですが強度が高いので、硬膜の無傷のエッジで脳をスライスしないように注意してください。

関心のある領域から離れて作業するときは、滅菌 A CSF または滅菌生理食塩水でその領域をたっぷりとすすいでください。周囲の頭蓋骨が露出した硬膜または軟膜の周りで大きく湾曲している場合は、クイックセル接着剤を使用して、画像化されない領域の窓カバースリップと密接に接触しないスペースを埋めます。次に、滅菌ガラスカバーを硬膜またはピアの上にそっと置きます。

エラストマー接着剤とガラスの端を覆うために、佐野アクリルゲルを使用します。カバースリップ。露出した頭蓋骨全体を佐野シアノアクリレートゲルまたはクレイジーグルーと歯科用セメントの混合物で覆います。

カスタムメイドの金属製ヘッド固定バーを頭蓋骨の反対側に埋め込みます。疼痛管理のためにケトプロフェン5ミリグラム/キログラムの腹腔内注射後、動物を温かい回復室に戻します。.術後 2 日間鎮痛剤を続けます。

術後回復の2週間後、ISOフッ素で動物に麻酔をかけます。導入用5%、メンテナンス用1.5%。頭部固定フレーム付きのカスタムメイドの顕微鏡ステージに取り付け、頭蓋窓の光学的透明度を確認します。

ブルーライトによる照明下では、脳表面の血管の透明度は、頭蓋窓の品質を強く示しています。エッジが明確に定義されている場合、ウィンドウは使用可能である可能性が高くなります。行動プロトコルを開始する前に、動物を一貫したホームケージ環境に保管して、日々の変動を最小限に抑える必要があります。

ベースラインアークでは、GFP発現レベルは、関心のある脳領域に応じて行動訓練または環境刺激パラダイムを開始します。例えば、動物を連続して異なる視覚環境に曝露して、視覚野弧内のニューロンの特徴的な集団を画像化することができ、ニューロンのGFP蛍光は通常、刺激の2時間後にそのピークレベルに達する。実験のタイムラインは、ピーク蛍光レベルでのニューロンにおけるARC GFP発現の検出を容易にするために最適化することができます。

行動訓練セッションまたは環境刺激が完了した後、ISOフッ素で動物に麻酔をかけます 導入のために5%、維持のために1.5%。動物を頭部固定フレーム付きのカスタムメイドの顕微鏡ステージに取り付けます。2光子顕微鏡では、動物の頭部の位置は、頭蓋骨に埋め込まれた金属棒を使用してステージに直接接続する頭部固定フレームに固定されます。

ISOフッ素と酸素は、ノーズコーンを介してマウスに連続的に供給されます。体温は加熱パッドを使用して維持されます。顕微鏡検出器が周囲光から保護されていることを確認してください。

暗室で2光子レーザースキャンを行うことにより、20 xまたは25 x 1.05の開口数水浸レンズを使用してイメージングします。まず、落射蛍光照明下で、CCDカメラで脳の関心領域上の表面血管パターンの画像を取得します。将来の画像アライメントのために、2光子レーザースキャンを開始して3D画像スタックを取得します。

2光子レーザーの励起波長は920ナノメートル、出力は約50ナノメートルに設定されています。ミリワットで放出された蛍光は、緑と赤の両方のチャネルアークで同時に検出されます。GFP蛍光は緑色チャネルにのみ現れますが、組織自家蛍光は両方のチャネルに現れます。

一般的な画像スタックの寸法は、約 320 x 300、20 x 100 マイクロメートル、水平解像度 0.5 マイクロメートル/ピクセル、垂直解像度 3 マイクロメートル/ピクセルです。画像スタックを取得したら、動物をホームケージに戻します。次の行動およびイメージングセッションまで動物を邪魔しないでください。

必要に応じて、行動とイメージングの手順を数日にわたって繰り返します。以前に取得した脳表面の血管画像を使用して、同じイメージング位置に向きを戻します。この技術の強みは、同じニューロンセットのアーク遺伝子発現変化を数日間にわたって調べることができることです。

生きている動物で。標準的なHISTOCHEMICAL法では、シングルセルの分解能を達成できますが、同じニューロンの遺伝子発現変化を数日間にわたって追跡することはできません。磁気共鳴や核イメージングなどの他のイメージング手法では、個々のニューロンをイメージングするための解像度が不足しています。

そのため、遺伝子発現の変化を測定する他の既存の方法は、ここで説明するイメージング方法の空間分解能と時間的カバレッジの両方に匹敵することはできません。この手順の重要なステップは、頭蓋窓手術です。脳への外傷やガラスカバースリップの下に血液が残らないように、細心の注意を払って実行する必要があります。

硬膜は必要に応じて取り外すことができます。この手順を使用した脳内の最大イメージング深度は、頭蓋窓の明瞭さ、顕微鏡のセットアップ、および蛍光レポーターの明るさに依存することに注意してください。このin vivoイメージングプロトコルは、さまざまな行動経験に応答して個々のニューロンの神経可塑性に関連する分子動力学に関する情報を取得するための効率的で汎用性の高い方法であり、他の経験豊富な制御遺伝子の蛍光レポーターを保有するトランスジェニックマウスに一般的に適用できる可能性があります。