定性的には生体試料中のRNAおよびDNAを区別するために迅速比色アッセイ

次の実験の全体的な目的は、生体分子の不均一な可能性のあるサンプルに核酸や還元糖が含まれているかどうかを判断することです。もしそうなら、RNAとDNAは、糖部分の反応性の違いに基づいて区別します。これは、最初にベネディクトアッセイを適用して、生体分子混合物に遊離還元糖が含まれているかどうかを判断することによって達成されます。

第2ステップのファイルとして、ヒ素またはアッセイが使用され、糖成分にペントリングが含まれているかどうかが確立されます。次に、ディフェニルアミン試薬を使用して、ペント糖がDNAのようにデオキシリボースであるかどうか、またはRNAのようにデオキシリボースであるかどうかを判断します。結果は、サンプル中の糖ベースの成分の異なる反応性によって形成される容易に識別できる色生成物に基づくバイオポリマーの種類を示しており、分光測光測定を使用して標準曲線に対して分析できます。

この技術の主な利点は、蛍光色素、ピコグリーン、またはサイバーゴールドを用いた電気泳動などの既存の方法よりも、サイズ、電荷、または糖成分に基づく制限がなく、時間とコストにおいて効率的で糖を還元するためのアッセイを行うことである。940ミリモルの無水物、炭酸ナトリウム、588ミリモル、クエン酸ナトリウム二水和物、および68ミリモルの銅で構成される6×ベネディクト試薬を適切な量で調製します。2つの硫酸塩ペンタ水和物。

アッセイする各サンプルについて、100マイクロリットルの6 x Benedict試薬を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに加えます。各チューブに10〜500マイクロリットルのサンプルを追加し、二重蒸留水を追加して最終容量を600マイクロリットルのボルテックスまたはピペットにします。溶液を混合する。

サンプルを沸騰水浴中で20分間インキュベートし、次いで10分間冷却してから、約10, 000RPMで5分間遠心分離します。微粒子物質を沈殿させるには、475ナノメートルの水でUV対分光光度計をブランキングした後、穿轡液を清潔な獣医に移します。

サンプルの吸光度を測定して、ペント糖をアッセイします。テキストプロトコルに従って、24.2ミリモル、6モルの塩化水素、および体積あたり0.025重量の塩化第二鉄六水和物を含む新しい2 x BALs試薬を調製します。各サンプルについて、500マイクロリットルの胆汁試薬をマイクロ遠心チューブに加えます。

各チューブに10〜500マイクロリットルのサンプルを追加し、二重蒸留水を追加して最終容量を1ミリリットルにします。ミックス。サンプルを20分間沸騰させた後、室温で10分間冷却した後、サンプルをスピンダウンして粒子状物質を沈殿させ、水をブランクとして使用して660ナノメートルで吸光度を測定します。

60ミリモルジフェニルアミン、7モル氷酢酸、179ミリモル硫黄酸、および体積あたり62%のボリュームで構成される2つのxディッシュジフェニルアミン試薬を準備します。エタノール。各反応について、500マイクロリットルの試薬、サンプル、および二重蒸留水を組み合わせて、総容量を1ミリリットルにします。サンプルを20分間沸騰させ、室温で冷却して回転させた後、600ナノメートルで吸光度を測定します。

ここでは、ベネディクト・バイルズの兵器庫とディッシュ、既知の参照化合物のジフェニルアミンアッセイに関する彼女の代表的な定性データを示しています。左側のパネルにはポジティブコントロールとネガティブコントロールの両方が表示され、右側のパネルにはアッセイの可視検出範囲が表示されます。このパネルは、さまざまな不均一性のサンプルに対するディッシュの反応を示すことにより、アッセイの堅牢性を示しています。

たとえば、DNAとRNAまたはタンパク質を含むDNA。Dishのアッセイの陽性結果は、汚染されたRNAまたはタンパク質の存在下でも、DNAを含むサンプルについて保存されることに注意してください。前のサンプルの希釈範囲は、各反応に明確な視覚的検出限界があるため、異なります。

分析する糖の種類によっては、この標準曲線に示すように、目視検出ではなくスペクトル測光を使用して測定範囲を改善できます。ベネディクトアッセイの場合、一度習得すると、この技術は適切に実行されれば30分以内に行うことができます。