電気生理学基づき固体支持された膜の概要

そのため、SSMベースの電気生理学と略される膜ベースの電気生理学がサポートされています。これは新しい電気生理学的アプローチです。これは、従来の方法と比較して大幅な改善を多くのアプリケーションに提供します。

従来の電気生理学の主なツールは電解質を充填した微粒子電極ですが、そのMベースの電気生理学は、固体支持膜電極を介して電荷転座を検出します。これは、従来の電気生理学が使用できない場合、例えば細菌トランスポーターの場合など、いくつかのまれな例外を除いて、電圧クランプやパッチカム法では調査できない場合に非常に有用です。このような場合、SSMベースの電気生理学は非常に成功していることが証明されています。

また、細胞内膜における生理学的に関連する真核生物トランスポーターの研究にも使用できます。SSMベースの電気生理学実験を行う方法はたくさんあります。基礎研究では、動力学パラメータの決定や輸送メカニズムの解明に応用できますが、その堅牢性と自動化の可能性は、トラックディスカバリーのスクリーニングアプリケーションに最適です。

SSM電極は、基礎となるSSMと、目的の輸送タンパク質を含むプロテアソームまたは膜フラグメントを採用する化合物膜システムを備えています。複合膜の電気的特性は、膜が容量結合システムを形成する等価回路によって説明できます。システムの電気的挙動は、膜断片が使用されるかプロテアリポソームが使用されるかにかかわらず、基本的に同じであることに注意してください。

輸送タンパク質の電荷置換は、膀胱膜の静電容量を介して測定回路に伝達されます。容量結合と呼ばれる検出原理。典型的な実験では、VSSMでの迅速な溶液交換により、輸送タンパク質Vの基質が提供され、その後のタンパク質の電気発生輸送活性により電流が発生し、SSMキャパシタンスを介して測定システムに結合されます。

同時に、電気起源の蛋白質の活動は運輸蛋白質の抑制につながってリポソームの膜を徐々に帯電させ、記録回路の減少電流は測定された流れに吸収されるプロテアリポソームの何百万もの同時輸送反応の結果である。それぞれに約100個のトランスポーターが含まれています。このセットアップは、ソリューション経路を備えたファラデーケージ、バルブ制御用の外部回路、信号増幅、およびデータ収集と分析で構成されています。

ECケージには、溶液流量制御に必要な容器、バルブ、チューブ、およびXORチップを備えたキュビットが含まれています。XORチップは、SSM電極と吸収されたプロトリポソームを運びます。veteは、外部電気回路のアンプと関数発生器に接続されています。

SSM測定、リークファイア、2つの溶液、1つは活性化、もう1つは活性化溶液にのみ存在する基板から離れて非活性化します。両方のソリューションは、単一の交換構成で同じ構成を持っています。2つの双方向バルブは、非再活性化溶液と活性化溶液の流れを制御します。

ターミナルバルブは、機械的に結合された3回三方弁で、非活性化溶液と活性化溶液を切り替えるために使用され、溶液の1つを廃棄物容器に、もう1つの溶液をqveに向けます。ターミナルバルブが切り替わると、非活性化溶液の流れは廃棄物に再ルーティングされ、活性化溶液はqveに流れます。この構成により、両方のソリューションを同時に連続して流すことができます。

フロープロトコルの期間中はいつでも、必要に応じてフロー経路を最適化することができます。ただし、SSMと非活性化溶液および活性化溶液の接合部との間の距離は、できるだけ短くする必要があることに注意する必要があります。それはソリューション交換のタイマーソリューションを決定するので。

パワーデッキケージの外側にある電流増幅器は、センサーチップに接続されています。通常、これは 10 の 8 から 10 の累乗、アンペアあたり 9 ボルトの累乗、および休息時間を 1 から 10 ミリ秒の増幅に設定します。参照電極にはファンクションジェネレータが接続され、バルブ制御およびデータ収集ソフトウェアを備えたコンピュータとインターフェースボックスがシステムを完成させます。

インターフェースボックスにはバルブドライバーのデータ収集が含まれており、デジタル出力ハードウェアソリューションの流れはoh 0.22の加圧空気によって維持されます。1バールの圧力は、デジタルミリメートルを使用して監視されます。これは、ECケージ内の空気供給と溶液容器の間に設置されたスチール容器をニードルバルブを介して充填することによって維持することができます。

CVICは4つの部分で構成されています。禅チップは獣医ベースと獣医ヘッドの間に挟まれています。円筒形のコンセントコネクタは獣医の頭にねじ込まれ、参照電極アセンブリを運びます。

参照電極は、小型SMCコネクタを備えた塩素化銀線で構成され、ポリアクリルゲル塩ブリッジによって流路から分離されています。使用されていないゲルブリッジアセンブリは、100ミリモルの塩化カリウムを含む100ミリモルのリン酸カリウムpH7溶液に保存されます。まず、参照電極は、ジオブリッジを含む参照電極アセンブリに取り付ける必要があります。

基準電極を取り付ける際には、気泡を避けることが重要です。これで、veteのこの部分が、緩衝液が事前に充填された出口コネクタに取り付けられています。すべての接続はOリングで密閉する必要があります。

このSMは、構造化されたヤギコーティングされたガラスライトであるzorチップ上に形成されます。このセマティックロードは直径1ミリメートルで、OH 0.2ミリメートルの白いコンタクトストリップを介してコンタクトパッドに接続されています。スプリング接点ピンは、アンプへの接点を作成します。

zenチップは、10 LAR Okta Deccanチオールエタノール溶液で暗所で保管されます。吸収されていないOkta deccanウイルス分子を除去するための難解な層を維持するために、電極を純粋なエタノールですすぎ、電極を窒素ガスで乾燥させます。これで、ホスホコリン単層を組み立てることができます。

脂質溶液には、15ミリグラム/ミリリットルのDFIコリンと250マイクログラム/ミリリットルが含まれています。オクタ2 A鉱山は崩壊し、マイナス20度で保存されています。電極はSAキュビットの基部に正確に配置されました。

1マイクロリットルの溶液を、金層に触れずにSSM電極に加えます。脂質溶液を添加した直後に、ベテを組み立てることができます。Oリングによって密封されるveteの容積は取付けられるとき17マイクロリットルの内部容積の円柱である。

SSMは、インレットボアの中央に配置する必要があります。獣医を接続する前に、流体システムに100ミリモルリン酸カリウム緩衝液を事前に充填する必要があります。チューブとバルブに気泡がないことを確認することが重要です。

これで、獣医を甲状腺のデイケージに取り付け、アンプ、溶液流路の入口と出口、および機能発生器を接続できます。最後に、キュビットを100ミリメートルのリン酸カリウム緩衝液ですすぐことができます。これにより、SSMの品質を確認するための自発的なSSM形成が行われます。

静電容量とコンダクタンスは、コンダクタンスを測定するために関数発生器を使用して測定され、100ミリボルトのDC電圧が使用されます。電流減衰は、コンデンサが完全に充電された後のメンブレンコンデンサの充電を示しています。測定された電流は、M'Sの法則を使用して膜コンダクタンスを生成します。

ここでは、oh 0.17 ナノ シーメンスのコンダクタンスを観測します。静電容量は、50ミリボルトのピークツーピーク振幅の三角AC電圧とOH0.5ヘルツの周波数を使用して測定できます。結果として生じる方形波電流の振幅は、コンデンサの判定電流を表します。

静電容量は、転送された電荷を印加電圧で割ったものに等しくなります。この膜は2.3ナノの静電容量を示し、高いコンダクタンスと低い静電容量はSSMが正しく形成されていないことを示しています。このような場合、メンブレンを廃棄し、新しい電極チップを使用して別のSSMを準備する必要があります。

通常、プロトリポソームはマイナス80度で凍結保存されます。凝集したサンプルがSSMにプーリーを吸収して均質なプロトリポソーム懸濁液を得るため、氷上超音波処理上のサンプルをTREすることは不可欠です。3回の10秒の超音波処理サイクルは、氷上での10秒の冷却間隔と交互

SSMを非活性化溶液ですすいでください。次に、参照電極サンプルと一緒に出口コネクタを緩めます。ピペットを使用して、30マイクロリットルのタンパク質サンプルをveteの出口からetteボリュームに注入します。

まず、ピペットチップをアウトレットボアに取り付けます。次に、上記のマニュアルを非活性化経路で開き、プロテアリポソームを注入します。ピペットチップを降格する前に。

上記のマニュアルを閉じて、それ以上の溶液の流れを防ぎます。プロテアリポソームがSSMに吸収されるのを1〜2時間のインキュベーション時間させます。バルブ制御およびデータ収集ソフトウェアのフロープロトコルウィンドウを使用して、フロープロトコルを定義します。

基質特異性、KM値、pH依存性の決定など、対称的な条件下で測定する場合は、単一溶液交換プロトコルを選択してください。各溶液の流速を oh 0.5 から 1 秒に設定します。電流は、フロープロトコル全体を通じて記録されます。

増幅は通常、10の9乗に設定され、サンプルレートには毎秒2000データポイントを選択します。最後に、新しいプロトコルをNA aおよびaというタイトルで保存します。フロープロトコルウィンドウの2回目のタップでは、特定のバルブの開状態または閉状態を定義して、非活性化または活性化溶液の流れを制御できます。

ここでは、大腸菌からのYのような糖プロトンの輸入であるプロテアリポソームの測定を示します。活性化溶液には輸送基質ラクトースが含まれ、非活性化溶液には代償性化合物と同量の非輸送グルコースが含まれています。糖に加えて、溶液にはpH 7.6の100ミリモルリン酸カリウムと1ミリモルのDTTが含まれています。

溶液を交換した後、手動バルブを使用して気泡が除去されていることを確認してください。フロープロトコルを開始する前に、測定を開始する直前に圧力を調整してください。私たちは日常的にO 0.6バールの圧力を使用しており、特定のバルブとチューブの構成では、毎秒約1ミリリットルの流量が得られます。

次に、ここで安全なフロープロトコルであるNAAプロトコルを選択し、スタートボタンを押して各測定を開始します。最初の数回の測定では、緩く吸収され、プロテアリポソームが除去されるため、ピーク電流が減少する可能性があります。ピーク電流が一定になるまで測定を繰り返します。

非活性化溶液の流れの最初のフェーズでは、電流はゼロです。非活性化溶液からラクトースを含む活性化溶液への交換は、メンブレンの電気発生輸送活性を誘導します。タンパク質の正電荷はプロテリポソーム内に蓄積し、増幅器はSSMを介した正の結合による正の過渡電流を検出します。

この正の正の結合電流は、アクティブ化ソリューションからのオン信号V交換と呼ばれます。非活性化溶液に戻ると、リポソームからプロトン糖コードの輸送が誘導されます。この場合、負のLY結合電流、いわゆるオフシグナルがタンパク質速度論的解析のために表示されます。

オフ信号はメンブレンバルブスイッチングの充電状態により機械的および電気的アーチファクトが発生するため、定義が不十分なため、オン信号のみが使用されます。幸いなことに、これらはタンパク質誘導シグナルが観察される前の時間範囲に制限されています。バルブスイッチングアーチファクトとトランスポーター信号との間の50ミリ秒の遅延は、溶液がターミナルバルブからSSM Rapid Solution Exchangeの表面に伝播する必要がある時間であり、SSMで行われるようなものは、典型的な緩和実験を表すことに留意されたい。

このような実験では、電流は時間依存の事前定常状態フェーズを通じて一定の定常状態に緩和されます。反応サイクルの電流速度論的詳細は、事前定常状態の電流の形状および大きさから導出され得る。一方、定常電流は、連続的な膜タンパク質の代謝回転に関する情報を提供します。

プロテアリポソームがSSMに吸収されるリーカップリングシステムでは、事前定常状態の電流は実質的に変化しません。一定の定常状態の電流は得られませんが、代わりにリポソームの充電により、測定された電流は徐々に減少します。トランスポーター電流は、回路解析によって測定された結合電流から計算することができます。

ここでは、8.5 から 7.6 の間の PA 範囲で Y のような糖プロトン共輸送体を使用した代表的な結果を示します。トランスポーター電流は、反応サイクルの後半で電気発生反応によって支配されます。これらの条件下では、事前定常状態面は、定常状態の値に対する単純な電流上昇で構成されます。

その後、これは容量結合により減衰します。定常状態の輸送電流に興味があります。膜電位がない場合、これはピーク電流によって適切に近似されます。

したがって、Ali Meinの動力学は、さまざまな基板濃度のピーク電流をブロッティングすることで解析できますが、ピーク電流の振幅を厳密に比較できるのは、1回の実験で1つのセンサーから得られた場合のみであると考えてください。その理由の一つは、吸収効率のばらつきです。pHがさらに低下すると、単相シグナルは二相性になります。

そして最後に、急速な過渡現象が残る 輸送欠損ラグ Y 変異体。急速な過渡現象の後には、小さくて遅い負の成分が続きます。負の成分は、結合システムで測定される急速な過渡電流に特徴的であり、膜容量放電によって引き起こされます。

ここで、ピーク電流は定常状態の輸送を表すのではなく、イオンサイクルの初期の遷移の電気発生的な確認を表しており、これはla y変異体が定常状態の輸送を示さず、野生型の遅延の場合、yの定常状態輸送が低pHによって阻害されることから明らかになります。実験的証拠は、速度論モデルに示されているラグyの反応サイクルにおける電荷転座の機構的解釈を提供します。輸送欠損変異体について観察された高速過渡現象、または酸性条件での野生型遅延Yの場合、より高いpH値でのラクトース結合に続く毎週の急速な電気発生反応によるものであり、シグナルは反応サイクルの後半における主要な電気発生反応によって支配され、これは容量結合系における疑似プラズマプロトン放出を表すと提案された。

これは、Utesの強い相互作用によるLagyの定常状態輸送を表す過渡電流につながります。SSMでは、異なる組成の溶液が交換されると、電気的アーチファクトが発生します。非活性化溶液と活性化溶液は、特にpHとイオン強度に関して、できるだけ類似していることを確認してください。

基板もアーティファクトを生成する可能性があるため、制御を行う必要があります。タンパク質サンプルを添加する前に、必ずベアSSMを使用して、特定のバッファーシステムとフロープロトコルにアーティファクトがないかテストしてください。タンパク質を添加した後、サンプルコントロール測定は、基質と構造的に類似した非基質を含む溶液で行うことができます。

さらに、目的のタンパク質を含まないリポソームや膜断片を使用して、基質のアーティファクトをテストする可能性があります。また、溶液に阻害剤を追加したり、ピペットでピペットで移動したりすることもできます。実験をベテの出口に直接行ってトランスポーターシグナルの阻害を測定した後、タンパク質特異的なシグナルは消え、溶液交換アーティファクトのみが残ります。

その後、タンパク質シグナルは簡単に修正できます。吸収されたプロト、リポソーム、またはタンパク質分解の損失が測定に影響を与えないことを確認してください。同じ条件下で制御測定を繰り返すことにより、最大20%の信号ランダウンが許容され、ランダウンの線形時間依存性を仮定することで補正できます。

このセットアップは、私たちの研究室での20年間の技術開発の結果です。また、速度論解析用の高タイマーソリューションと、高価な基板用の低ソリューション消費を備えた専用システムも利用できます。薬物スクリーニングには、より高いスループットを備えた全自動セットアップを使用します。

現在までに、20を超えるトランスポーターがこの方法を使用して特徴付けられています。これらには、輸送APA、呼吸鎖複合体、冷却トランスポーター、交換体、さらには鉄チャネルが含まれます。したがって、標準的な電気生理学で問題を解決できない場合は、代わりにSS間瀬電気生理学の使用を検討してください。