Name: ミトコンドリア関連のER膜（MAMS）とスフィンゴ糖脂質マイクロドメインエンリッチド（GEMS）：マウス脳から単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-04T12:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 学ぶマウス脳からミトコンドリア関連ER膜（MAMs）とスフィンゴ糖脂質エンリッチドマイクロドメイン（GEMs）の単離法。遠心分離と密度勾配法を用いた神経科学研究への応用。

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我々は最初のプロトコルを妊娠中レナータ佐野の貢献を認める。 Ad&#39;A。遺伝学と遺伝子治療に寄附チルドレン（JFC）のために宝石を保持しています。この作品は、NIHの助成金GM60905、DK52025とCA021764、アメリカレバノンシリア関連慈善団体（ALSAC）によって部分的に資金を供給された。

<html>以下のプロトコールは、マウスの脳からMAMSや宝石の単離および精製のために意図されているミトコンドリア、MAMSや宝石の分離に必要なソリューション原油ミトコンドリアの準備を取得するための分別： ソリューション：0.32Mスクロース、1mMのNaHCO 3を 、1mMのMgCl 2、0.5 mMのCaCl 2 +プロテアーゼ阻害剤（必要に応じて、新鮮追加） B液：0.32Mスクロース、1mMのNaHCO 3を +プロテアーゼ阻害剤（必要に応じて、新鮮追加） MAMSアイソレーション： 分離培地：250mMのマンニトール、5mMのHEPES緩衝液（pH7.4）、0.5mMのEGTA、0.1％のBSA 勾配バッファ：225 mMのマンニトール、25mMのHEPES緩衝液pH7.5、1mMのEGTA、0.1％のBSA（最終濃度） GEMSの分離： コンテンツ&quot;&gt; GEMの抽出バッファー：25mMの HEPES、pH7.5の0.15MのNaCl、1％トリトンX-100 +プロテアーゼ阻害剤（必要に応じて、新鮮追加） GEMの可溶化緩衝液：50mMのトリス-HCl、pH 8.8、5mMのEDTA、1％SDS +プロテアーゼ阻害剤（必要に応じて、新鮮追加）。 1。最初のステップ細胞下分画：核の除去、Unlysed細胞および細胞破片<ol><li> CO 2のチャンバー内でマウスを安楽死させる。 </li><li>すぐに、脳を除去半減、氷の上に2 mlチューブに置き、重量を量る。 </li></ol> 注：手順全体を通して脳の半分を分離します。以下は、単一の脳の半分の治療に適用されます。 <ol start="3"><li> 1ミリリットル冷たい溶液Aが大きいクリアランス乳棒の合計15ストロークでホモジナイズ含む予冷2ミリリットルのガラス製ダウンス組織グラインダーで行わハーフ脳。 </li><li>氷の上で、15mlファルコンチューブに移し、希釈10ボリュームw / vの、 例えば 0.225グラム〜2.25 mlまでホモジネート。 </li><li> 4℃で10分のために1400 xgで遠心し</li><li>上清を慎重に除去し、氷の上に、30 mlの丸底ガラス遠心管に移す。ペレットを乱さないように注意してください。 </li><li> ソリューションの同じ10巻でペレットを再懸濁します。小さなクリアランス乳棒、一度に1ミリリットルの3から6ストロークで、同じグラインダーでホモジナイズする。 </li><li> 4℃で10分間、710×gでフレッシュ15mlファルコンチューブおよび遠心℃に移す核および細胞破片のペレットでこの結果。 </li><li>慎重にステップ1.6で保存した上清を用いて、上清とプールを削除します。 </li></ol> 2。第二ステップ：粗ミトコンドリア単離<ol><li> 4℃で10分のために13800×gで遠心分離し、上清を</li><li>氷の上で、超クリアベックマン遠心チューブに上清を移し、 </li><li>ペレットを再懸濁し10倍量のソリューションインチ小さなクリアランス乳棒、一度に1ミリリットルの3から6ストロークで、同じグラインダーでホモジナイズする。 </li><li>ステップ2.1のように遠心分離します。 </li><li>ステップ2.2から2.4を繰り返します。 </li><li>得られたペレットは、濃縮されたミトコンドリア画分である。プールの上清（細胞質ゾルとER）、パラフィルムでカバーし、氷上で保存する。 </li><li>新鮮なホモジナイザーで、B液の4.8ミリリットル/グラム（gは元脳重量と呼ばれます）で、小さな隙間乳棒の6ストロークでペレットを再懸濁します。 </li><li>ガラスパスツールピペットを用いて、超クリアベックマン遠心管に不連続ショ糖密度勾配を作成し、次のようにチューブの底に続いて追加して、慎重に、気泡が形成されない確実： Resupendedペレット（0.32Mスクロース） 3ミリリットル850 mMスクロース（1ミリメートルのNaHCO 3） 3ミリリットル1 Mスクロース（1ミリメートルのNaHCO 3） 3ミリリットル1.2 Mショ糖（1mMの炭酸水素ナトリウムで3） </li><li> 4℃で2時間、82500×gで遠心分離し、グラデーションの終わりに得られた分離は、3つのバンドとペレット生成されます： - 、2）小胞体、ゴルジ体、原形質膜（0.85 M - 1 Mインターフェイス）0.85 Mインターフェイス）1）ミエリン及び他の膜汚染物質を（0.32 M; 3）シナプトソーム（1 - M 1.2 Mインターフェイス）、4）ミトコンドリア原油（ペレット）は、その後の精製工程のために使用される</li></ol> 3。ミトコンドリア関連ER膜の分離、MAMS <ol><li>新たに追加されたプロテアーゼ阻害剤を含む2 mlの分離培地では、1つの脳の半分から新たに単離したミトコンドリア原油を再懸濁します。 </li><li> 勾配緩衝8半脳mlあたり、および超クリアベックマン遠心チューブ内の場所で30％パーコール勾配を準備します 。 </li></ol> * 注：（1.43倍）勾配バッファはもっと集中してくださいdの ​​後に適切な最終濃度を達成するために30％パーコールをiluting。 <ol start="3"><li>準備されたグラデーションの上の層ミトコンドリア懸濁液は徐々に任意の気泡を防ぐことができます。 </li><li> 30分、4℃で95000×gで遠心分離し、 </li><li><ol class="lroman"><li>ガラスパスツールピペットを持つ最初の重質留分（下部バンド）を削除し、新鮮な丸底ガラス管に移し、氷の上で。 </li><li>別のガラスパスツールピペットを用いて、第二の光フラクション（上部バンド）を取り外して、氷の上で、別々の新鮮な丸底ガラス管に移す。 </li></ol></li><li> 4℃で10分間6300 xgで℃で10 mlの分離培地と遠心分離機でステップ3.5で回収した画分の両方を薄める</li><li>ステップ3.6で得られた重質留分からの上清を捨て、ステップ3.6のように、再び別の10 mlの分離培地と遠心でペレットを再懸濁します。得られたペレットは、 純粋なミトコンドリア画分となります。 </li><li>ライトフラクショナルから上清を移するには、氷の上で、超クリアベックマン遠心チューブにステップ3.6で得られた。ペレットを廃棄します。 </li><li> 1時間、4℃、100,000×gでチューブと遠心分離機を埋めるために、ステップ3.8で得られた上清に十分な分離培地を追加得られたペレットは、MAMS分数となります。上清を慎重に除去して廃棄します。 </li></ol> 注：このステップで、あなたも1時間、4、100,000 xgで遠心あり℃ステップ2.6で保存した上清。ペレットは、ER分数であるとサイトゾル画分を上澄みます。 4。スフィンゴ糖脂質に富むマイクロドメインの抽出、GEMS <ol><li>氷上で20分間のExtraction Bufferを500μl-1mlに純粋なミトコンドリアおよび/またはMAM分画を溶解します。 </li><li> 4℃で2分間15300×gでライセートを遠心℃、 </li><li>上清（トリトンX-100可溶性物質）および再遠心ペレットを集める2分間残っている水溶性物質を除去します。 （トリトンX-100ミトコンドリア抽出および/またはTriton X-100抽出MAMS）。 </li><li>バッファーを可溶化にペレットを可溶化する。この可溶化された材料は、GEM分数を表し、さらなる分析のために使用することができます。 </li></ol>

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</ol>

執筆者はいずれも宣言する利益相反はありません。

細胞内膜間または細胞小器官や細胞の細胞膜との間の接触部位は、基本的な細胞プロセスのためのダイナミックシグナリングプラットフォームを表します。生理学的および病理学の両方の条件下でその機能と組成の正確な特性評価には信頼性と再現性の高い精製プロトコルを必要とします。ここで詳述した方法は、特に成体マウスの脳からMAMSとそれらに対応する宝石の単離および精製のための私達の研究室によって最適化されています。このプロトコルは正常にこれらのマイクロドメインを指定して、Ca 2 +のアポトーシス経路の下流の根底+不均衡は子供4の神経変性代謝性疾患における神経細胞死に至る分子エフェクターの同定のために実装されています。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 試薬 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 分別 </td></tr><tr><td>スクロース</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> S5-500 </td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S-5761 </td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C-5080 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> MAM </td></tr><tr><td> D-マンニトール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M9546-250G </td><td></td></tr><tr><td>ヘペス</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP310-500 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> E4378-250G </td><td></td></tr><tr><td> BSA、フラクションV、熱ショック、凍結乾燥</td><td>ロッシュ</td><td> 03-116-964-001 </td><td></td></tr><tr><td>パーコール</td><td> GE </td><td> 17-0891-02 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> GEM </td></tr><tr><td>トリトンX-100 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T9284-500ミリリットル</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> S271-3 </td><td></td></tr><tr><td>トリス塩基</td><td>ロッシュ</td><td> 03-118-142-001 </td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> A144S-500 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> EDTAを</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム（SDS） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP166-500 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 共通の </td></tr><tr><td>完全プロテアーゼ阻害剤錠、EDTAフリー</td><td>ロッシュ</td><td> 11-873-580-001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 機器 </td></tr><tr><td> 2ミリリットルDouceの全ガラスティッシュグラインダー</td><td>キンブルチェイス</td><td> 885300-0002 </td><td></td></tr><tr><td> 15mlのポリプロピレンコニカル遠心管、BDファルコン</td><td> BD </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 30ミリリットル丸底ガラス遠心管</td><td>キンブルチェイス</td><td> 45500から30 </td><td></td></tr><tr><td> 15ミリリットル丸底ガラス遠心フーガチューブ</td><td>キンブルチェイス</td><td> 45500から15 </td><td></td></tr><tr><td>超遠心管、超クリア、薄肉、14x89ミリメートル</td><td>ベックマン·コールター- </td><td> 344059 </td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>コー​​ル - パーマー</td><td> PM996 </td><td></td></tr><tr><td>使い捨てのホウケイ酸ガラスパスツールピペット、9 &quot; </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 13から678-20C </td><td></td></tr></tbody></table>

ミトコンドリア関連のer膜（mams）とスフィンゴ糖脂質マイクロドメインエンリッチド（gems）：マウス脳から単離

Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain

細胞内小器官は、細胞特異的内因性および外因性の刺激にさらされる形状および組成を変化させると非常にダイナミックな構造です。その膜は、しばしば、シグナル伝達分子や膜成分1,2,3,4の交換のためのハブとなって定義されている接触部位で並置されている。 IP3は敏感なCa 2 +チャネルの開口部には小胞体（ER）とミトコンドリアの間に形成されている間オルガネラ膜マイクロドメインは、ミトコンドリア関連する- ER膜またはMAMS 4,5,6として知られている。タンパク質/脂質組成およびこれらの膜の接触部位の生化学的特性は、広範囲に、特に細胞内Ca 2 + 4,5,6の調節におけるそれらの役割に関連して研究されてきた。 ERは、細胞内Ca 2 +の主な店舗となっており、この容量で下流のCa 2の細胞プロセスの無数+シグナル、税込を調節翻訳後のタンパク質の折りたたみ及びタンパク質maturation7をuding。ミトコンドリアは、その一方で、それによって下流のCa 2 +のアンバランス4,8のアポトーシス経路の開始を防止する細胞内Ca 2 +濃度をバッファリングすることにより、Ca 2 +の恒常性を維持する。 MAMSの動的な性質は、それらの理想的なサイトは、Ca 2 +シグナル伝達とミトコンドリアのCa 2 +濃度、脂質生合成と輸送、エネルギー代謝と細胞生存4,9,10,11,12の調節など、基本的な細胞メカニズムを解剖することができます。いくつかのプロトコルが、肝組織および培養細胞13,14からこれらのマイクロドメインの精製の ​​ために記載されている。 アカウントに以前に公開されている方法を取って、我々は、成体マウスの脳からミトコンドリアとMAMSを単離するためのプロトコルを適応している。この手順に、我々はどの電子すなわち余分な精製工程、トリトンX100の抽出を追加しましたnables MAMSのスフィンゴ糖脂質に富んだマイクロドメイン（GEM）の画分の単離。これらのGEMの製剤は、原形質膜または他の細胞内膜に由来し、カベオラや脂質ラフトといくつかのタンパク質成分を共有しており、受容体タンパク質のクラスタリングのために、タンパク質-タンパク質相互作用4,15の集まるポイントとして機能するように提案されている。

このプロトコルを使用しているとの経験に基づいて、我々は安全MAMS、宝石、マウス脳のミトコンドリア画分の単離および精製のためにそれをお勧めすることができます。概説された手順は、非常に再現性があり、一貫性があります。 図1に我々は、パーコール勾配（ステップ3.4）上の方法で純粋なミトコンドリアとMAMS層の代表的なイメージを示しています。 MAMのフラクションはミトコンドリア上びまん性と広い帯域を占める一方で、超遠心チューブの底にミトコンドリア（水戸-P）の偏析し、精製を含む定義された、乳白色のバンド。個々のグラデーション帯を慎重に回収した後、精製した画分を、溶解緩衝液中に再懸濁させ、SDSポリアクリルアミドゲル上で分離し、PVDF膜にブロットした。ブロットを次に分数とそのタンパク質組成物の純度を確かめよう特定のタンパク質マーカーに対する抗体のバッテリーでプローブされます。 図2Aは、CYTOSの分布を示している孤立MAMSとミトコンドリア画分における、オリッチERおよびミトコンドリアマーカー。純粋なミトコンドリアの製剤は、ERおよび細胞質マーカーの両方を欠いている必要が...

この手順では、成体マウスの脳ミトコンドリア関連のER膜またはMAMSとMAMSとミトコンドリア調製物からスフィンゴ糖脂質に富むマイクロドメイン画分から単離する方法を示しています。

ミトコンドリア関連のER膜（MAMS）とスフィンゴ糖脂質マイクロドメインエンリッチド（GEMS）：マウス脳から単離

Intracellular organelles are highly dynamic structures with varying shape and composition, which are subjected to cell-specific intrinsic and extrinsic ...

この手順の全体的な目的は、マウス脳からミトコンドリア、小胞体膜、マイクロドメイン、またはMAMsを単離することです。精製されたMAMsからさらに抽出を行い、糖鎖フィンガー脂質濃縮マイクロドメイン画分（gems）を得ます。まずマウス脳を解剖し、その後、Dounceホモジナイザーを用いて特定の緩衝液中でホモジナイズすることでこれを達成します。得られたホモジネートを低速で遠心分離し、核、未溶解細胞、および細胞碎片を除去します。第2ステップでは、粗ミトコンドリア画分を調製します。上清をさらに遠心分離し、得られたペレットを再懸濁させた後、不連続ショ糖密度勾配を用いてさらに分離します。次に、この粗ミトコンドリア画分をPercoll勾配に適用します。遠心分離と数回の洗浄工程を経て、純粋なミトコンドリア分画およびMAMsが得られます。最終ステップでは、TRITTON X 100を含む溶液でMAMsを処理し、糖脂質（glyco finger lipid）が豊富に含まれるマイクロドメイン分画（gem）を抽出します。最終的に、各オルガネラ分画に特異的なタンパク質マーカーに対する抗体を用いたウェスタンブロット解析により、各分画の純度を検証します。既存の手法に対する本手順の主な利点は、比較的少量の研究材料を用いて、成マウス脳からミトコンドリア、MAMおよびGEM画分を単離できるよう最適化されている点にあります。この最適化された手順は再現性が非常に高く、特に神経生物学分野の研究者が目的タンパク質の解析に使用するのに十分な量の異なるオルガネラ画分を単離することを可能にします。本手順の実演は、当研究室の技術者が行います。二酸化炭素で安楽死させたマウスから脳を取り出した後、脳を半分に切断してこの手順を開始します。それぞれの半分を、氷上の別々の2 mLチューブに入れます。あらかじめ冷却した空の2 mLチューブを用いて天秤のゼロ点調整を行い、チューブの重量を量り、氷上で保存します。脳の半分を、1 mLの冷たい分画溶液が入った、あらかじめ冷却した2 mLガラス製組織ホモジナイザーに移します。隙間の大きなペッスルを用いて、計15回ストロークしホモジナイズします。ホモジネートを氷上の滅菌済み15 mLファルコンチューブに移し、サンプルの重量に基づき、冷たい分画溶液Aで10倍量まで希釈します。その後、サンプルを4°Cで1,400 ×g、10分間遠心分離します。ペレットを乱さないように注意しながら上清を慎重に取り除き、氷上の30 mL丸底ガラス遠心チューブに移します。次に、ペレットを同量の10倍量の分画溶液で再懸濁します。再懸濁したペレットを同じグラインダーで、1 mLずつホモジナイズします。今回は、隙間の小さいペステルのストロークを3〜6回行います。ホモジナイズした試料を15 mLのFalconチューブにまとめ、4 °Cで710 ×g、10分間遠心分離します。これにより、核および細胞残渣が形成されます。上清を慎重に取り除き、以前の遠心分離で保存しておいた上清と合わせてください。ミトコンドリア分離を開始するため、これらの上清を13,800 ×g、4 °Cで10分間遠心分離します。その後、上清を氷上のUltraClear Beckman遠心チューブに移します。ミトコンドリア画分を含むペレットを10倍量の分画溶液Aで再懸濁し、1 mLずつホモジナイズします。今回は、隙間の小さいペルキン・エリス（Pele）ホモジナイザーで3〜6回ストロークし、ホモジナイズした液を氷上の新しい30 mLラウンド底ガラス遠心管にまとめます。これらの手順をもう一度繰り返して、サンプルをさらに精製します。ホモジネートを遠心分離します。S上清を回収し、細胞ペレットを溶液Aの10倍量に懸濁させた後、1 mLずつ再度ホモジナイズします。次のステップとして、濃縮ミトコンドリア分画を含むペレットを、元の脳重量1 gあたり4.8 mLの分画溶液Bで再懸濁し、新しいホモジナイザーを用いて小型のクリアランスペッスルで6回ストロークしてホモジナイズします。このホモジネートを氷上に保存します。その後、UltraClear Beckman遠心管に不連続ショ糖密度勾配を作成します。まず、再懸濁したペレットを加え、続いて850 mMのスクロース 3 mL、1 Mのスクロース 3 mL、そして最後に1.2 Mのスクロース 3 mLを加えます。気泡が形成されないよう、溶液は底部からゆっくりと加えてください。最後に、4 °Cで82,500 ×gにて2時間遠心分離します。得られた分離により、3つのバンドと上清が生成されます。上清には、以降の精製ステップで使用する粗ミトコンドリアが含まれています。片側の脳半球から新しく単離した粗ミトコンドリアを、2 mLの単離用培地で再懸濁してください。次に、新しいUltraClear Beckman遠心チューブに30%のコアグラジエントを8 mL加えます。気泡の形成を防ぐため、準備したグラジエントの上にミトコンドリア懸濁液を非常にゆっくりと重層します。その後、グラジエント分離に従い、4 °Cで95,000 ×gにて30分間遠心分離を行います。まず、ガラス製パスタピペットを用いて、下層のバンドである重量画分を除去し、新しい丸底ガラスチューブに移します。このチューブを氷上に保存します。次に、新しいガラス製パスタピペットを用いて、上層のバンドである軽量画分を除去し、別の新しい丸底ガラスチューブに移します。このチューブも同様に氷上に置きます。両方の画分を10 millilitersの分離培地で希釈し、4 °Cで6,300 ×gにて10分間遠心分離します。ヘビーフラクション（重い画分）の上清を捨て、別の10 millilitersの分離培地でペレットを再懸濁します。同じ条件でサンプルを再度遠心分離します。得られたペレットが精製ミトコンドリア画分となります。次に、軽画分の上清を氷上のUltraClear Beckman遠心チューブに移します。この画分のペレットには不純物としてミトコンドリアが含まれているため、廃棄します。軽画分の上清に、チューブがいっぱいになるまで十分な量の分離用培地を加え、4 °Cで1時間、100,000 ×gで遠心分離します。得られたペレットに、ミトコンドリア結合小胞体膜（MAMs）が含まれます。上清を慎重に取り除き、廃棄します。MAM分画を、氷上で500 µLから1 mLの抽出バッファー中で20分間処理し、糖脂質濃縮マイクロドメイン（gems）の抽出を開始します。次に、溶解物を4 °Cで2分間、15,300 ×gで遠心分離します。上清を回収し、ペレットを2分間遠心分離して、残っているすべてのTriton X-100可溶性物質を除去した後、最後に可溶化バッファーでペレットを再懸濁します。この可溶化物質がGEM画分であり、さらなる解析に使用できます。細胞質画分における小胞体、細胞質タンパク質、およびミトコンドリアのマーカーの純度と分布を確認するために、ウェスタンブロッティングを行いました。小胞体画分、純化ミトコンドリア画分、およびMAMs画分。ウェスタンブロットでは、gemsがcliのマーカーであるcavi in oneに対して陽性であり、小胞体およびミトコンドリアタンパク質に対しては陰性であることが示された。一方で、Triton X 100で抽出したMAMsは、小胞体およびミトコンドリアマーカーに対して陽性であり、本手順の試行においてcavi in oneはほとんど認められなかった。新鮮に採取した脳組織を使用すること、およびその後のすべての溶液、サンプル、チューブを氷上で保持することが重要です。また、精製手順の全体的な成功をイムノブロッティングで確認できるよう、分画の各ステップから少量のサンプルを保存しておくことが推奨されます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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学ぶマウス脳からミトコンドリア関連ER膜（MAMs）とスフィンゴ糖脂質エンリッチドマイクロドメイン（GEMs）の単離法。遠心分離と密度勾配法を用いた神経科学研究への応用。

ミトコンドリア関連のER膜（MAMS）とスフィンゴ糖脂質マイクロドメインエンリッチド（GEMS）：マウス脳から単離

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