Name: マウスのパイエル板のリンパ球や樹状細胞を単離し、免疫染色 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 学ぶマウス小腸パイエル板からリンパ球と樹状細胞を単離し、フローサイトメトリーと免疫染色の二つのアプローチで解析する方法。腸管免疫の細胞動態を可視化・定量化する技術です。

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我々は、パラフィン切片を調製するための細胞分析とヘレン·ジョンソン（ワズワースセンター動物組織病理コア）を支援するためのRenjie·ソング（ウォッズワースセンターのフローサイトメトリーコア）に感謝。我々は、共焦点顕微鏡と画像収集の支援については博士リチャードA·コール（ウォッズワースセンター光顕微鏡コア）に感謝。我々は、アニメーションの支援についてはアンディベントレー（ウォッズワースセンターの写真とイラスト）承認したいと思います。 MDJは、ライフサイエンス研究財団、ハワードヒューズ医学研究所（HHMI）フェローシップでサポートされています。 SAはワズワースセンター·ヘルスリサーチ株式会社学内ポスドクでサポートされています。この作品は、NIHの助成HD061916とGM082978によって部分的にサポートされていました。

動物は、従来、特定の病原体を含まない条件下で飼育し、ワズワースセンターの機関動物実験委員会（動物実験委員会）のガイドラインに完全に準拠して処理した。 1。経口胃管栄養法<ol><li> 22 G 1.5倍インを使用して、目的の抗原や微生物との選択（任意）強制経口マウス系統。平滑末端給餌針（Popperの科学、ニューハイドパーク、ニューヨーク州）。配達ボリュームはマウス当たり400μlを超えないようにしてください。 </li></ol> 2。フローサイトメトリー用のPP細胞の単離<ol><li>制度的動物のケアと使用委員会（IACUC）のガイドラインによると、CO 2窒息によりマウスを安楽死させる。 </li><li> 70％エタノールまたは手術前ベタジンで腹部を清める。胸郭の底から1.5cm約正中線に沿って始まり外科グレードのはさみを使用して、単一の（1cm）に切開を伴う標準的な開腹手術を行います。当たりを公開itoneal空洞と盲腸を識別します。回腸、盲腸の接合部に端子小腸を切り取ると優しくその全体が腸を削除します。それは腹膜腔から除去されるように腸組織を過度に伸ばすないように注意してください。 </li><li>湿ったペーパータオルやキムワイプのベッドの上で小腸を築く。組織の脱水を防ぐために、生理食塩水で軽く小腸を濡らす。視覚的に腸の抗腸間膜側（ 図1）の、其々のPPを識別します。一般的に、単一のマウスは均等に回腸（遠位）に十二指腸（近位）から配布される5から10目に見えるPPを持っています。平均して、4匹は23 PPをもたらすでしょう。 </li><li>湾曲した手術用のハサミ、優しく物品個々のPPを使用していて、冷たいハンクス平衡塩類溶液（HBSS）中に置いてください。 注 、はさみだけでPPの上にカーブ側を上に配置する必要があり、その後穏やかに組織に適用される。消費税​​PPのみ（ないsurroundingの組織）と冷HBSSに転送されます。 注：前方に第2節では、この点から全てのインキュベーション及び遠心操作は°Cの細胞の生存を維持するために4で行われる必要があります。 </li><li> 37℃で15〜20分間、5 mlの脾臓解離ミディアムとインキュベートにPPを転送℃で精力的に250rpmで振とうしながら。長いインキュベーション時間がマイナスに細胞の生存に影響を与えます。 </li><li>滅菌（オートクレーブ）を70μmナイロンメッシュセルストレーナー上の単一の細胞懸濁液を、場所のPPを生成して、強制的に1ccの注射器からプランジャーのベースを使用してメッシュに組織を粉砕する。あるいは、サンドイッチ2すりガラス滅菌ガラス顕微鏡スライドの間にPPS（封筒でオートクレーブ）、穏やかに前後に運動と組織を挽く。 5ミリリットルファルコンチューブに細胞懸濁液を転送するために滅菌ピペットを使用しています。 </li><li>細胞懸濁液に最終濃度1mMとなるようにEDTAを追加します。用ロッカーでインキュベート室温で5分間。 </li><li>残りの細胞凝集塊または組織片を除去するための第270μmのセルストレーナーを通してデカント細胞懸濁液。 15または50 mlコニカルチューブに細胞を回収する。 </li><li>穏やかに遠心（500×gで5分）の対象セル。 1％ウシ胎児血清（FCS）を含む生理食塩水（PBS）、リン酸緩衝化されているフロー·バッファ内の上清をデカントして細胞を懸濁。 </li><li>細胞数と生存率を決定するために、トリパンブルーに1時10細胞を希釈し、視覚的に光学顕微鏡と血球計数器を用いて細胞を検査します。代わりに、伯爵セルカウンター（Invitrogen社）または類似の測定器を自動的に細胞数と生存率を列挙するために使用することができます。 PPは20から25で始まる、このプロトコルは&gt; 2.5×10 6総細胞が得られるはずです。これは、マウスあたり約0.8から1.2×10 6個の細胞に相当します。 </li></ol>フローサイトメトリー用の細胞の抗体ラベリング &lt;オールスタート= &quot;11&quot;&gt; <li> 96ウェル丸底プレートのウェルに細胞（ウェル当たり10 5）を分注します。 </li><li>穏やかな遠心分離（1,000×gで5分）、ゆっくりと反転板で上清をデカントの対象とプレート。 </li><li>のFcブロックバッファーに細胞を再懸濁し、氷上で15分間インキュベートする。市販のFcブロックバッファの数（ 例えばラット抗マウスCD16/CD32、BD Biosciences社）がありますが、我々は、単にマウスに対するモノクローナルIgG 1を分泌ラットB細胞ハイブリドーマ（ATCC 2.4.G2）から使用済み培地を使用このステップのためのFcγ受容体。 </li><li>静かに転倒板で上記のように穏やかに遠心（1,000×gで5分間）、上清をデカントの対象とプレート。 </li><li>所望の希釈で細胞懸濁液に直接蛍光色素標識抗体を追加して、連続的な揺らしながら氷上で30分間インキュベートする。 </li><li>件名穏やかに遠心（1,000×gで5分間）にプレートし、デカント静かに転倒板による上澄み。 </li><li>フローバッファー100μlで細胞を洗浄します。 </li><li>静かに転倒プレートで5分、そして上清をデカントし、1,000×gでプレートを遠心分離する。 </li><li>フローバッファー300μlとPHEM緩衝液中の1％パラホルムアルデヒド（60mMのPIPES、25mMのHEPES、10mMのEGTA、pH6で4mMのMgCl 2）を100μlから成り再懸濁し、細胞を400μl固定バッファ、。 </li><li> FACSキャリバーまたは同等品を使用したフローサイトメトリーの対象となる細胞。セルクエストプロソフトウェアバージョン5.2を使用して結果を分析します。 </li></ol> 3。 PPの凍結切片の作製<ol><li>組織採取に先立ち、7x7x5ミリメートルプラスチック基金型に最適切断温度（OCT）の化合物を追加します。また、デュワーや氷のバケット内の液体窒素（&gt; 750ミリリットル）のプールを用意しております。 </li><li>マウスを安楽死させると上記のように、laparotamyを実行します。湿ったペーパータオルの上で腸と場所を削除します。 </li><li>へcyrosectioning用のPPを分離し、PBSを含むペトリ皿に単一PPと伝達組織を含む小腸の0.5センチメートル横セグメントをカットします。優しく不要な糞破片を除去するためにPBSでこれらのセグメントの内腔を洗浄してください。 </li><li>垂直に10月を含むベース金型内腸組織セグメントを配置します。液体窒素中で金型を浸し、組織を完全に止めることができるように（1〜2分）。組織が完全に凍結しているときに10月の色は透明から白色に変わります。 。より緩やかな冷却（ 例えば 10月の割れ低減する）ために、液体窒素で冷却したイソペンタンの蒸気槽に浸す型注意：液体窒素を扱うときに、適切な安全ゴーグルを着用する。 </li><li>ピンセットを用いて液体窒素から凍結ベース金型を外し、金型は10月ブロックのエッジが柔らかくできるようにするために必要な時間だけ、室温（約10から15秒）で温めることができます。その時から10月の冷凍ブロックを削除するには金型は、金型を反転させ、アルミ箔のきれいな4×4cmの部分にブロックを取り出すときに背中を軽く押してください。直ちに液体窒素やドライアイス上に格納されているラベルの付いた標本袋に箔と場所にティッシュを包む。あるいは、（&lt;-20℃）の冷凍庫に組織を移す。週間以内に、組織を使用、それ以外のブロックは、年齢とともにもろく​​なります。 </li></ol>凍結セクショニング<ol start="6"><li>凍結切片ライカCM3050S cryomicrotomeまたは同等品を使用して組織を。クライオスタット上のチャンバー温度-21に設定する必要があり℃に</li><li>厚さが12から14ミクロンであるセクションに努めています。 </li><li>フィッシャーSuperFrostプラス（または同等品）ガラス顕微鏡スライド上のセクションを収集し、標準的な低消費電力の光顕微鏡を用いて視覚的に検査する。複数のセクションをスライド上に収集されている場合は、それらが下流染色アプリケーションのために一緒にクラスタ化されていることを確認してください。 </li><li>ストアトン彼は理想的には、スライドボックスに室温でスライドして、数日以内にそれらを使用しています。 </li></ol>凍結切片および共焦点顕微鏡分析の抗体標識<ol start="10"><li> 2分間組織染色jarまたはラック内のアセトンに浸しスライド（またはメタノール）。長時間のインキュベーションは、スライドからデタッチする組織を引き起こす可能性があります。 </li><li>新しい染色瓶にスライドを移し、3分間ずつ、PBS-T（0.05％Tween-20を含む1×PBS）で3回洗浄する。 </li><li> ImmEdge疎水性ペンでセクションを取り囲んでいます。これは、試薬および抗体はインキュベーションの間にその区域に限定されたままであることが保証されます。 </li><li>光から保護加湿チャンバー内で37℃で30分間ブロックバッファのスライド（PBS中2％ヤギ血清）をインキュベートする。 </li><li> 37℃で10分に対するFcブロックバッファ（上記参照）を使用してスライドをインキュベート</li><li> PBS-Tとキムワイプまたは他の吸収性組織を使用してセクションの周りの乾燥した場所にスライドを浸します。実際の組織切片を触れないように注意してください。 </li><li> 37℃で30分間加湿チャンバー内のCのための一次抗体溶液とインキュベートするオーバーレイ組織切片。一次抗体は、典型的には、20μg/ mlの最終濃度になるようにブロックバッファー中に希釈されています。最大3つの抗体は、この段階で直接結合することができるため、直接標識一次抗体の使用は、望ましいです。直接標識された抗体はまた、追加の抗体インキュベーション工程の必要性を排除します。 </li><li>洗浄はPBS中に浸漬することにより3回（各5分間）をスライドします。 </li><li>もし水分チャンバー内で37℃で30分間、関連する二次抗体を用いて、必要に応じて、インキュベートスライド。 </li><li>洗浄はPBS中に浸漬することにより3回（各5分間）をスライドします。 </li><li>上記のようにPHEMの緩衝液中の1％パラホルムアルデヒド中で4分間スライドをインキュベートする。 </li><li> 1分間PBSでスライドを洗浄します。 </li><li>キムワイプまたは吸収する他のを使用してセクションの周りにドライエリア耳鼻咽喉科組織。実際の組織切片を触れないように注意してください。ピペットやスポイトを使って、優しくセクションに直接メディアをマウント延長ゴールドのドロップを置きます。気泡がないように注意しながら取り付け媒体上にカバーガラスを適用します。余分な封入剤を吸収するあぶらとり紙を使用しています。 </li><li>商業マニキュアと顕微鏡スライドにカバースリップを密封し、空気乾燥することができます。 </li><li>ライカTCS SP5または同等の共焦点顕微鏡を用いてスライドを表示します。 </li></ol>

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<li>Lopez-Guerrero, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+infection+activates+dendritic+cells+from+Peyer%27s+patches+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer's patches in adult mice.</a> J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

この記事では、我々は免疫染色、フローサイトメトリーおよび機能解析および凍結切片のための単一細胞調製物を調製するためのPPのパラレルプロトコルを提供してきました。どちらの方法でも、フローサイトメーターとクライオスタットが利用可能である限り、再現性の高い、容易にアクセス可能です。初めての調査官のためには、脾臓と比較すると、PPSからの全細胞収量が比較的貧弱であることが指摘されるべきである。それにもかかわらず、プロトコルは、我々は一般的に単一のマウス0.8から1.2×10 6合計PP細胞間の利回りを概説しています。我々は一般的に20から25プールPPSよりもうやりませんが、スケールアップが可能であり、なぜなら、私たちの経験では、凝集が大幅に（と生存率）の低下を発生し、細胞収量。臨界質量が正常に全体の単離操作を介して細胞を運ぶために必要であるように一方、我々は、このプロトコルのために15名未満のPPを使用することは推奨できません。最大の細胞生存率は下流に機能の優先事項である場合アッセイは、我々は、単離された細胞の小さな試料がより正確なゲー合計PPの細胞集団からの細胞の生存可能なプールを可能にするためにヨウ化プロピジウム染色...

パイエル板（PPS）は、ヒトおよびマウスの小腸（ 図1）を全体に存在する組織化されたリンパ濾胞の巨視的凝集体であると粘膜免疫応答は食物抗原、共生細菌、病原微生物、及び経口ワクチンに対して開始されるときの主要な部位を構成1-4。このような腸間膜リンパ節など他の末梢リンパ組織とは異なり、PPは、輸入リンパ管を欠いている。このように、PPSに適応免疫応答は、腸管腔に由来する抗原に応答して駆動されています。管腔の抗原のサンプリングは、腸およびM細胞として知られている抗原のサンプリングセルの両方で構成されている濾胞関連上皮（FAE）によって達成される。 FAEの下に、サブ上皮ドーム（SED）の領域では、マクロファージ、B細胞、CD4 + T細胞は5月9日と混ざり樹状細胞（DC）のネットワークがあります。各PPリンパfolliclの中核にeは、濾胞樹状細胞（FDCS）とT細胞が豊富な濾胞ゾーンが隣接のB細胞が豊富な中央の胚中心である。のIgA + B細胞plasmablastsとCD4 +エフェクターとメモリセルの開発にPPSの結果による抗原サンプリングその種子周囲の粘膜固有層および粘膜侵略に広い範囲への耐性を提供します。 PPSの抗原サンプリング、処理、プレゼンテーションに関連する複雑な免疫学的事象を解剖すると、PP細胞が腸管粘膜における総リンパ球様細胞のごく一部を構成することを考えると、大変な作業です。この環境における細胞の in vitro での特性評価で支援するために、我々は、フローサイトメトリーおよび機能解析だけでなく、免疫蛍光顕微鏡および免疫組織学のための凍結切片を調製するためのPPのプロトコルのために全マウスのPP細胞を調製するためのプロトコルを提供する。覚書の分離、特性評価、および免疫染色のために、我々のプロトコル電子PPの細胞は、これらの技術を5,6,9-11を引用し 、25年以上さかのぼる多くの参照があるという事実によって証明されるように、 それ自体は小説ではありません。むしろ、我々のプロトコルは、初めてPPを集める研究者のための合理化された（とビジュアル）メソッドを提供します。私たちが説明する技術を容易に習得し、容易に&gt; 90％の細胞の生存率を持つ細胞を大量に産出されています。凍結セクショニングプロトコルは、理想的には、免疫蛍光染色し、共焦点イメージングに適した再現性の高い連続切片が得られます。さらに、我々のプロトコルは、2つの他の最近のJoveの記事を補完します。最初は、福田らは、12のPP M細胞による病原細菌の取り込みを評価するためにライゲート回腸ループアッセイの使用について説明します。もう一つは、Geemらによる、マウスの腸粘膜からの樹状細胞やマクロファージの単離および特性を説明していますが、明示的に分析13からPPを除外。

<table border="1"><tbody><tr><td> アイテム </td><td> 会社 </td><td> 猫。 ＃ </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> OCTコンパウンド</td><td>組織 - Tek社</td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 7x7x5 mmベース金型</td><td> Fisherbrand </td><td> 22-363-552 </td><td></td></tr><tr><td> ImmEdgeペン</td><td>ベクトルラボ</td><td> H-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrostプラススラ​​イド</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 4951 </td><td></td></tr><tr><td>エッジ儀式ブレイド</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 4280L </td><td></td></tr><tr><td>抗マウスのCD11c-PE </td><td> eBioscience社</td><td> 17-0114-82</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD45R/B220-APC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553092 </td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD3-FITC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 561798 </td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD4-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553652 </td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD8-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553032 </td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD19-PercP </td><td> BioLegend </td><td> 115531 </td><td></td></tr><tr><td>フェノールレッドを含まないハンクス平衡塩溶液（HBSS） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 14175-079 </td><td></td></tr><tr><td> 70μmのセルストレーナー</td><td> BDファルコン</td><tD&gt; 352350 </td><td></td></tr><tr><td>脾臓解離ミディアム</td><td>電池技術を食い止める</td><td> 7915 </td><td></td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>インビトロジェン</td><td> 16210-072 </td><td></td></tr><tr><td> FCブロック</td><td> ATCC 2.4.G2 </td><td> HB-197 </td><td>細胞株から得られた2.4.G2 Supes </td></tr><tr><td>湾曲したシザー</td><td> FST </td><td> 14061から09 </td><td></td></tr><tr><td>低温保持装置</td><td>ライカ</td><td> 3050S </td><td></td></tr><tr><td> FACSソウルキャリバー</td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td>伯爵セルカウンター</td><td>インビトロジェン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td&gt; <td>リチャード·アラン</td><td> 7211 </td><td></td></tr><tr><td>エオシン</td><td>リチャード·アラン</td><td> 71304 </td><td></td></tr><tr><td>ホルマリン</td><td> Starplex科学</td><td> 3661 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表1本研究で使用した試薬および装置。 </td></tr></tbody></table>

マウスのパイエル板のリンパ球や樹状細胞を単離し、免疫染色

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

パイエル板（PPS）は腸管関連リンパ組織（GALT）の不可欠な構成要素であり、腸の免疫監視と恒常性に中心的な役割を果たします。腸管腔における粒子状抗原や微生物を連続濾胞関連上皮にPP M細胞によってサンプリング（FAE）と樹状細胞（DC）、マクロファージ、リンパ球の基盤となるネットワークに輸送される。この記事では、我々は、マウスのPPは、（i）単一細胞懸濁物に解離され、フローサイトメトリーにかけ、（ii）の凍結セクショニングと免疫染色のために準備されているプロトコルについて説明します。フローサイトメトリーのために、PPは機械的に解離され、次に上皮細胞と大きな破片の自由な単一の細胞懸濁液を生成するために70μmの膜を通して濾過した。 20から25 PPS（4匹から）以降では、この度は迅速かつ再現性のある方法は、&gt; 90％の細胞生存率&gt; 2.5×10 6細胞集団が得られます。凍結セクショニングのため、新鮮なLY孤立PPはcryomicrotomeを使用して、最適切断温度（OCT）培地、液体窒素で瞬間凍結し、切片に浸漬される。組織切片（5-12μm）は、アセトンやメタノールで固定し、空気乾燥され、その後免疫標識を行った。

合計PP細胞の単分散懸濁液を用いたフローサイトメトリー解析は良いと貧しい細胞調製の間に明確な区別を明らかにする。 80％以上の生存率との良好な細胞調製では、細胞の大半は高い前方散乱（FSC）、高細胞容積の指標、および低側方散乱（SSC）が、低い細胞粒度（ 図2A）のインジケータを示しています。この実験では、我々はまた、意図的に（代わりPHEMのPBSプラス1％FCSを含む細胞をインキュベートする、最後のステップで、室温（代わりに氷の上での）での分離工程中にPP細胞をインキュベートするとによって &quot;貧しい細胞調製&quot;を作成バッファ）。これらの貧しい細胞調製では、細胞の大部分は低FSCと高いSSCを発揮し、指示されたゲートR1（ 図2B）の外にあります。これらの細胞は、おそらくアポトーシスおよび/または壊死を受けています。 図3は、4ジまでのカクテルの使用方法を示していPPの単一細胞懸濁液に種々の細胞型の間で区別するfferentフルオロフォア標識モノクローナル抗体...

パイエル板の細胞の特定の亜集団（PPS）、腸管関連リンパ組織の主要な誘導部位の免疫学的機能を理解する上で関心が高まっている。ここでは、フローサイトメトリー解析と免疫染色のためのPPの凍結切片のための単一細胞調製物を調製するためのPPのパラレルプロトコルの概要を説明します。

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

この手順の全体的な目的は、2つの並行した実験的アプローチを使用して、ニューロンペイヤーパッチからリンパ球と樹状細胞を単離し、免疫染色することです。まず、マウス、小腸から新鮮な支払人のパッチを物品税します。次に、支払者のパッチを物理的に解離し、組織を採取してメッシュフィルターに通し、フローサイトメトリー分析用の単一細胞懸濁液を生成します。遠心分離によって細胞を回収し、96ウェルの丸い底板にアリコートを分配します。次に、細胞タイプ特異的な表面マーカーに対する抗体で細胞を標識します。すぐにフローサイトメトリー解析に進み、特定の細胞タイプを列挙します 並行して、支払人のパッチを分離し、組織サンプルを凍結します。OCTブロックのクライオ切片では、サンプルは細胞タイプ特異的な表面マーカーに対する抗体で標識され、共焦点走査型レーザー顕微鏡で可視化されます。これらの方法では、支払者のパッチ組織内の特定のコンパートメントにある B 細胞、T 細胞、および樹状細胞を定量化します。一般に、この方法に不慣れな人は、PIのパッチ組織が非常に壊れやすく、簡単に損傷する可能性があるため、苦労します。取り扱い中。分離したばかりの小腸を、湿ったペーパータオルまたはキムワイプのベッドの上に置きます。次に、組織の脱水を防ぐために、小腸を生理食塩水でやさしく濡らします。次に、腸の抗腸間膜側にある個々の支払者パッチを視覚的に識別します。通常、1匹のマウスには、十二指腸から回腸まで均等に分布する5〜10個の目に見える支払者パッチがあります。湾曲した外科用ハサミを使用すると、通常、個々の支払者のパッチを切除します。それらをコールドハンクのバランスソート溶液に入れ、組織を摂氏4度に維持して細胞の生存率を維持します。次に、支払人のパッチを5ミリリットルの脾臓解離培地に移し、摂氏37度で250RPMで15〜20分間振とうします。次に、シングルセル懸濁液を生成するために、サンプルを滅菌済みの70ミクロンナイロンメッシュセルストレーナーに置き、1ccシリンジのプランジャーのベースを使用して組織をメッシュに強制的に粉砕し、残りの細胞凝集体を除去します。細胞懸濁液を第2の70ミクロン細胞にデカントし、ストレーナーにして、細胞を15ミリリットルまたは50ミリリットルの円錐管に集めます。1ウェルあたり5個の細胞に10個を96ウェルの丸い底板ペレットセルに分注し、1000回で5分間遠心分離します。G.次に、プレートを穏やかに反転させることにより、上清をデカントします。次に、細胞をFCブロックバッファーに再懸濁し、氷上で15分間インキュベートします。次に、Fluor標識抗体を細胞懸濁液に所望の希釈率で直接添加し、100マイクロリットルのフローバッファーでアイスウォッシュ細胞上でインキュベートします。次に、細胞を400マイクロリットルの固定緩衝液に再懸濁して、フローサイトメトリーで細胞を分析し、凍結切片用の支払者パッチを分離します。単一の支払者のパッチを含む小腸の0.5センチメートルの横セグメントをカットします。PBSを含むシャーレに組織を移します。次に、OCTを含むベース型の内側に腸組織セグメントを垂直に置きます。型を液体窒素に浸し、組織を完全に凍結させます。鉗子を使用して、凍結したベース型を液体窒素から取り出します。OCTブロックの端が柔らかくなるまで、金型を室温で温めます。次に、OCTの凍結ブロックを金型から取り外します。型を裏返し、背面を軽く押して、ブロックをきれいな4 x 4センチメートルのアルミホイルに排出します。すぐに組織をホイルで包み、液体窒素またはドライアイスクライオ切片に保存されたラベル付きの標本バッグに、LI、CM 3、0、5、0 sクライオミクロトームまたは同等のものを使用して組織を置きます。クライオスタットのチャンバー温度を摂氏マイナス21度に設定します。理想的には、厚さ12〜14ミクロンの切片をカットします。切片をSupercross plusガラス顕微鏡スライドに集めます。標準的な低倍率光学顕微鏡を使用してサンプルを目視検査します。スライドをアセトンに2分間浸します。インキュベーションが長引くと、組織がスライドから剥がれる可能性があることに注意してください。サンプルをPBSTで3回洗浄します。次に、画像の疎水性ペンでセクションを囲みます。次に、サンプルをブロックバッファーでインキュベートし、組織切片を一次抗体溶液で重ねます。実際のティッシュ切片に触れずに、キムワイプまたはその他の吸収性組織を使用して、切片の周囲を乾燥させます。ピペットまたはスポイトを使用して、長時間の金封入用剤を切片に直接静かに滴下します。ガラスカバースリップを貼り、気泡を避け、余分な取り付けを吸い取ります。総支払人パッチセルのモノ分散懸濁液のミディアムファックス分析により、良好な細胞調製物における良好な細胞調製物と不良細胞調製物の明確な区別が明らかになります。80%以上の生存率を持つ大多数の細胞は、高い前方散乱を示し、高い細胞体積と低い細胞粒度と一致する低い側方散乱を示します。この実験では、不良集団では、大多数の細胞が低FSCおよび高SSCを示し、示された歩行Rの外側にあることを実証するために、不十分な細胞調製を意図的に準備しました。これらの細胞は、アポトーシスおよび/または壊死を受けている可能性が高い。ここでは、最大4つの異なるFluorのカクテル。4種類の標識モノクローナル抗体により、さまざまな細胞タイプを識別できます。支払者では、パッチシングルセル懸濁液を使用し、分化マーカーのクラスターで標識しました。CD19およびB220は、B細胞がゲート支払者の約60%を占めていることを明らかにしている。パッチ細胞集団特異的T細胞サブセットは、CD 3およびCD 4、またはCD 3およびCD 8、CD 4陽性およびCD 8陽性T細胞に対する抗体による二重標識により容易に列挙することができ、それぞれ全支払者パッチ細胞の約23%および9%を構成する。DCのサブセットは、CD 11 C陽性であり、CD 1 0 3陽性もこの方法で列挙できます。CD 11 Cの陽性dcsは、ゲート人口全体の約8%を占めており、これは支払者パッチあたり約10,000dcに相当します。CD 11 C陽性細胞の集団のうち、約4.7%がB two 20陽性で二重陽性であった。同様の結果は、支払者がパッチを当てた細胞をC 57ブラックシックスマウスから採取した場合にも得られる。細胞調製が不十分な場合、非常に誤解を招く結果につながる可能性がありますが、これは主に死死細胞または死にかけている細胞が抗体に非特異的に結合する傾向があるためです。典型的には、これらは、B 2 2 0陽性およびCD3陽性の二重陽性細胞、ならびにB 2 20陽性B細胞およびCD4陽性T細胞の二重陽性細胞の過剰発現をもたらす。マウスペイヤーパッチクライオ切片は、組織病理学的分析だけでなく、免疫標識にも適しています。in セクションのパワーは、h と e で染色すると細胞レベルでの分解能が向上しますが、支払者パッチの胚中心の明るいゾーンと暗いゾーンは、クライオ セクション セクションでより簡単に区切られます。この典型的な支払者パッチクライオセクションでは、抗CD3つの抗体、T細胞を標識します抗CD11C抗体。樹状細胞と抗B two 20抗体を強調表示します。B細胞を強調表示します その開発後。この技術は、腸関連リンパ組織内の樹状細胞などの特定の細胞タイプが腸内抗原や微生物病原体にどのように反応するかを、この分野の研究者が理解する道を開きました。この情報は、粘膜ワクチンの設計と開発に影響を与えています。

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Research

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Immunology and Infection

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マウスのパイエル板のリンパ球や樹状細胞を単離し、免疫染色

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