電気生理学基づき固体支持された膜の概要

支持膜ベースの電気生理学（略称：SSMベース電気生理学）は、新しい電気生理学的なアプローチです。この手法は、多くのアプリケーションにおいて、従来の方法と比較して大幅な改善をもたらします。

従来の電気生理学の主要なツールは電解質で満たされた微小電極ですが、一方でSSMベースの電気生理学は、固体支持膜電極を介した電荷移動を検出します。これは、少数の稀な例外を除いてボルテージクランプ法やパッチクランプ法では調査できない細菌トランスポーターのように、従来の電気生理学の手法が適用できない場合に極めて有用です。このようなケースにおいて、SSMベースの電気生理学は非常に有効であることが証明されています。

また、細胞内膜にある生理学的に重要な真核生物トランスポーターの調査にも利用できます。SSMベースの電気生理学実験を行う方法は数多くあります。基礎研究においては、速度論的パラメータの決定や輸送メカニズムの解明に適用できますが、その堅牢性と自動化の可能性から、ターゲット探索におけるスクリーニングアプリケーションに最適です。

SSM電極は、下層のSSMと、目的の輸送タンパク質を含むプロテアソームまたは膜断片を吸着させた複合膜システムで構成されています。この複合膜の電気的特性は、膜が容量結合系を形成する等価回路によって説明できます。なお、膜断片を使用するかプロテオリポソームを使用するかにかかわらず、システムの電気的挙動は本質的に同一であることに留意してください。

輸送タンパク質における電荷の変位は、ブレッダー膜の容量を介して測定回路に伝達されます。これは容量結合と呼ばれる検出原理です。典型的な実験では、VSSMにおける急速な溶液交換によって輸送タンパク質に基質が供給されます。その結果、タンパク質の電原性輸送活性により電流が発生し、それがSSM容量を介して測定システムに結合されます。

同時に、電原生タンパク質の活性によってリポソーム膜が徐々に帯電し、輸送タンパク質が抑制されることで記録回路の電流が低下します。測定される電流は、Enzoに吸着した数百万個のプロテアリポソームによる輸送反応が同時に起きた結果であり、各リポソームには約100個の輸送体が含まれています。このセットアップは、溶液経路を備えたファラデーケージ、バルブ制御用外部回路、信号増幅器、およびデータ収集・解析装置で構成されています。

ECケージには、溶液の流量制御に必要な容器、バルブ、チューブに加え、XORチップを装着したキュベットが含まれています。XORチップには、SSM電極と吸収されたプロトリポソームが搭載されています。また、veteは外部電気回路のアンプおよびファンクションジェネレーターに接続されています。

SSM測定では、基質を含む活性化溶液と、基質を含まない非活性化溶液の2種類の溶液を使用します。シングルエクスチェンジ構成では、両溶液の組成は同一です。2つの三方弁により、非活性化溶液と活性化溶液の流れを制御します。

端端バルブ（機械的に結合した3x3方向弁）を使用して、非活性化溶液と活性化溶液を切り替え、一方の溶液を廃棄容器に、もう一方の溶液をqveに誘導します。端端バルブを切り替えると、非活性化溶液の流れが廃棄側に変更され、活性化溶液がqveへ流れます。この構成により、両溶液の同時かつ連続的なフローが可能になります。

フロープロトコルのいかなる時点においても、必要に応じてフロー経路を最適化することができます。ただし、SSMと非活性化溶液および活性化溶液の接合点との距離は、可能な限り短く保つ必要があることに留意してください。この距離が溶液交換のタイミングを決定するためです。

パワーデッキケージ外の電流増幅器は、センサーチップに接続されています。通常、増幅率は10⁸から10⁹ V/Aに、静止時間は1から10 msに設定されます。ファンクションジェネレーターが参照電極に接続され、バルブ制御およびデータ収集ソフトウェアを搭載したコンピューターとインターフェースボックスによってシステムが構成されています。

インターフェースボックスには、バルブドライバーのデータ収集およびデジタル出力ハードウェアが格納されています。溶液フローは 0.22 bar の加圧空気によって維持され、圧力はデジタル圧力計を用いてモニタリングされます。この圧力は、空気供給源と EC Cage 内の溶液容器との間に設置されたスチール製容器に、ニードルバルブを介して充填することで維持できます。

CVICは4つのパーツで構成されています。zenチップがvetベースとvetヘッドの間に挟み込まれています。円筒形の outlet connector がvetヘッドにねじ込まれており、ここに参照電極アセンブリが保持されています。

参照電極は、小型SMCコネクタを備えた塩化銀電線で構成されており、ポリアクリルゲル塩橋によって流路から隔離されています。未使用時、ゲルブリッジアセンブリは、100 millimolar 塩化カリウムを含む100 millimolar リン酸カリウム pH 7溶液に保存されます。まず、参照電極をゲルブリッジを含む参照電極アセンブリに取り付ける必要があります。

参照電極を設置する際は、気泡が入らないようにすることが重要です。次に、このベタの部分を、あらかじめ緩衝液で満たしておいたアウトレットコネクターに取り付けます。すべての接続箇所はOリングで密封してください。

このSMは、構造化されたヤギ被覆ガラス板であるzorチップ上に形成されています。このセマンティックロードは直径1 mmであり、0.2 mmの白色コンタクトストリップを介してコンタクトパッドに接続されています。スプリングコンタクトピンにより、アンプへの接続が形成されます。

zenチップは、10 LAR Okta Deccan チオールエタノール溶液中で暗所で保存します。Okta deccan ウイルス分子のうち、吸着しなかったものを除去して arcane thi 層を維持するため、電極を純エタノールで洗浄し、窒素ガスで乾燥させます。これで、ホスホコリン単分子層を形成させることができます。

脂質溶液には、15 mg/mLのDFI cholineおよび250 µg/mLのOkta two A mine in decayが含まれており、-20 °Cで保存されています。次に、電極をSA cubitの底面に正確に配置します。

金層に触れないようにして、溶液1 µLをSSM電極に添加します。脂質溶液を添加した直後に、veteを組み立てます。Oリングで密閉されたveteの容量は円筒形で、装着時の内部容量は17 µLです。

SSMは、入口ボアの下に中心を合わせて配置してください。ベントを接続する前に、流体システムに100 millimolarのリン酸カリウム緩衝液を満たす必要があります。チューブおよびバルブ内に気泡がないことを確認することが重要です。

次に、ベッティングセルを甲状腺デイケージに取り付け、アンプ、溶液流路の入口と出口、および関数発生器を接続します。最後に、100 mMのリン酸カリウム緩衝液でキュベットを洗浄します。これにより自発的なSSM形成が起こり、SSMの品質を確認することができます。

容量とコンダクタンスの測定にはファンクションジェネレータを使用し、コンダクタンスの測定には100 millivoltのDC電圧を用います。電流の減衰は、膜容量が完全に充電された後の充電過程を示しています。測定された電流から、Ohmの法則を用いて膜コンダクタンスを算出します。

ここでは、0.17 nSのコンダクタンスが観察されます。キャパシタンスは、振幅50 mV peak-to-peakの三角波AC電圧と0.5 Hzの周波数を用いて測定できます。得られた矩形波電流の振幅が、キャパシタの充電電流を表します。

静電容量は、転送された電荷を印加電圧で除した値に等しくなります。この膜の静電容量は 2.3 nano です。高いコンダクタンスと低い静電容量は、SSMが正しく形成されていないことを示しています。このような場合は、その膜を廃棄し、新しい電極チップを用いて別のSSMを調製する必要があります。

通常、プロテオリポソームは-80°Cで冷凍保存されます。氷上でサンプルを解凍した後、凝集したサンプルではSSMへの吸収効率が低下するため、均一なプロテオリポソーム懸濁液を得るにはソニケーションが不可欠です。10秒間のソニケーションサイクルを3回、氷上での10秒間の冷却間隔を挟んで交互に行います。

非活性化溶液でSSMを洗浄します。次に、参照電極試料とともにアウトレットコネクタを取り外します。ピペットを使用して、タンパク質試料 30 µLをveteのアウトレットからette体積内へ注入します。

まず、ピペットチップを出口ボアに取り付けます。次に、非活性化経路にある上のマニュアルを開き、プロテアリポソームを注入します。その後、ピペットチップを取り外します。

溶液のさらなる流出を防ぐため、上のマニュアルを閉じます。プロテアリポソームをSSMに吸着させるため、1〜2時間インキュベートします。バルブ制御およびデータ収集ソフトウェアのフロープロトコルウィンドウを使用して、フロープロトコルを定義してください。

基質特異性、KM値、またはpH依存性の決定など、対称的な条件下で測定したい場合は、シングルソリューション交換プロトコルを選択してください。各溶液のフロー時間を0.5〜1秒に設定します。電流はフロープロトコルの全過程を通じて記録されます。

増幅率は通常10の9乗に設定し、サンプリングレートは毎秒2000データポイントを選択します。最後に、新しいプロトコルを「NA a a」というタイトルで保存してください。フロープロトコルウィンドウの2番目のタブでは、特定のバルブの開閉状態を定義し、qubitを通る非活性化溶液または活性化溶液の流れを制御できます。

ここでは、E. coli由来の糖プロトン共輸送体LacYのプロテオリポソームを用いた測定方法を実演します。活性化溶液には輸送基質であるlactoseを含み、非活性化溶液には補償化合物として同量の非輸送糖であるglucoseを含んでいます。また、これらの溶液には、pH 7.6の100 mMリン酸カリウムおよび1 mM DTTが含まれています。

溶液を交換した後、手動バルブを使用して気泡が完全に除去されていることを確認してください。フロープロトコルを開始する直前に、圧力を調整します。通常、0.6 barの圧力を設定しており、当施設で使用している特定のバルブおよびチューブ構成では、これにより約1 mL/sの流速となります。

次に、ここから安全なフロープロトコル（NAAプロトコル）を選択し、スタートボタンを押して各測定を開始します。最初の数回の測定では、緩く吸着したプロテオリポソームが除去されるため、ピーク電流が減少することがあります。ピーク電流が一定になるまで測定を繰り返してください。

非活性溶液の流動が行われる第一相では、電流はゼロになります。乳糖を含む非活性溶液から活性溶液への交換により、膜の電位発生輸送活性が誘導されます。プロテオリポソーム内部に正電荷が蓄積し、SSMを介した正のカップリングによって、アンプが正の一時的な電流を検出します。

この正の結合電流は、活性化溶液からのオン信号（V exchange）と呼ばれます。非活性化溶液に戻すと、プロトン共輸送によって糖がリポソーム外へ輸送されます。この場合、負の結合電流が表示され、これはタンパク質の速度論的解析におけるいわゆるオフ信号となります。

膜バルブの電荷状態による切り替えが機械的および電気的なアーティファクトを発生させ、off信号が不明瞭であるため、on信号のみを使用します。幸いなことに、これらはタンパク質誘導信号が観察される前の時間範囲に限定されています。バルブ切り替えのアーティファクトとトランスポーター信号の間の50 millisecondsの遅延は、溶液が末端バルブからSSM Rapid Solution Exchangeの表面まで伝播するのに必要な時間であることに注意してください。SSMで行われるような手法は、典型的なリラクゼーション実験を表しています。

このような実験では、電流は時間依存的な定常状態前相を経て、一定の定常状態へと緩和します。反応サイクルの電流キネティクスの詳細は、定常状態前電流の形状と大きさから導き出すことができます。一方で、定常状態電流は、膜タンパク質の継続的なターンオーバーに関する情報を提供します。

プロテアリポソームがSSMに吸着したly結合系において、定常状態に至る前の電流は実質的に変化しません。リポソームの帯電のため、一定の定常状態電流が得られることはなく、測定される電流は徐々に減少します。輸送体電流は、回路解析を用いることで、測定されたly結合電流から算出することが可能です。

ここでは、pH 8.5から7.6の範囲における糖プロトン共輸送体（LacYなど）を用いた代表的な結果を示します。輸送電流は、反応サイクルの終盤にある電位発生的な反応によって支配されています。これらの条件下では、定常状態に達する前の過程は、定常状態の値に向かって単純に電流が上昇する形式となります。

これはその後、容量性結合により減衰します。ここでは、定常状態の輸送電流に関心があります。膜電位がない場合、これはピーク電流によって良好に近似されます。

したがって、異なる基質濃度におけるピーク電流をプロットすることで、Ali Meinキネティクスを解析することができます。ただし、ピーク電流の振幅を厳密に比較できるのは、単一のセンサーを用いて1回の実験で得られた場合のみであることに留意してください。その理由の一つに、吸収効率の変動性が挙げられます。pHをさらに下げると、単相の信号は二相になります。

最後に、輸送欠損型lag Y変異体において急速な過渡応答が認められます。この急速な過渡応答に続いて、小さく緩やかな負の成分が現れます。この負の成分は、ly共役系で測定される急速過渡電流に特徴的なものであり、膜容量の放電によって引き起こされます。

ここでは、ピーク電流は定常状態の輸送を表しているのではなく、イオンサイクルの初期における転移を電気発生的に裏付けるものであり、これはy変異体で定常状態の輸送が見られないこと、および野生型lag yでは低pHによって定常状態の輸送が抑制されることから明らかになります。これらの実験的根拠は、キネティックモデルに示されているlag yの反応サイクルにおける電荷転移のメカニズム的な解釈を提示しています。輸送欠損変異体、あるいは酸性条件下での野生型lag Yにおいて観察される高速な過渡応答は、急速で弱い電気発生的反応によるものであり、より高いpH値では、反応サイクルの後半に起こる主要な電気発生的反応が信号の支配的要因となります。この反応は、容量結合系における疑似細胞質へのプロトン放出を表すと提案されています。

これにより、Utesの強い相互作用によってLag yの定常状態輸送を表す過渡電流が生じます。SSMでは、組成の異なる溶液を交換する際に電気的アーティファクトが発生します。非活性化溶液と活性化溶液が、特にpHとイオン強度の点において、可能な限り類似していることを確認してください。

基質自体がアーティファクトを生成する場合があるため、コントロールを行う必要があります。タンパク質サンプルを添加する前に、必ずベースのSSMを用いて、特定の緩衝液系およびフロープロトコルにアーティファクトがないかを確認してください。タンパク質サンプルを添加した後は、基質と構造が類似した非基質を含む溶液を用いて、コントロール測定を行うことができます。

さらに、目的タンパク質を含まないリポソームまたは膜断片を用いて、基質のアーティファクトをテストすることが可能です。また、溶液に阻害剤を添加するか、あるいはピペットで添加することもできます。実験後、トランスポーター信号の阻害を測定するために直接ベントの出口に注入すると、タンパク質特異的な信号が消失し、溶液交換によるアーティファクトのみが残ります。

これにより、タンパク質のシグナルを容易に補正できます。吸着によるタンパク質の消失、リポソームの影響、またはタンパク質の分解が測定に影響していないことを確認してください。同一条件下でコントロール測定を繰り返すことで、最大20%までのシグナルの減衰（rundown）であれば許容範囲内であり、減衰が時間に比例して線形に起こると仮定することで補正可能です。

このセットアップは、当研究室における20年間の技術開発の成果です。また、速度論的解析のための高精度タイマーソリューションや、高価な基質の消費量を抑えた専門的なシステムも利用可能です。薬剤スクリーニングには、より高スループットな全自動セットアップを使用しています。

現在までに、この手法を用いて20種類以上の輸送体が特性解析されています。これには、輸送APA、呼吸鎖複合体、クール・トランスポーター、交換輸送体、さらには鉄チャネルなどが含まれます。したがって、標準的な電気生理学的手法で問題を解決できない場合は、SS Mase電気生理学の利用を検討してください。