競争力のあるマウス骨髄移植モデルにおけるドナー細胞の生着を​​決定するために、定量的リアルタイムPCRを用いて

この手順の全体的な目的は、競合的マウス骨髄移植モデルにおけるドナー細胞の生着率を定量化するためのPCRベースの手法を実施することです。これは、まずオスドナー細胞を用いてメスのレシピエントマウスに骨髄移植を行うことで達成されます。次に、異なる時点でレシピエントマウスから末梢血を採取し、ゲノムDNAを単離します。そして、標準曲線の作成のためにサンプルを調製します。

最後に、標準試料および試験試料を用いてリアルタイムPCRを実施します。最終的に、男性DNAと女性DNAの比率が既知である標準曲線に基づいて算出することで、女性レシピエントマウスにおける男性ドナー由来細胞の生着を示す結果を得ることができます。フローサイトメトリーを用いた手法などの既存の方法に対する本手法の利点は、感度が高く、経済的であり、試料を長期間保存できることです。

最も重要な点として、本手法は文字列に依存せず、ドナー細胞とレシピエント細胞を区別するための明確に定義された細胞表面マーカーなど、マウスのあらゆるゲノム背景に使用することが可能です。ラミナーフローフード内で、FVB njの雄ドナーマウスおよび雌マウスを安楽死させた後、小型の鋏とピンセットを用いて大腿骨と脛骨を切り出し、5%熱不活化FBSを含む氷冷RPMI 1640を6 mL入れた60 mm組織培養皿に置きます。キムワイプを使用して筋肉などの組織を取り除き、皿の中で各骨幹の両端を切り取ります。次に、骨の端を、5%熱不活化FBS含有RPMI 1640を満たした3 ccシリンジに装着した23ゲージ針に接続し、骨髄を洗い出します。

同じ針を用いて、繰り返し吸引することで骨髄組織を分散させます。細胞懸濁液を15 mL遠心チューブに移し、400 Gで5分間遠心分離します。上清を除去した後、細胞を1 mLの室温の赤血球溶血バッファーに再懸濁し、室温で5分間インキュベートします。その後、5%熱不活化FBSを含むRPMI 1640を5～10 mL加え、細胞をセルストレーナーに通して、ろ過液を新しいチューブに回収します。400 Gで5分間遠心分離し、上清を除去した後、ペレットに赤色が見えないことを確認してください。これは赤血球が完全に除去されたことを示します。5%熱不活化FBSを含むRPMI 1640を10 mL加えて再懸濁し、穏やかにボルテックスした後、少量のアリコートを血球計数器に取り、細胞数をカウントします。

骨髄移植に向けて、ドナー細胞と競合側の雌細胞を5:2の比率で混合するために必要な細胞量を算出します。注入用の細胞調製の最終ステップとして、移植の4〜6時間前に、ドナー細胞と競合細胞を混合し、細胞をペレット化してPBSで洗浄した後、ドナー細胞が5 × 10⁶/mL、競合細胞が2 × 10⁶/mLの最終濃度になるようPBSで再懸濁します。雌のレシピエントマウスに、セシウム137ガンマ線を用いて11 Gyの単回照射を行います。

放射線を照射した雌マウスをマウス拘束具に固定し、ドナー細胞とコンペティター細胞の混合液を尾静脈から総量 0.1 milliliter で注入します。このとき、各マウスにドナー細胞 5 × 10⁵ 個およびコンペティター骨髄細胞 2 × 10⁵ 個が投与されるようにします。その後、マウスを麻酔し、後眼窩採取法により約 50 microliters の血液を EDTA コーティングチューブに回収します。同様に、月齢を合わせた雄および雌マウスからもサンプルを回収します。

次に、被験マウスおよび対照マウスからゲノムDNAを単離します。標準曲線を作成するため、各血液サンプルに室温のRBC溶血バッファーを約200 µL加え、5分間インキュベートします。PBSを1 mL加え、遠心分離して溶血したRBCの大部分を除去します。

次に、溶出バッファーを37 °Cに予熱し、血液DNA抽出キットを用いてDNAを単離します。収量を高めるため、各サンプルのDNA濃度を測定します。OD 260/280比が1.8から2.0の範囲にあるサンプルを、以降の解析に使用します。

標準曲線を作成するために、オスおよびメスのDNAを4 ng/µLの濃度に希釈し、以下のガイドラインに従ってDNA混合液を調製します。Cyber Green Super Mix試薬、ここに示すプライマー、およびゲノムDNAを混合し、PCR反応プレートをセットアップします。各20 µLの反応系には、各プライマーを400 nM、血液細胞ゲノムDNAを5 µL含ませ、3連で実施します。

テキストプロトコルに記載された条件に従ってPCRを実施し、サイクル閾値（CT値）を算出します。delta CT × (CT^ZY1 - CT^BCL2) または 2^-delta CT を用いて ZY1 の発現レベルを計算します。混合物中の既知の男性DNAパーセンテージに対し、3反復の 2^delta CT 値の平均値をプロットして標準曲線を作成し、線形回帰直線を求めます。以下は、男性DNAのパーセンテージに対して 2^delta CT の平均値をプロットした標準曲線の例です。

このプロットには、それぞれ 78.5 °C および 88.5 °C に位置する BCL2 および ZFY1 アンプリコンの固有の融解温度が含まれています。BCL2 は、各 PCR 反応にロードされた DNA の総量を正規化するためのリファレンス遺伝子として使用されます。各標準サンプルの BCL2 増幅曲線は、男性 DNA 濃度に関わらず互いに一致しており、ロードされた DNA 量が等しいことを示しています。

しかし、サンプル中の雄由来DNA量が増えるにつれて、ZFYの増幅曲線は左側にシフトしました。PIM TKOマウスから得られた造血幹細胞は、致死量照射マウスを再構成させる能力に欠陥があり、予想通り、PIM TKO細胞を移植したレシピエントマウスは、野生型細胞を移植したマウスと比較して、雄由来細胞の割合が大幅に低い結果となりました。本手法を検証するため、野生型またはPIMトリプルノックアウト（TKO）マウスの骨髄細胞を雌のレシピエントマウスに移植し、移植後の異なる時点（6週目の末梢血および16週目の骨髄サンプル）において、雄由来ドナー細胞の生着率を解析しました。このビデオで詳細を確認してください。

競合的な海洋生物骨髄移植モデルにおけるドナー細胞の生着率を定量化するための、PCRベースの手法の使用方法を十分に理解しておく必要があります。