ナノ粒子トラッキング分析とハイスループットフローサイトメトリーによる高分子遺伝子デリバリーナノ粒子の評価

この手順の全体的な目的は、非ウイルス性高分子ナノ粒子を用いた遺伝子導入実験を行い、その評価をすることです。まず、遺伝子導入粒子を用いて細胞にトランスフェクションを行います。その後、顕微鏡観察およびハイスループットフローサイトメトリー解析によって、トランスフェクション効率を評価します。

次に、ナノ粒子追跡解析装置を用いて、ナノ粒子の粒径分布、濃度、および粒子あたりのプラスミド量を決定します。最終的に、この手法によりナノ粒子のサイズ特性評価およびナノ粒子を用いたトランスフェクション効率の評価が可能になります。遺伝子導入に生分解性高分子ナノ粒子を使用する主な利点は、他の遺伝子導入法よりも安全で効果的である可能性があることです。

動的光散乱法などの既存の手法に対するナノ粒子トラッキング解析の主な利点は、ナノ粒子トラッキング解析によって粒子数平均分布と粒子濃度を直接的に得られることです。この手法は、共発現研究において重要な、粒子あたりのプラスミド数など、非ウイルス性遺伝子導入分野における主要な疑問への回答に役立ちます。以下のプロトコルでは、モデル細胞としてヒト網膜血管内皮細胞（hre）、モデルポリマーとしてポリβ-アミノエステル（PBA AEs）を用いて実演します。

使用する細胞やポリマーに応じて、トランスフェクションの24時間前に培養条件や溶媒を調整する必要があることに注意してください。マルチチャンネルピペットを使用して、1µLあたり25〜50細胞の濃度で、透明な組織培養処理済み平底96ウェルプレートに播種します。

これにより、トランスフェクション当日に70から80%のコンフルエンシーが得られます。PBAおよびDNAの調製と希釈に使用するマスタープレートとして、組織培養処理されていない透明な96ウェルプレートを用意し、ラベルを貼ります。同一のプレートを2枚用意します。

一方は毒性の評価用、もう一方はトランスフェクション効率の評価用です。poly beta amino ester（PVAE）ポリマーおよびP-E-G-F-P-N 1D NAストック溶液を室温で準備します。溶解後、12チャンネルピペットを使用して、各条件に対し、25 millimolar 酢酸ナトリウム緩衝液に溶解した0.06 milligrams per milliliter のDNAを50 microliters含むウェルを調製します。

次に同じプレート上で、PBAEポリマーを酢酸ナトリウム緩衝液で10 mg/mLに希釈します。その後、PBAEポリマーをさらに希釈し、ポリマー重量対DNA重量比が30および60となるように50 µLの酢酸ナトリウム緩衝液を加えます。ナノ粒子を形成させるため、12チャンネルピペットを使用して、希釈したPBA 50 µLと希釈したプラスミドDNA 50 µLを合わせ、ピペッティングにより激しく混合します。

次に、自己組織化させるため、混合液を室温で10分間インキュベートします。自己組織化後、12チャンネルピペットを用いて、培地を含む細胞播種済みの各ウェルに、ナノ粒子溶液を20 µLずつ滴下して添加します。この図に示すように、1条件につき4つのウェルにトランスフェクションを行います。プレートごとに、陰性対照および陽性対照としてそれぞれ少なくとも4つのウェルを確保してください。

陰性対照には未処理の細胞を用い、陽性対照にはLipo 2000やFuge HDなどの市販の試薬を用いてトランスフェクションした細胞を用います。トランスフェクションした細胞を含むプレートを37°Cで4時間インキュベートします。インキュベート後、12チャンネルピペットを使用して細胞から培地を除去し、1ウェルあたり100 µLの新鮮なHRE培地を加えて交換します。さらに24〜48時間インキュベートします。

翌日、インキュベーターからプレートを1枚取り出します。蛍光顕微鏡を用いて細胞のトランスフェクション効率と毒性を評価し、付属テキストに記載されているCellTiter-96® Aqueous 1(One)アッセイを用いて細胞毒性を定量します。48時間後、もう一方のプレートをインキュベーターから取り出します。

付属のテキストに記載されている通り、蛍光法、顕微鏡観察、およびフローサイトメトリーを用いてトランスフェクション効率を評価します。ここで得られた毒性とトランスフェクションのデータを用いて、今後の実験に使用するPBAの最適濃度を決定してください。nanoSight NS500は、個々のナノ粒子の拡散を追跡することでナノ粒子サンプルのサイズ分布に関する情報を提供できるナノ粒子追跡解析装置です。使用前に、0.5 mLマイクロ遠心チューブを用いてnanoSightの流路系のプライミングを行ってください。

本ビデオの前セクションで使用したものと同じ濃度で、分析用のPBAおよびプラズマDNAを準備します。自己組織化後、ナノ粒子溶液を新しい1.5 milliliterチューブ内でPBSを用いて100倍に希釈し、最終容量を500 microliters以上にします。これにより、ナノ粒子追跡分析に適した範囲のナノ粒子濃度が得られます。

次に、サンプルをナノサイトにロードします。気泡が混入しないように注意し、画面上に20〜100個の粒子があることを視覚的に確認してください。ナノ粒子トラッキングに最適な粒子数は、約50個です。

粒子数が多すぎるか少なすぎる場合は、NS 500をフラッシュし、PBSでの希釈度を調整してサンプルを再ロードしてください。画面上の粒子数が20から100の間であれば、ビデオをキャプチャします。ビデオのキャプチャが完了したら、同じソフトウェアでビデオファイルを開き、処理段階に進んでください。

ファイルを開いたら、スクリーンゲインを上げます。適切なボックスをクリックして、画像パラメータのオートアジャストを選択してください。ソフトウェアによって画面上の粒子が認識されると、赤い十字印が表示されます。

すべての粒子にマーキングが完了したら、ソフトウェアのprocessボタンをクリックしてビデオファイルを処理します。その後、粒径、粒径分布の平均値、および粒子濃度が表示されるので、粒子数のカウントが正確であることを確認してください。同じサンプルを2倍および4倍に希釈して、この手順を繰り返します。

本ビデオに示すように、PBS中のForexにE-G-F-P-P-B-A-Eナノ粒子をトランスフェクションしました。トランスフェクション効率を視覚的に評価するため、蛍光顕微鏡によるイメージングを行いました。これらの画像は、トランスフェクションした細胞の蛍光画像、明視野画像、およびマージ画像を示しています。マージ画像に見られるように、大部分の細胞がEGFPを発現しており、正常な形態を維持しています。

トランスフェクション効率を定量化するため、この図に示すように、生存細胞群をゲーティングした後にフローサイトメトリーを実施しました。未処理の細胞群にEGFP陽性細胞は含まれていませんでした。しかし、処理した細胞の71.6%がEGFP陽性でした。その後、ナノ粒子追跡解析（Nanoparticle tracking analysis）を用いて、ナノ粒子のサイズ分布と濃度を決定しました。

この分析では、粒子径分布が単分散であることが重要です。この情報を用いて、溶液中のプラスミド濃度をNS 500で測定した粒子濃度で割ることで、粒子あたりのプラスミドの平均数を算出できます。粒子あたりのプラスミド数は、粒子径分布を反映した分布となります。

サンプル中には、粒子あたりのプラスミド数が平均よりも多い大きな粒子と、平均よりも少ない小さな粒子が混在しています。この手順を行う際は、分解性ポリマーを水溶性溶媒中に長時間放置せず、細胞にナノ粒子を添加すること、またncyを使用する場合はサイジングに適した希釈調整を行うことが重要です。このビデオを視聴することで、非ウイルス性遺伝子導入ポリマーを用いて接着性細胞にトランスフェクションする方法に加え、トランスフェクション効率および粒子径分布を測定する方法について十分に理解できるはずです。

ヒト細胞の取り扱いはバイオハザードを伴うことに留意してください。本手順の実施中は、常に個人用保護具を着用し、バイオセーフティーキャビネット内で作業を行ってください。