マウスのパイエル板のリンパ球や樹状細胞を単離し、免疫染色

この手順の全体的な目的は、2つの並行した実験的アプローチを使用して、ニューロンペイヤーパッチからリンパ球と樹状細胞を単離し、免疫染色することです。まず、マウス、小腸から新鮮な支払人のパッチを物品税します。次に、支払者のパッチを物理的に解離し、組織を採取してメッシュフィルターに通し、フローサイトメトリー分析用の単一細胞懸濁液を生成します。

遠心分離によって細胞を回収し、96ウェルの丸い底板にアリコートを分配します。次に、細胞タイプ特異的な表面マーカーに対する抗体で細胞を標識します。すぐにフローサイトメトリー解析に進み、特定の細胞タイプを列挙します 並行して、支払人のパッチを分離し、組織サンプルを凍結します。

OCTブロックのクライオ切片では、サンプルは細胞タイプ特異的な表面マーカーに対する抗体で標識され、共焦点走査型レーザー顕微鏡で可視化されます。これらの方法では、支払者のパッチ組織内の特定のコンパートメントにある B 細胞、T 細胞、および樹状細胞を定量化します。一般に、この方法に不慣れな人は、PIのパッチ組織が非常に壊れやすく、簡単に損傷する可能性があるため、苦労します。

取り扱い中。分離したばかりの小腸を、湿ったペーパータオルまたはキムワイプのベッドの上に置きます。次に、組織の脱水を防ぐために、小腸を生理食塩水でやさしく濡らします。

次に、腸の抗腸間膜側にある個々の支払者パッチを視覚的に識別します。通常、1匹のマウスには、十二指腸から回腸まで均等に分布する5〜10個の目に見える支払者パッチがあります。湾曲した外科用ハサミを使用すると、通常、個々の支払者のパッチを切除します。

それらをコールドハンクのバランスソート溶液に入れ、組織を摂氏4度に維持して細胞の生存率を維持します。次に、支払人のパッチを5ミリリットルの脾臓解離培地に移し、摂氏37度で250RPMで15〜20分間振とうします。次に、シングルセル懸濁液を生成するために、サンプルを滅菌済みの70ミクロンナイロンメッシュセルストレーナーに置き、1ccシリンジのプランジャーのベースを使用して組織をメッシュに強制的に粉砕し、残りの細胞凝集体を除去します。

細胞懸濁液を第2の70ミクロン細胞にデカントし、ストレーナーにして、細胞を15ミリリットルまたは50ミリリットルの円錐管に集めます。1ウェルあたり5個の細胞に10個を96ウェルの丸い底板ペレットセルに分注し、1000回で5分間遠心分離します。G.次に、プレートを穏やかに反転させることにより、上清をデカントします。

次に、細胞をFCブロックバッファーに再懸濁し、氷上で15分間インキュベートします。次に、Fluor標識抗体を細胞懸濁液に所望の希釈率で直接添加し、100マイクロリットルのフローバッファーでアイスウォッシュ細胞上でインキュベートします。次に、細胞を400マイクロリットルの固定緩衝液に再懸濁して、フローサイトメトリーで細胞を分析し、凍結切片用の支払者パッチを分離します。

単一の支払者のパッチを含む小腸の0.5センチメートルの横セグメントをカットします。PBSを含むシャーレに組織を移します。次に、OCTを含むベース型の内側に腸組織セグメントを垂直に置きます。

型を液体窒素に浸し、組織を完全に凍結させます。鉗子を使用して、凍結したベース型を液体窒素から取り出します。OCTブロックの端が柔らかくなるまで、金型を室温で温めます。

次に、OCTの凍結ブロックを金型から取り外します。型を裏返し、背面を軽く押して、ブロックをきれいな4 x 4センチメートルのアルミホイルに排出します。すぐに組織をホイルで包み、液体窒素またはドライアイスクライオ切片に保存されたラベル付きの標本バッグに、LI、CM 3、0、5、0 sクライオミクロトームまたは同等のものを使用して組織を置きます。

クライオスタットのチャンバー温度を摂氏マイナス21度に設定します。理想的には、厚さ12〜14ミクロンの切片をカットします。切片をSupercross plusガラス顕微鏡スライドに集めます。

標準的な低倍率光学顕微鏡を使用してサンプルを目視検査します。スライドをアセトンに2分間浸します。インキュベーションが長引くと、組織がスライドから剥がれる可能性があることに注意してください。

サンプルをPBSTで3回洗浄します。次に、画像の疎水性ペンでセクションを囲みます。次に、サンプルをブロックバッファーでインキュベートし、組織切片を一次抗体溶液で重ねます。

実際のティッシュ切片に触れずに、キムワイプまたはその他の吸収性組織を使用して、切片の周囲を乾燥させます。ピペットまたはスポイトを使用して、長時間の金封入用剤を切片に直接静かに滴下します。ガラスカバースリップを貼り、気泡を避け、余分な取り付けを吸い取ります。

総支払人パッチセルのモノ分散懸濁液のミディアムファックス分析により、良好な細胞調製物における良好な細胞調製物と不良細胞調製物の明確な区別が明らかになります。80%以上の生存率を持つ大多数の細胞は、高い前方散乱を示し、高い細胞体積と低い細胞粒度と一致する低い側方散乱を示します。この実験では、不良集団では、大多数の細胞が低FSCおよび高SSCを示し、示された歩行Rの外側にあることを実証するために、不十分な細胞調製を意図的に準備しました。

これらの細胞は、アポトーシスおよび/または壊死を受けている可能性が高い。ここでは、最大4つの異なるFluorのカクテル。4種類の標識モノクローナル抗体により、さまざまな細胞タイプを識別できます。

支払者では、パッチシングルセル懸濁液を使用し、分化マーカーのクラスターで標識しました。CD19およびB220は、B細胞がゲート支払者の約60%を占めていることを明らかにしている。パッチ細胞集団特異的T細胞サブセットは、CD 3およびCD 4、またはCD 3およびCD 8、CD 4陽性およびCD 8陽性T細胞に対する抗体による二重標識により容易に列挙することができ、それぞれ全支払者パッチ細胞の約23%および9%を構成する。

DCのサブセットは、CD 11 C陽性であり、CD 1 0 3陽性もこの方法で列挙できます。CD 11 Cの陽性dcsは、ゲート人口全体の約8%を占めており、これは支払者パッチあたり約10,000dcに相当します。CD 11 C陽性細胞の集団のうち、約4.7%がB two 20陽性で二重陽性であった。

同様の結果は、支払者がパッチを当てた細胞をC 57ブラックシックスマウスから採取した場合にも得られる。細胞調製が不十分な場合、非常に誤解を招く結果につながる可能性がありますが、これは主に死死細胞または死にかけている細胞が抗体に非特異的に結合する傾向があるためです。典型的には、これらは、B 2 2 0陽性およびCD3陽性の二重陽性細胞、ならびにB 2 20陽性B細胞およびCD4陽性T細胞の二重陽性細胞の過剰発現をもたらす。

マウスペイヤーパッチクライオ切片は、組織病理学的分析だけでなく、免疫標識にも適しています。in セクションのパワーは、h と e で染色すると細胞レベルでの分解能が向上しますが、支払者パッチの胚中心の明るいゾーンと暗いゾーンは、クライオ セクション セクションでより簡単に区切られます。この典型的な支払者パッチクライオセクションでは、抗CD3つの抗体、T細胞を標識します抗CD11C抗体。

樹状細胞と抗B two 20抗体を強調表示します。B細胞を強調表示します その開発後。この技術は、腸関連リンパ組織内の樹状細胞などの特定の細胞タイプが腸内抗原や微生物病原体にどのように反応するかを、この分野の研究者が理解する道を開きました。

この情報は、粘膜ワクチンの設計と開発に影響を与えています。