カルシウムの同時測定のための人間の心房筋細胞の分離

本手順の全体的な目的は、カルシウム・トランジェントと膜電流の同時測定に適したヒト心房筋細胞を単離することである。右心房検体は心臓開胸手術を受ける患者から採取され、迅速に搬送されて手順が開始される。本手順の最初のステップは、組織を洗浄し、小さな組織片に切断することである。

第2ステップでは、蛋白分解酵素を用いて組織を2段階で酵素消化し、心房筋細胞を単離します。最終ステップでは、カルシウム感受性蛍光色素を筋細胞にロードします。最終的に、エピ蛍光顕微鏡法とパッチクランプ法の併用により、カルシウムトランジェントを膜電流または活動電位と同時に記録します。

本手法は、心房細動などの心疾患の背景にある細胞内カルシウムハンドリング異常の分子基盤の理解に役立ちます。本手法を実演するのは、当研究室のシニアテクニシャンであるClaudia Liraです。冠動脈バイパス術または僧帽弁置換術のために開胸手術を受ける患者から採取したヒト心房組織は、搬送液を用いて速やかに研究室まで運搬してください。研究室に到着後、組織サンプルと溶液を10 cmディッシュに移します。次に、ハサミを使用して脂肪組織をおおまかに除去します。

次に、組織サンプルを量ります。細胞分離用に200〜600 mgを確保し、残りは生化学的解析のために液体窒素で凍結保存します。細胞分離用の組織を冷却したカルシウムフリー溶液が入ったディッシュに移し、組織を洗浄するため、1 mm³の細片に刻みます。

カルシウムフリー溶液とともにジャケット付きビーカーに移します。37 °Cまで加熱します。激しい気泡の発生を防ぐため、ピペットチップでキャップをしたラインから酸素を供給します。

マグネティックスターラーを用いて、組織を約3分間注意深く攪拌します。その後、組織を静置させます。次に、上清を200 micronのナイロンメッシュで注意深くろ過します。

組織の大部分はビーカー内に残しておく必要があります。ビーカーに37 °Cに加温したカルシウムフリー溶液を補充します。次に、ピンセットを用いてメッシュ上のろ過された組織塊をビーカーに戻し、洗浄手順を2回繰り返します。

手順のこの部分は、コラゲナーゼとプロテアーゼを含む37 °Cに加温した酵素溶液E1を20 milliliters準備することから始めてください。最終洗浄ステップの後、カルシウムフリー溶液を慎重に漉し、洗浄した組織をE1溶液に再懸濁させます。メッシュ上に回収された組織をビーカーに戻します。

懸濁液を10分間慎重に攪拌します。次に、10 millimolar 塩化カルシウムを 40 µL 加え、さらに35分間攪拌を続けます。その後、上清をナイロンメッシュで慎重にろ過します。

組織の大部分はビーカーに残しておく必要があります。コラゲナーゼIのみを含む酵素溶液E2を20 milliliters調製し、ビーカーに補充します。メッシュで回収した組織をビーカーに戻します。

その後、直ちに10 millimolar 塩化カルシウム溶液を 40 microliters 加えて2回目の消化を行い、適宜ハサミを用いて組織の塊を細かく刻みます。5分後、懸濁液をサンプリングし、顕微鏡下で細胞の解離状態を確認します。棒状の横紋心筋細胞が明確に観察されるまで、2〜3分おきにサンプリングを繰り返します。

その後、攪拌を停止し、組織を沈殿させます。沈殿後、上清をナイロンメッシュで注意深くろ過し、50 milliliterのプラスチックチューブに回収します。次に、組織を20 millilitersの保存溶液に懸濁させ、メッシュでろ過した組織片をビーカーに戻します。

緩やかな機械的撹拌により、細胞をさらに分散させます。20 milliliter ピペットを使用し、気泡の形成を避けるようにしてください。次に、上清をナイロンメッシュで丁寧にろ過し、ろ過後、回収した上清の両方を 90 5G で 10 分間遠心分離します。

細胞をペレットにするため、ペレットを乱さないように吸引して上清を除去します。各ペレットを室温で1.5 millilitersの保存溶液に懸濁します。次に、各チューブに10 millimolar塩化カルシウム溶液を7.5 microliters加え、10分間待ちます。

次に、塩化カルシウムをさらに 7.5 µL 加え、さらに 10 分間待ちます。待機後、10 mM 塩化カルシウムを 15 µL 三回目に加え、溶液中の塩化カルシウムの最終濃度を 0.2 mM に調整します。この単離の目的は、細胞内カルシウム測定に適した細胞を得ることにあります。

したがって、保存液からEGGAなどのカルシウム緩衝液を完全に除外することが極めて重要です。細胞懸濁液1.5 millilitersを2 millilitersマイクロ遠心チューブに移します。以降の手順は、蛍光カルシウムインジケーターの光感受性に留意して実行してください。

Flu O3。まず、1 mMのFlu O3ストック溶液を作製します。この溶液は-20 °Cで最大1週間保存可能です。

次に、1.5 mLの細胞懸濁液にflu oh 3:00 AMストック溶液を15 µL加えます。混合液を注意深く攪拌し、不透明なボックスの中で室温で10分間インキュベートします。インキュベート後、組織を約6,000 RPMで短時間遠心分離します。

次に、上清を捨て、ペレットを1.5 millilitersのバス溶液で再懸濁します。実験を開始する前に、脱エステル化のため、細胞懸濁液を約30分間静置します。その後、概説したプロトコルに従い、パッチクランプ法とエピ蛍光カルシウム測定を同時に行います。

心筋細胞を心房組織から単離し、セルファインダー顕微鏡スライドを用いて定量化した。平均細胞回収量から、慢性心房細動患者のサンプルでは細胞回収量が低下する傾向があることが明確に示された。Fluo-3をロードした心筋細胞を、カレントクランプ構成にて0.5 Hzで刺激して活動電位を誘発させたところ、調査した細胞の約90%に規則的な収縮が認められた。

この刺激に反応して、蛍光顕微鏡に切り替えることで、細胞収縮を開始させる筋小胞体からの活動電位誘発性カルシウム放出を可視化します。洞調律および心房細動の患者からの代表的な記録は、次のように示しています。患者の活動電位は通常、スパイクとドーム状の形態を示しますが、活動電位の三角形化と短縮は心房リモデリングの典型的な特徴です。

心房細動患者における細胞内カルシウム・トランジェントの同時記録により、心房細動患者由来の心筋細胞では拡張期カルシウムレベルの上昇とカルシウム・トランジェント振幅の減少が明らかになった。L型カルシウム電流を記録するため、4-アミノピリジンと塩化バリウムを用いてカリウム電流を遮断した。細胞は、保持電位-80 mV、-40 mVへの100 msのランプ波、および10 mVへの100 msのテストパルスを用い、ボルテージクランプ構成にて0.5 Hzで刺激した。

代表的な記録は、心房細動がL型カルシウム電流の減少に関連していることを示しています。同様に、心房細動においては、拡張期カルシウムレベルが上昇し、カルシウムトランジェントの振幅は低下していました。

非選択的βアドレナリン受容体作動薬であるイソプロテレノールの適用により、L型カルシウム電流および細胞質カルシウムトランジェントの振幅が増加しました。両群において、この結果は細胞が正常なβアドレナリン作動性シグナル伝達カスケードを有していることを示唆しています。以上の結果から、本手法により、パッチクランプ法とカルシウムトランジェント測定の同時実施に適した、高品質でカルシウム耐性の高い心筋細胞が得られることが示されました。

さらに、得られた心筋細胞は、細胞短縮能の測定、免疫染色、またはTTU染色に有用であると考えられます。