Name: 体外における筋モータープールのために運動ニューロンの識別アメフラシカリフォルニ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: 学ぶ、Aplysia californicaを用いた運動ニューロンの細胞外同定法。筋モータープールにおける個別ニューロンの監視・制御技術を解説し、摂食運動パターン中の神経活動解析に応用する方法を紹介します。

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この研究は、NIHの助成金NS047073とNSFの助成DMS1010434によってサポートされていました。

<ol><li>McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+relationships+of+the+cerebral+giant+cells+with+motoneurones+in+the+feeding+system+of+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis.</a> J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).</li>
<li>Benjamin, P. R., Rose, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+generation+of+bursting+in+the+feeding+system+of+the+snail%2C+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Central generation of bursting in the feeding system of the snail, Lymnaea stagnalis.</a> J. Exp. Biol. 80, 93-118 (1979).</li>
<li>Peters, M., Altrup, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+organization+in+pharynx+of+Helix+pomatia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Motor organization in pharynx of Helix pomatia.</a> J. Neurophysiol. 52 (3), 389-409 (1984).</li>
<li>Church, P. J., Cohen, K. P., Scott, M. L., Kirk, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidergic+motoneurons+in+the+buccal+ganglia+of+Aplysia+californica%3A+immunocytochemical%2C+morphological%2C+and+physiological+characterizations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Peptidergic motoneurons in the buccal ganglia of Aplysia californica: immunocytochemical, morphological, and physiological characterizations.</a> J. Comp. Physiol. A. 168 (3), 323-336 (1991).</li>
<li>Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+extracellular+stimulation+of+individual+neurons+in+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural.+Eng%22%5BJournal%5D)">Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia.</a> J. Neural. Eng. 5 (3), 287-309 (2008).</li>
<li>Church, P. J., Lloyd, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+diverse+neuropeptide+cotransmitters+by+identified+motor+neurons+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia.</a> J. Neurosci. 11 (3), 618-625 (1991).</li>
<li>Church, P. J., Lloyd, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+multiple+identified+motor+neurons+recorded+intracellularly+during+evoked+feedinglike+motor+programs+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophys%22%5BJournal%5D)">Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia.</a> J. Neurophys. 72 (4), 1794-1809 (1994).</li>
<li>McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+In+Vitro+Preparation+for+Eliciting+and+Recording+Feeding+Motor+Programs+with+Physiological+Movements+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica.</a> J. Vis. Exp. (70), e4320(2012).</li>
<li>Cullins, M. J., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrode+fabrication+and+implantation+in+Aplysia+californica+for+multi-channel+neural+and+muscular+recordings+in+intact%2C+freely+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals.</a> J Vis. Exp. (40), e1791(2010).</li>
<li>Zhurov, Y., Weiss, K. R., Brezina, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+or+loose+coupling+between+components+of+the+feeding+neuromusculature+of+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Tight or loose coupling between components of the feeding neuromusculature of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 94 (1), 531-549 (2005).</li>
<li>Hurwitz, I., Goldstein, R. S., Susswein, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+pattern-initiation+and+motor+functions+in+the+B31+and+B32+neurons+of+the+buccal+ganglia+of+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of pattern-initiation and motor functions in the B31 and B32 neurons of the buccal ganglia of Aplysia californica.</a> J. Neurophysiol. 71 (4), 1514-1527 (1994).</li>
<li>Morton, D. W., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+timing+of+activity+in+motor+neurons+that+produce+radula+movements+distinguishes+ingestion+from+rejection+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia.</a> J. Comp. Physiol. A. 173 (5), 519-536 (1993).</li>
<li>Iles, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+synaptic+activation+of+the+fast+coxal+depressor+motoneurone+of+the+cockroach.+Periplaneta+americana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and synaptic activation of the fast coxal depressor motoneurone of the cockroach. Periplaneta americana.</a> J. Exp. Biol. 56 (3), 647-656 (1972).</li>
<li>Westerfield, M., McMurray, J. V., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identified+motoneurons+and+their+innervation+of+axial+muscles+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish.</a> J. Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).</li>
<li>Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+buccal+motor+programs+elicited+by+a+cholinergic+agonist+applied+to+the+cerebral+ganglion+of+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica.</a> J. Comp. Physiol. A. 179 (4), 509-524 (1996).</li>
<li>Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+patterns+of+the+B31%2FB32+pattern+initiators+innervating+the+I2+muscle+of+the+buccal+mass+during+normal+feeding+movements+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophys%22%5BJournal%5D)">Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica.</a> J. Neurophys. 75 (4), 1309-1326 (1996).</li>
<li>Morton, D. W., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+buccal+nerve+activity+that+distinguishes+ingestion+from+rejection+can+be+used+to+predict+behavioral+transitions+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia.</a> J. Comp. Physiol. A. 172 (1), 17-32 (1993).</li>
<li>Warman, E. N., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technique+for+chronic+single-unit+extracellular+recording+in+freely+behaving+animals+using+pipette+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A new technique for chronic single-unit extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes.</a> J. Neurosci. Methods. 57 (2), 161-169 (1995).</li>
<li>Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contingent-dependent+enhancement+of+rhythmic+motor+patterns%3A+an+in+vitro+analog+of+operant+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning.</a> J. Neurosci. 17 (21), 8093-8105 (1997).</li>
<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKandel%2C+ER+%22Behavioral+biology+of+Aplysia%22">Behavioral biology of Aplysia</a>. , Freeman. San Francisco. (1979).</li>
<li>Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+organization+of+the+buccal+system+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica.</a> J. Comp. Neurol. 312 (2), 207-222 (1991).</li>
<li>Rosen, S. C., Miller, M. W., Cropper, E. C., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outputs+of+radula+mechanoafferent+neurons+in+Aplysia+are+modulated+by+motor+neurons%2C+interneurons%2C+and+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Outputs of radula mechanoafferent neurons in Aplysia are modulated by motor neurons, interneurons, and sensory neurons.</a> J. Neurophysiol. 83 (3), 1621-1636 (2000).</li>
<li>Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+synaptic+connections+between+peptidergic+radula+mechanoafferent+neurons+and+neurons+in+the+feeding+system+of+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 83 (3), 1605-1620 (2000).</li>
<li>Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+an+identified+histaminergic+neuron%2C+and+its+possible+role+in+arousal+of+feeding+behavior+in+semi-intact+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia.</a> J. Neurosci. 6 (8), 2403-2415 (1986).</li>
<li>Rosen, S. C., Teyke, T., Miller, M. W., Weiss, K. R., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+cerebral-to-buccal+interneurons+implicated+in+the+control+of+motor+programs+associated+with+feeding+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of cerebral-to-buccal interneurons implicated in the control of motor programs associated with feeding in Aplysia.</a> J. Neurosci. 11 (11), 3630-3655 (1991).</li>
<li>Jing, J., Weiss, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+variants+of+a+motor+act+in+a+modular+and+hierarchical+motor+network%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network.</a> Curr. Biol. 15 (19), 1712-1721 (2005).</li>
<li>Azizi, F., Lu, H., Chiel, H. J., Mastrangelo, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+neurostimulation+using+pulse+code+modulation+%28PCM%29+microfluidic+chips%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical neurostimulation using pulse code modulation (PCM) microfluidic chips.</a> J. Neurosci. Methods. 192 (2), 193-198 (2010).</li>
<li>Zhurov, Y., Proekt, A., Weiss, K. R., Brezina, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+of+internal+state+are+expressed+in+coherent+shifts+of+neuromuscular+activity+in+Aplysia+feeding+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Changes of internal state are expressed in coherent shifts of neuromuscular activity in Aplysia feeding behavior.</a> J. Neurosci. 25 (5), 1268-1280 (2005).</li>
<li>Baker, B. J., Kosmidis, E. K., Vucinic, D., Falk, C. X., Cohen, L. B., Djurisic, M., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+brain+activity+with+voltage-+and+calcium-sensitive+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Imaging brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 25 (2), 245-282 (2005).</li>
<li>Fejtl, M., Stett, A., Nisch, W., Boven, K. -H., Möller, A. On Micro-Electrode Array Revival. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFejtl%2C+M+%22Advances+in+Network+Electrophysiology+Using+Multi-Electrode+Arrays%22">Advances in Network Electrophysiology Using Multi-Electrode Arrays</a>. Baudry, M., Taketani, M. , Springer Press. New York. 24-37 (2006).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もない。

そのような軟体動物（例えば、Lymnaea、らせん 、とアメフラシ ）、モータープールの分析などの大型同定ニューロンを持つ動物では、通常、細胞内記録1,2,3,4を使用して行われます。このプロトコルでは、我々は独自に外技術を使用してモータープールのための運動ニューロンを同定する方法を説明します。我々は、このプロセスの実例として力の測定値を使用していました。一つは、筋肉の神経支配を測定する筋電図を使用することができます。簡単に言えば、これを行うには、プロトコルは、EMGのレコーディングにI1/I3筋肉の異なる領域にフック電極を取り付けるように変更する必要があります。 細胞外の技術は既に上述してきたそのうちのいくつかは細胞内の技術上のいくつかの利点があります。まず、細胞外の手法は、実験のために神経を準備するより少ない時間と労力を必要とし、ニューロンへのダメージが少なくなります。通常、それはBUCを準備するために20〜30分かかります外実験や細胞内の実験のために頬のマスに接続されている頬神経を準備するには、約...

<table border="1"><tbody><tr><td> 名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> S671 </td><td>生物学、認定</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> P217 </td><td>認定のACS </td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>アクロスオーガニック</td><td> 19753 </td><td> 99パーセント</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム·7水和物</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> M63 </td><td>認定のACS </td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>フィッシャーScientifc </td><td> C79 </td><td>認定のACS </td></tr><tr><td>グルコース（ブドウ糖） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G7528 </td><td> BioXtra </td></tr><tr><td> MOPSはbuffeR </td><td>アクロスオーガニック</td><td> 17263 </td><td> 99パーセント</td></tr><tr><td>カルバコール</td><td>アクロスオーガニック</td><td> 10824 </td><td> 99パーセント</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> SS255 </td><td>認定された</td></tr><tr><td>塩酸</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> SA49 </td><td>認定された</td></tr><tr><td>単銃身のガラスキャピラリー</td><td> AMシステム</td><td> 6150 </td><td></td></tr><tr><td>フレイミング·ブラウンマイクロピペットプラーモデルP-80/PC </td><td>サターインスツルメンツ</td><td></td><td>フィラメント使用：FT345B </td></tr><tr><td>エナメルコーティングされたステンレス鋼線</td><td>カリフォルニアファインワイヤー</td><td></td><td> 0.001D、コーティング時間</td></tr><tr><td>家庭用シリコーン二グルー</td><td> GE </td><td></td><td></td></tr><tr><td>デュロクイックジェル瞬間接着剤</td&gt; <td>ヘンケル社。 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AMのシステムモデル1700アンプ</td><td> AMシステム</td><td></td><td>フィルタ設定：I2神経/筋肉のための10から500 Hzであり、他のすべての神経のための300から500 Hzの</td></tr><tr><td> Pulsemasterマルチチャンネルミュレータ</td><td>ワールド·精密機器</td><td> A300 </td><td></td></tr><tr><td>刺激アイソレータ</td><td>ワールド·精密機器</td><td> A360 </td><td></td></tr><tr><td> AxoGraph X </td><td> AxoGraph科学</td><td></td><td>録音用のソフトウェア</td></tr><tr><td>金色のコネクタピン</td><td>丸型</td><td> SA3148 / 1 </td><td></td></tr><tr><td>ゴールドコネクタソケット</td><td>丸型</td><td> SA3149 / 1 </td><td></td></tr><tr><td>シルガード184シリコーンエラストマー</td><td>ダウコーニング</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 100×15ミリメートルCrystalizingディッシュ</td><td>パイレックス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高真空用グリース</td><td>ダウコーニング</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 21-375D </td><td></td></tr><tr><td> Minutienピン</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 26002から10 </td><td></td></tr><tr><td>モデリングクレイ</td><td>サージェントアート</td><td> 22から4400 </td><td></td></tr><tr><td>エアーポンプをささやく</td><td>テトラ</td><td> 77849 </td><td></td></tr><tr><td>水族館チューブ</td><td> EHEIM </td><td> 7783 </td><td> 12月16日mm </td></tr><tr><td>エリートAirstone </td><td>ハーゲン</td><td> A962 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas春はさみ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 15000から08 </td><td></td></tr><tr><td>デュモン5位ファイン鉗子</td><td>ファイン医学工学総合研究電子ツール</td><td> 11254から20 </td><td></td></tr><tr><td>キムワイプ</td><td>キンバリークラーク</td><td> 34155 </td><td></td></tr></tbody></table>

体外における筋モータープールのために運動ニューロンの識別<em&gt;アメフラシカリフォルニ</em

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

大同定ニューロン（ 例えば軟体動物）、モータープールの分析と動物では細胞内のテクニックに1,2,3,4を使用して行われます。最近、我々は細胞外にアメフラシカリフォルニ 5で個々の神経細胞を刺激し、記録する技術を開発しました。我々は今、一意に識別してモータープール内の運動ニューロンを特徴づけるためにこの手法を使用するためのプロトコルを記述します。 この細胞外手法には利点があります。まず、細胞外電極は刺激し、記録ニューロンをシース5を通っているので、削除する必要はありませんすることができます。このように、神経細胞は、細胞内のものに比べて、細胞外の実験でより健康になります。ガングリオンは、シースのピンニング適切により回転される場合、第二に、細胞外電極は、より容易かつ効率的に同じ準備で複数のニューロンを識別できるようになり神経節、両側の神経細胞にアクセスすることができます。第三に、extracelluLAR電極が細胞に侵入する必要はありません、したがって、容易にそれらにあまりダメージを与え、ニューロン間で前後に移動することができます。一つはわずか数分持続することがある運動パターンを繰り返す中に複数のニューロンを記録しようとするときに特に便利です。第四に、細胞外電極は、筋肉の動きの間に細胞内のものよりもはるかに柔軟です。細胞内電極引き出し、筋肉の収縮時に神経細胞を損傷することがあります。細胞外電極は優しくニューロン上記シースに押し付けているのでこれとは対照的に、彼らは通常、筋肉の収縮時には、同じニューロン上に滞在し、したがってよりそのまま調剤で使用することができます。 ソーマのサイズや位置、軸索投射し、筋肉の神経支配4：一意細胞外電極を使用してモータープール（特に、 アメフラシでI1/I3筋肉）の運動ニューロンを同定するためには、基準のような細胞内の測定を必要としない機能を使用することができます、6,7。手法を説明するために使用される特定のモータープールのために、我々は軸索突起物を測定するために頬神経から2と3を記録し、個々の運動ニューロンのための筋の神経支配のパターンを決定するI1/I3筋肉の収縮力を測定した。 我々は、迅速な同定のために簡略化された診断法を作成し、運動パターンの間にそれらのタイミングを特徴付ける、筋の神経支配を用いた第1の識別運動神経の完全なプロセスを示しています。簡略化され、より迅速な診断方法は、一時停止頬マス準備8 または in vivo で 9 例より完全な準備のために優れています。このプロセスは、2,3,13,14 アメフラシや他の動物系で10,11,12他のモータープールに適用することができます。

図4および図5は、2 I1/I3運動ニューロンを識別するために使用される代表的な結果を示している。 図4は egestive様およびingestive状のパターン（ 図4C、4D）の間に大規模な運動ニューロン、B3のソーマの記録を示しています。 B3ソーマ記録の特異性はパターンの間に維持されたことソーマ·チャネル上の1対1対応するスパイクと同側のBN2チャネル（ 図4E）ショー。 B3は、パターンの途中から後半トラクション段階に発光します。 図4およびその他の結果（図示せず）から、我々は、B3のBN2ユニットは常に最大のBN2ユニットであることがわかった。したがって、それはまた、BN2録音から直接検出することができます。 図5は egestive様およびingestive状のパターン（ 図5C、5D）の間に、B...

大同定ニューロン（と動物では<em&gt;例えば</em&gt;軟体動物）、モータープールの分析は、細胞内の技術を使用して行われ<sup&gt; 1,2,3,4</sup&gt;。最近、我々は細胞外で個々の神経細胞を刺激し、記録する技術を開発<em&gt;アメフラシカリフォルニ</em<sup&gt; 5</sup&gt;。我々は今、一意に識別してモータープール内の運動ニューロンを特徴づけるためにこの手法を使用するためのプロトコルを記述します。

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

本手順の全体的な目的は、運動プールを構成する個々の運動ニューロンを細胞外から特定し、運動パターン中のそれらをモニタリングおよび制御することである。まず、主要な神経にフック電極を装着した準備済みのプレギアの口蓋塊を専用の記録皿に配置し、次いで口蓋神経節および脳神経節を細胞外刺激および記録に備えて準備することでこれを達成する。第二のステップでは、口蓋塊の主要な神経と筋肉に吸引電極を装着し、標的筋肉に力変換器を取り付け、口蓋神経節の鞘の上に細胞外ガラス電極を配置する。次に、細胞外ガラス電極を用いて標的の運動ニューロンを特定します。最終ステップでは、筋収縮力を同時に測定しながら、標的の運動ニューロンを細胞外から刺激し、記録します。最終的に、この細胞外刺激および記録技術を用いて、個々の運動ニューロンの同定と、摂食のような異なる運動パターンにおけるそれらの神経活動を明らかにします。ニューロンの細胞内同定などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、細胞外ガラス電極を用いることで、筋肉の動作中に同一の標本内で複数の運動ニューロンを同定し、モニタリングできることです。本手順のデモンストレーションを補助するのは、私の研究室のもう一人の大学院生であるJeff McManusです。吸引電極を準備するこの手順では、まずポリエチレンチューブを約10センチメートルの長さに切断します。チューブの両端を持って、ブンゼンバーナーで発生させた炎に非常に近づけ、チューブが柔らかくなるまで回転させます。その後、チューブを火から遠ざけながら慎重に引き伸ばします。引き伸ばされることでチューブの中央部分が細長く伸びます。次に、チューブを半分に切断して2つのセクション電極を作成します。これらの吸引電極は、通常は切断された神経や筋肉の末端に適用されますが、場合によっては通過神経（passant）に適用されることもあります。顕微鏡下でフック電極を取り付けた後、口神経1および食道神経を口塊への付着点において両側とも切断します。次に、I 2筋の妨げにならないよう、脳神経節を前方に引いて移動させます。その後、 ular sac上のI 2筋を切開します。切開を外側および前方へ延長し、I2筋肉のフラップを前方へ牽引して尺骨神経を露出させます。2本のRN分枝を切断し、吸引電極を装着するのに十分な長さがあることを確認してください。頬神経節の周囲を大きく円を描くように、I2の切断を継続します。頬神経節およびそれに付着しているI two筋の部分が口塊から完全に分離されるまで、BN twoおよびBN threeを切断しないように注意します。その後、フック電極の装着部位よりも先の、口塊への付着点において、両側のBN threeを切断します。次に、記録皿の後方チャンバーと中央プラットフォームをつなぐ切り込み部分に、真空グリースを薄く塗布します。続いて、口咽頭塊を配置する前室のガラス底に、クイックゲル速乾性シアノアクリレート系接着剤を薄く塗布します。脳神経節、口咽頭神経節、および口咽頭塊を記録皿に慎重に移します。この際、フック電極が強く引っ張られて神経を損傷させないように注意してください。次に、頬部塊（buccal mass）を記録皿のフロントチャンバーにある接着剤の上に注意深く配置します。腹側が皿の底に接着されるようにし、神経節と電極が接着剤に触れないようにしてください。その後、皿にplegia生理食塩水を加え、接着剤を硬化させます。次に、顕微鏡下で脳神経節の鞘をつかみ、ピンセットで後方チャンバーへと引き込み、CBCがノッチを通過していることを確認します。その後、無傷のCBCへの損傷を避けるため、CBC以外の脳神経節の神経をピンで固定します。CBCに真空グリースをさらに塗布し、真空グリースの上面がガード壁よりもわずかに高くなるようにして、チャンバー間に漏れが生じないようにします。次に、神経節が完全に浸るまで、ディッシュの両方のチャンバーに生理食塩水をさらに加えます。口神経節を固定するために、まずBN 3の両端を中間プラットフォームのシガーベースにピンで固定します。BNの3本の神経をフック電極を用いて記録するため、ピンはフック電極の装着点よりも遠位に配置し、BNの末端と端を固定します。次に、フック状に90度に曲げた2本のピンを使用して、CBCに損傷を与えないようにCBCを伸展させ、固定します。続いて、後腔と口神経節の間にあるRN分枝をピンで固定します。次に、I2神経を露出させるために、I2筋肉を口神経節の上に移動させます。ピンセットでI2筋肉をつかんで口神経節の上に引き寄せ、I2神経を損傷しないよう、I2筋肉の2隅をピンで固定します。その後、I2筋肉を支配する2つの分枝に分かれる点よりも遠位でI2神経を切断し、I2筋肉の残りの部分を切り取り、I2神経を折り返して2つのRN分枝の間にピンで固定します。続いて、神経が緩すぎる場合はピンの位置を調整して伸展させて張力を加え、逆に神経が張りすぎている場合は張力を緩めるように調整します。口神経節をさらに固定するために、神経間の鞘にピンをさらに追加します。口神経節は腹側を上にして配置されているため、口神経節を回転させます。目的のニューロンが吻側にある場合は、このように操作します。2つの口神経節の一方を回転させるには、精密切断鉗子を用いて、口神経節付近にあるCBCの過剰な鞘を掴みます。次に、CBCとBM3の間にCBCの過剰な鞘をピンで固定し、さらに口神経節の鞘の前方チャンバーに近い側にピンを追加して、口神経節の動きを最小限に抑えます。口神経節を覆っている鞘をトリミングします。精細鑷子を用いて、後方チャンバー側のシースを掴みます。次に、細胞体を露出させないように注意しながら、精細剪刀で余分なシースを切り取り、除去します。損傷を最小限に抑えるため、細胞体が視認できる必要最低限のシースのみを除去してください。口神経節の鞘をトリミングした後、iTune神経とRNを口神経節の上に引き出し、口神経節と前室の間でピンで固定します。電極内をplegia salineで満たすために口神経節をさらに回転させるには、シリンジに取り付けられた15〜20 cmのポリエチレンチューブの自由端をガラス電極の端に接続します。次に、シリンジのプランジャーを引いて、電極内をplegia salineで満たします。充填済みの細胞外ガラス電極を、マニピュレーター上のホルダーの切り欠きに設置します。次に、マニピュレーターを使用して、電極先端を口神経節を含むプレギア生理食塩水中に配置します。その後、記録用電線として電極に銀・塩化銀線を挿入し、アンプに接続されたBNCケーブルに接続します。次に、別の電線をBNCケーブルに取り付けて参照電線とし、電線のもう一方の端をプレジア生理食塩水に入れます。このステップで、神経の直径に合わせて吸引電極チップの狭い端をトリミングします。密接な吸引を確実にするため、電極チップの内径は、神経の直径と同等か、あるいはわずかに小さくする必要があります。iTune神経とRNは互いに非常に近いため、スペースを節約するために、それらの電極を同じマニピュレーターに配置します。2つの電極を回転させ、先端同士が近くなるように調整します。その後、一方をiTune神経の記録用、もう一方をRNの記録用に選択します。電極チップをplegia生理食塩水の中に浸します。シリンジに取り付けたポリエチレンチューブの自由端を吸引電極に接続します。次に、シリンジを使用して電極内をaple生理食塩水で満たします。続いて、電極の先端を I two 神経の末端付近に移動させ、シリンジを用いて神経を電極内に吸引します。電極内にある神経の長さは約 0.5 〜 1 mm にしてください。密閉性を確保するため、筋肉に力変換器を取り付ける電極についても、同様に吸引を繰り返します。各縫合糸の曲針を曲げ、縫合糸を力計（フォーストランスデューサー）に結びつけます。ピンセットで筋肉を少量そっと掴んで持ち上げ、針を I one I three 筋の後部に、針の曲げ点まで挿入します。次に、別の力計を顎にある筋肉の前部に取り付けます。次に、縫合糸がピンと張るまでフォーストランスデューサーを持ち上げますが、確認のために伸ばしすぎないようにしてください。縫合糸に緩みがある状態でのフォーストランスデューサーの測定値を確認します。その後、測定値がこのベースラインレベルをわずかに上回るまで、トランスデューサーを持ち上げます。候補となるニューロンを特定するには、マニピュレーターを使用して、細胞体の中央上にある鞘の上に細胞外ガラス電極の先端をそっと押し当てます。ここは刺激および細胞選択性の記録に最適な位置です。この図は、B threeへの細胞外刺激、B three細胞体からの記録、および対応する神経および筋肉領域からの記録を上から順に示しています。各チャンネルは、B three細胞体、対側のBN two、同側のBN two、同側のBN three、I one I three筋前部の収縮力、およびI one I three筋後部の収縮力の記録です。青色のボックスは、I1-I3筋の前方および後方領域における力の持続時間を強調しています。B3は同側のBN2にのみ投射します。ここでは、EST様運動パターンおよび摂食様運動パターンにおけるB3細胞体と神経からの細胞外記録を示します。青色のボックスは、パターンの前突相と後退相を示しています。B3 SOMAチャネルの赤色のバーは、B3細胞体から記録された活動電位を示しており、IB2チャネルの赤色のバーは、同側のBN2においてB3が発火している対応するタイミングを示しています。これは摂食運動パターン中のものです。B3のBN2ユニットは、すべてのユニットの中で最大であることに注意してください。したがって、SOMA記録を行わなくても、BN 2の記録から直接BN 2ユニットのB 3を検出することができます。この図は、B 43の細胞外刺激と、そのsoma、および対応する神経と筋肉領域からの記録を上から下に向かって示しています。各チャネルは、B 43 soma、対側BN 2、同側BN 2、同側BN 3、I 1 I 3筋前部の収縮力、およびI 1 I 3筋後部の収縮力の記録です。青い枠線は、B 43活動中のI 1 I 3筋肉の力測定値を示しています。B 43の活動は、同側のBN 2にのみ投射されます。ここでは、摂取様運動パターンにおけるB 43細胞体および神経からの細胞外記録と、摂取様運動パターンについて示します。青色のボックスはパターンのプロトラクション（前伸）相とリトラクション（後退）相を示しています。B 43 SOMAチャネル内の赤いバーはB 43の細胞体から記録された活動電位を強調しており、IBN twoチャネル内の赤いバーは、同側のBN twoにおいてB 43が発火している corresponding なタイミングを示しています。これらのパターンにおいて、B 43のBN twoユニットは小さく、サマー記録（summer recordings）なしでは検出が非常に困難であることに注意してください。しかし、これらはBN twoの運動プログラムの終わりに一貫して発火するため、それが別の同定手段となります。このビデオを視聴することで、複数の個別の現代的なニューロンを細胞外で同定する方法について、十分に理解することができます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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