ナノ粒子トラッキング分析とハイスループットフローサイトメトリーによる高分子遺伝子デリバリーナノ粒子の評価
2013年3月1日
ナノ粒子トラッキング解析（NTA）とポリマー遺伝子送達ナノ粒子を評価するためのハイスループットフローサイトメトリーのためのプロトコルが記載されている。国税庁は、ナノ粒子の粒度分布およびプラスミド当たり粒子分布を特徴付けるために利用される。ハイスループットフローサイトメトリーは、遺伝子送達バイオマテリアルのライブラリの定量的なトランスフェクション効率の評価を可能にします。
この手順の全体的な目標は、非ウイルス性高分子ナノ粒子を用いた遺伝子導入実験を実施し、評価することです。これは、最初に遺伝子導入粒子で細胞をトランスセクトすることによって達成されます。次に、トランスフェクション効率を顕微鏡法およびハイスループットフローサイトメトリー分析によって評価します。
次に、ナノ粒子追跡分析装置を用いて、ナノ粒子サイズ分布、濃度、粒子当たりのプラスミドを決定します。最終的に、この方法により、ナノ粒子サイズの特性評価と、ナノ粒子を使用したトランスフェクション効果が可能になります。遺伝子導入に生分解性高分子ナノ粒子を使用する主な利点は、他の遺伝子導入方法よりも安全で効果的であることです。
動的光散乱などの既存の方法に対するナノ粒子追跡分析の主な利点は、ナノ粒子追跡分析が数、平均分布、粒子濃度を直接得ることです。この方法は、共発現研究に重要な粒子あたりのプラスミド数など、非ウイルス性遺伝子導入分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。以下のプロトコルは、ヒト網膜内皮細胞またはhreをモデル細胞として、ポリベータアミノエステルまたはPBA AEをモデルポリマーとして使用して実証されています。
なお、24時間前に使用した細胞やポリマーによっては、培養条件や溶媒の調整が必要な場合があります。トランスフェクション。マルチチャンネルピペットを使用して、平らに処理された透明な組織培養物にhreを播種します。マイクロリットルあたり25〜50細胞の濃度で下部の96ウェルプレート。
これにより、トランスフェクションの日に70〜80%coの流暢さが得られ、処理された透明な非組織培養を調製し、標識することができます。96ウェルプレートは、PBAとDNAを調製し希釈するためのマスタープレートとして機能します。同一のプレートを2枚ご用意いたします。
1つは毒性の評価用、もう1つはトランスフェクション効率の評価用です。ポリベータアミノエステルまたはPVAEポリマーとP-E-G-F-P-N 1D NAストック溶液を室温で追って使用してください。ホーニングしたら、12チャンネルピペットを使用して、各条件について25ミリモルの酢酸ナトリウム緩衝液に0.06ミリグラム/ミリリットルのDNAを50マイクロリットル含むウェルを調製します。
次に、同じプレートで、PBAEポリマーを酢酸ナトリウム緩衝液で1ミリグラム/ミリリットルに希釈します。次に、PBAEポリマーをさらに希釈して、ポリマー重量とDNA重量比が30マイクロリットルと60マイクロリットル、および50マイクロリットルの酢酸ナトリウム緩衝液に希釈します。ナノ粒子の形成には、12チャンネルピペットを使用して、50マイクロリットルの希釈PBAと50マイクロリットルの希釈血漿DNAをピペッティングで上下させて激しく混合します。
次に、混合物を室温で10分間インキュベートして、自己組織化させます。自己組織化後、12チャンネルピペットを使用して、この図に示すように、12チャンネルピペットを使用して、条件ごとに4つのウェルをトランスフェクションする培地を含む播種細胞の各ウェルに20マイクロリットルのナノ粒子溶液を滴下します。各プレートについて、ネガティブコントロールとポジティブコントロールのそれぞれについて少なくとも4つのウェルを予約します。
ネガティブコントロールは未処理の細胞とポジティブコントロールで構成され、リポ2000やFuge hdなどの市販の試薬でトランスフェクションされた細胞で構成されています。トランスフェクションされた細胞とプレートを摂氏37度で4時間インキュベートしますインキュベーション後、12チャンネルピペットを使用して細胞から培地を取り出し、新鮮なhreのウェルあたり100マイクロリットルと交換します。培地でさらに24〜48時間インキュベートします。
翌日、インキュベーターからプレートを1つ取り出します。蛍光顕微鏡法で細胞トランスフェクションと毒性を評価し、添付のテキストに記載されているように、細胞力価96水系Oneアッセイを使用して細胞毒性を定量します。48時間後、もう一方のプレートをインキュベーターから取り外します。
添付のテキストで説明されているように、蛍光、顕微鏡法、およびフローサイトメトリーによりトランスフェクション効率を評価します。ここで取得した毒性およびトランスフェクションのデータを使用して、将来の実験に使用するPBAの最適な濃度を決定してください。ナノサイトNS 500は、0.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブ内でナノサイトの流体システムを使用する前に、個々のナノ粒子の拡散を追跡することにより、ナノ粒子サンプルのサイズ分布に関する情報を提供できるナノ粒子追跡分析装置です。
PBAと血漿DNAを、このビデオの前のセクションで使用したのと同じ濃度で、以前と同様に分析用に調製します。自己組織化後、ナノ粒子溶液を新しい1.5ミリリットルチューブでPBSで100倍に希釈し、少なくとも500マイクロリットルの最終容量を得る。これにより、ナノ粒子追跡分析に適した範囲のナノ粒子濃度が得られます。
次に、サンプルをナノサイトにロードします。気泡を導入しないように注意してください 目視で確認して、画面に20〜100個の粒子があることを確認してください。ナノ粒子追跡の理想的な数は、約50個の粒子です。
多すぎるまたは少なすぎる場合は、NS 500をフラッシュし、希釈をPBSに調整して、サンプルを再ロードします。画面上のパーティクルの数が20〜100の場合、ビデオをキャプチャします。ビデオがキャプチャされたら、同じソフトウェアでビデオファイルを開いて処理段階に進みます。
次に、ファイルが開いたら、画面のゲインを上げます。画像パラメータの自動調整を選択するには、適切なボックスをクリックします。画面上の粒子がソフトウェアによって認識されると、赤い十字でマークされます。
すべての粒子がマークされたら、ソフトウェアのプロセスボタンをクリックしてビデオファイルを処理します。次に、粒子サイズ、分布サイズの平均、および粒子濃度が表示され、粒子数が正確であることが確認されます。同じサンプルを 2 x と 4 で希釈して、この手順を繰り返します。
PBS APREのForexは、このビデオに示すように、E-G-F-P-P-B-A-Eナノ粒子でトランスフェクションされました。トランスフェクション効率を視覚的に評価するために、蛍光顕微鏡イメージングを実施しました。これらの画像は、トランスフェクションされた細胞の蛍光明視野および結合画像を示しており、結合画像に見られるように、細胞の大部分はEGFPを発現し、正常な形態を維持しています。
トランスフェクション効率を定量化するために、この図に見られるように、生集団でのゲーティング後にフローサイトメトリーを実施しました。未切除の集団にはEGFP陽性細胞が含まれていなかった。しかし、処理された細胞の71.6%はEGFPナノサイトに陽性でした ナノ粒子追跡分析を使用して、ナノ粒子サイズの分布と濃度を決定しました。
この分析では、粒度分布がモノ分散であることが重要です。この情報を使用して、溶液中のプラスミドの濃度をNS 500によって決定された粒子濃度で割ることにより、粒子あたりのプラスミドの平均数を計算できます。粒子あたりのプラスミドの数は、粒子サイズ分布を反映した分布です。
サンプル内には、粒子あたりのプラスミドの値が平均よりも大きい大きな粒子と、粒子あたりのプラスミドの値が平均よりも低い小さな粒子があります。この手順を試みる際には、ncyを使用するためにナノ粒子を細胞に添加する前に、分解性ポリマーを水溶媒に長時間留まらせないように注意し、サイジングに適した希釈を調整することが重要です。このビデオを見れば、非ウイルス性遺伝子導入ポリマーを用いた接着細胞タイプのトランスフェクション方法、トランスフェクション効果の測定方法、粒子径分布の測定方法について十分に理解できるはずです。
人間の細胞を扱うことはバイオハザードであることを忘れないでください。この手順を実行するときは、常に個人用保護具を着用し、バイオセーフティキャビネットで作業してください。
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概要
この記事では、非ウイルス性ポリマーナノ粒子を用いた遺伝子送達を評価するためのプロトコルについて説明します。この方法では、遺伝子送達粒子で細胞をトランスフェクトし、顕微鏡および高スループットのフローサイトメトリーを通じてトランスフェクション効率を評価します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 遺伝子送達
- ナノ粒子技術
- 生体材料
背景
- 遺伝子送達の非ウイルス的方法は、その安全性と有効性のために探求されています。
- ポリマーナノ粒子は遺伝子転送の生分解性オプションを提供できます。
- ナノ粒子の特性評価は、その送達能力を理解する上で重要です。
- 高スループットの技術はトランスフェクション効率の評価を強化します。
研究の目的
- 遺伝子送達におけるポリマーナノ粒子の有効性を評価すること。
- ナノ粒子のサイズ分布とプラスミド含有量を特徴付けること。
- トランスフェクション効率を評価するための高度な技術を活用すること。
使用された方法
- ポリマー遺伝子送達ナノ粒子による細胞のトランスフェクション。
- トランスフェクションの視覚的評価のための顕微鏡。
- 定量的分析のための高スループットのフローサイトメトリー。
- サイズとプラスミド分布のナノ粒子トラッキング解析。
主な結果
- 生分解性ポリマーナノ粒子を使用した細胞の成功的なトランスフェクション。
- 達成されたナノ粒子のサイズ分布の特徴付け。
- 様々な生体材料にわたる定量的トランスフェクション効率の評価。
- 遺伝子送達にポリマーナノ粒子を使用する利点の実証。
結論
- ポリマーナノ粒子は遺伝子送達の有望なツールです。
- 説明された方法により、ナノ粒子の性能を包括的に評価できます。
- さらなる研究により、遺伝子転送技術の安全性と有効性が向上する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Robust evaluation of polymeric gene delivery nanoparticles using nanoparticle tracking analysis and high-throughput flow cytometry addresses critical challenges in non-viral gene therapy development. This workflow enables precise characterization of particle size, plasmid loading, and transfection efficacy, supporting predictive confidence in early discovery and target validation. The approach enhances portfolio decision-making by enabling scalable, quantitative assessment of novel delivery systems across diverse cell types.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of gene delivery hypotheses using defined nanoparticle formulations.
- Supports mechanistic de-risking by correlating particle characteristics with functional transfection outcomes.
- Facilitates functional target validation through reproducible, high-content transfection data.
- Improves predictive confidence for advancing delivery platforms in the pipeline.
Screening & Assay Development
- Prepares validated nanoparticle systems for high-throughput screening of transfection efficacy.
- Standardizes assay conditions using 96-well plate formats for reproducibility and scalability.
- Generates quantitative outputs on transfection and toxicity for reliable compound evaluation.
- Enables rapid comparison of polymeric carriers and cell types for platform optimization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns nanoparticle characterization with disease-relevant cell models for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by linking in vitro efficacy to preclinical model selection.
- Provides mechanistic insight into delivery efficiency and safety for preclinical de-risking.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through lead identification, supporting iterative optimization of gene delivery vehicles and their biological performance.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on nanoparticle-mediated gene transfer and pathway engagement.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative transfection and toxicity data for candidate prioritization.
- Analytics: Provides particle size, concentration, and plasmid loading metrics for cross-condition comparison.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical model selection when disease-relevant cells are used.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable workflow for evaluating diverse nanoparticle and cell type combinations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene delivery studies.
- Operational Value: Standardizes nanoparticle and transfection assays for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by enabling early de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of delivery platforms and gene therapy candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanoparticle formulation, cell culture, and flow cytometry analysis.
- Needs access to nanoparticle tracking instruments and high-throughput flow cytometry platforms.
- Demands cross-team standardization of assay protocols and data analysis workflows.
- Adaptable to various polymer chemistries and cell types with protocol adjustments.
- Careful handling of degradable polymers and human cells is necessary for data integrity and safety.
