培養細胞からの染色体の準備

この手順の全体的な目標は、GBバンディングおよび分子細胞遺伝学的検査のために染色体を採取し、準備することです。まず、細胞を対数相に培養します。次に、smid、低張薬、固定剤で染色体を採取します。

細胞懸濁液をスライドにドロップします。1枚のスライドを染色します。染色体調製のモニターとして、残りのスライドのGBバンディングまたは分子技術に進みます。

GBバンディングの最終ステップとして、光学顕微鏡と核型分析によって染色体を分析します。最終的には、染色体と核は核型分析や魚のような表現ができるようになります。私がこの方法を発表するアイデアを最初に思いついたのは、他の研究者から、さまざまな生物のさまざまな種類の細胞における染色体不安定性の検出と、その後の分子細胞遺伝学的検査の支援を求める高い要望があったためです。

この技術は、診断である染色体再配列の視覚化を可能にするため、がんを含む多くの先天性遺伝性疾患の診断と最終的な予後に不可欠です。これらの障害については、この方法は、さまざまな種類のヒト細胞に見られる染色体再配列についての洞察を提供することができます。また、Resus Macaラットやマウスなどの他の生物の細胞にも適用できます。

200万個の接着細胞を80%の密度で流暢に、1ミリリットルあたり10マイクログラムの10マイクロリットルを追加します。細胞のミリリットルあたりのcol。細胞を摂氏37度で5%CO2インキュベーターで45分間インキュベー

次に、滅菌ピペットを使用して、培地を培養物から15ミリリットルの円錐管に移し、後で使用するために予約します 細胞を洗浄するには、フラスコに2ミリリットルのHBSSを加え、渦巻き、緩衝液を取り除きます。次に、1ミリリットルのトリプシンを追加し、フラスコの表面全体を覆うようにします。細胞の大部分が分離したら、円錐形のチューブ内の培地をピペットで細胞に戻します。

10ミリリットルの細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管に分注します。200Gで10分間遠心分離します。スーパーネイトを取り外します。

10ミリリットルの75ミリモル塩化カリウムにペレットを懸濁し、摂氏37度の10分間のインキュベーション後に摂氏37度に予温されます。200Gで5分間遠心分離します。摂氏25度で、上清の0.5ミリリットルを除くすべてを取り除き、ペレットを慎重に再懸濁します。

細胞に5ミリリットルの新鮮な車の騒音固定剤を追加します。次に、5ミリリットル、さらに固定剤を加え、ボルテックス遠心分離機を200Gで5分間遠心分離します。Resusは、各細胞ペレットを5ミリリットルの固定剤で懸濁します。

細胞を4度で最大1年間保存します。細胞を200Gで5分間遠心分離します。摂氏25度で。

ペレットを穏やかに懸濁した後、0.3〜0.5ミリリットルだけが残るまで、サップナタントを取り除きます。細胞懸濁液を約2インチの距離から3滴ピペットで、約45度の角度で傾けたスライドにピペットで移します。そして、サスペンションがスライドを横切って転がるのを待ちます。

スライドに固定剤である新鮮な車の騒音を1滴大きく加えます。スライドの裏側をペーパータオルで駆動し、スライドを座らせて完全に乾かします。新鮮なギムサステニングソリューションを準備します。

スライドを染色ラックに置きます。スライド全体をギムサステニングソリューションで覆います。5分後、スライドを蒸留水ドレーンですすぎ、風乾させます。

スライドにパーママウントを4滴加え、カバースリップの下に気泡が入らないようにカバースリップを置きます。ペーパータオルでマウントごとの余分な部分を取り除きます。光学顕微鏡で10倍および100倍の倍率で細胞を解析します。

中期細胞が豊富で十分に広がっている場合、残りのスライドは他の実験手順に使用できます。50ミリリットルの処理溶液を4つのコープランドジャーに追加します。その後、各スライドを瓶番号1に5秒間浸します。

スライドを瓶番号2ですばやくすすぎます。3番の瓶に3秒以上置いておきます。4番の瓶ですすぎ、スライドを乾かします。

新しいGIMサステイン溶液を調製します。スライドを染色ラックに置きます。スライド全体をギムサステニング溶液で5分間覆います。

スライドと蒸留水は、染色したのと同じ順序ですすぎます。その後、少なくとも10分間乾燥させます。前述したようにパーママウントを使用してカバースリップを置きます。

次に、光学顕微鏡で細胞を分析し、残りのスライドを探します。インキュベーション時間を調整します。最初のスライドの結果に基づいています。

アッセイが成功すると、十分に広がり、適切な染色体形態の染色体が得られます。ちゃんと。GBバンデッド染色体には、特徴的な明るいバンディングパターンと暗いバンディングパターンが含まれています。このビデオを見た後、GBバンディングのための染色体採取方法と、染色体不安定性の解明におけるさらなる分子細胞遺伝学的検査について十分に理解できるはずです。

この収穫技術は、一度習得すれば、適切に行えば約3時間で完了します。GBバンディング手順では、GBバンドに進む前に、まず1枚のスライドでトリッシンインキュベーション時間をテストすることが重要です。残りのスライド。