糖尿病とメタボリックメモリーのゼブラフィッシュモデル

メタボリックメモリは、糖尿病合併症が持続し、正常血糖値は、薬学的に達成された後でも妨げられることなく進行する現象である。ここで我々はそれがメタボリックメモリの分裂伝染エピジェネティックな部品の検査を可能にするという点でユニークである糖尿病のゼブラフィッシュモデルを記述

この手順の全体的な目標は、1型糖尿病ゼブラフィッシュモデルを生成することであり、これを使用して糖尿病合併症の分子基盤を発見し、さらに重要なことに、その持続性の遺伝的基盤を決定するために使用できます。これは、最初に糖尿病誘発薬STZの一連の注射で高血糖を誘発し、魚を低温でインキュベーションすることによって達成されます。次に、3週間後、空腹時血糖値が決定され、高血糖状態が誘発されたことを確認し、薬物を停止してベータ細胞の回復を開始します。

次に、尾鰭を切断し、再生させて代謝記憶の遺伝的に伝染する要素を分離し、以前の高血糖環境の潜在的に複雑な要因を取り除きます。最後に、フィン再生アッセイを実施して、フィン再生の持続的な減少を文書化し、目的のアッセイを介してトランセクト組織に誘発された変化を特定します。糖尿病性ゼブラフィッシュモデルが既存のモデルよりも優れている点は、膵臓移植後の患者に見られるような代謝記憶を、真のU血糖環境で研究できることです。

これは、このモデルが、代謝記憶の根底にあるエピジェネティックな修飾の発見と糖尿病性合併症の持続性に利用されることを期待しています 糖尿病のゼブラフィッシュを生成するには、正常な魚の水で回復タンクを準備し、ヒュームフードの下に2つのフェノキシエタノールの1〜1000希釈で魚の水の麻酔タンクを準備します。0.09%塩化ナトリウムの2ミリリットルに6ミリグラムのSTZを加えて、ストレプトゾトシンまたはSTZの0.3%溶液を調製し、すぐに溶液を別のチューブの氷の上に置いた。コントロールに十分な生理食塩水を補給します。

魚は、27ゲージとハーフゲージの針を備えたハーフCCシリンジにSTZまたは制御溶液を充填し、気泡が閉じ込められないようにします。1匹の魚を麻酔水に入れ、遊泳動作が約1〜2分停止するまで待って麻酔をかけます。麻酔をかけたら、魚をペーパータオルの上に短時間置いて余分な水分を吸収し、魚をウェイボートに置いて重さを量ります。

次に、魚を固い面に置きます。次に、斜角を過ぎた針を腹側腹膜の後面に挿入し、注射後にTZ1グラムあたり0.35ミリグラムまたは同量の制御溶液を魚の腹腔に注入します。魚を回収水タンクに入れ、通常の遊泳活動を監視します。

実験に十分な量の魚を注入した後、通常の生きている水槽に移し、摂氏22〜24度の温度に保ちます。温度の低下は、高血糖の効率的な誘導に重要であり、非常に高い高血糖の長期状態を誘発し、誘導段階での頻繁な注射のスケジュールに従い、その後、ここに示すように毎週のメンテナンス注射を行って血液を採取します。FBGLを測定するには、5マイクロリットルの生理食塩水を含む各血液サンプルの標識PCRチューブを準備します。

魚に麻酔をかけた後、余分な水分を吸い取り、魚を顕微鏡スライドに置き、メスを使用して、蓋の基部にある頭を取り除き、スライド上に放出された血液を収集し、血液が凝固しないことを確認するために、滅菌された正常な生理食塩水のPCRチューブにすばやく追加しますピペッティングで上下に、血液が凝固しないことを確認しますすぐにサンプルを氷の上に置きます。チューブ内の液体の総量を測定し、5マイクロリットルの生理食塩水を差し引くことにより、血液サンプルの量を決定します。各PCRチューブから希釈した血液5マイクロリットルを1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに移し、製造元の指示に従って量子クロムグルコースアッセイキットを使用して血糖値を決定します。

魚を麻酔した後、ペトリ皿に入れ、解剖スコープの下に、滅菌サイズ10メスを使用して、アッセイの再生成長段階の最初の脂質気管分岐点に近位の直線を切断することにより、肩ひれを切断します。魚を摂氏33度の回収タンクに入れて、再生するヒレをイメージします。魚に麻酔をかけた後、フィンが完全に伸びるように広げ、カメラとNISエレメントソフトウェアを備えた解剖スコープを使用します。

1倍の拡大で画像を収集し、再生成長を測定します。画像を印刷し、画像Jソフトウェアと描画パッドを使用して、トレースの精度のために新しい成長の全領域をトレースします。影や水滴が存在しないことを確認し、各測定を5回行って平均を計算します。

測定値を正規化するには、背側腹軸に沿った切断部位の長さを測定し、以前に決定した領域をこの測定値で除算します。DM FISHのグループとそのコントロールを21日目に生成した後、グループのサブセットのFBGLを決定し、実験期間中、DMフィッシュを2つのサブグループに分割します。2 番目のグループの DM コントロールが STZ 注射を中止し、魚を常温でインキュベートするため、1 つのグループに対して毎週の STZ 注射を続けます。

14日以内に、これらのゼブラフィッシュは膵臓の再生を通じて正常な血中インスリンとグルコースコントロールを回復します。これらの魚は現在、代謝記憶またはMMと呼ばれ、薬物除去後30日目の魚は、このビデオで前述したように、コントロールDMおよびMM魚の蝭のひれを切断し、代謝記憶組織の成長を可能にします。60日目に30日間、魚を通常の水の状態に戻してヒレを再生します。

30〜60日の期間に再生した組織内で2回目の切断を行い、コドルフィン再生アッセイを実施し、組織を単離し、目的のアッセイを実施します。1型糖尿病ゼブラフィッシュは、網膜症と腎症の既知の二次合併症を示すだけでなく、切断後72時間で見られるように、追加の合併症である抱きかえの再生障害を示します。この合併症は、ここに示すように高血糖期の後に正常なグルコースコントロールを回復した魚の代謝記憶のために持続し、mmゼブラフィッシュは対照魚と比較すると約40%のヒレ再生の欠損を示し、その障害は切断後150日まで観察されています。

このビデオを見た後、ゼブラフィッシュの高血糖状態を開始する方法、空腹時血糖値を測定する方法、ヒレ再生研究を行う方法、そして最終的に代謝記憶魚を生成する方法についてよく理解できるはずです。