Name: カルシウムの同時測定のための人間の心房筋細胞の分離 2 +過渡と膜電流 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 学ぶ 人心房筋細胞の分離法とカルシウム過渡・膜電流の同時測定技術。パッチクランプと蛍光顕微鏡を用いて、心房細動などの心疾患における細胞内カルシウム動態異常の分子基盤を解明する研究方法を習得できます。

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加えて、我々は彼らの優れた技術サポートのために人間の心房組織とクラウディアLiebetrau、カトリンKupserとラモナナーゲルの提供のためにハイデルベルク大学で心臓外科医に感謝します。のCa 2 +トランジェント測定の確立中に彼の役立つ提案やアドバイスのためにもアンディ·W·トラフォードに感謝します。彼らは、細胞電気生理学と心筋細胞分離における基本的なテクニックやスキルを学ぶために私たちを提供する機会をドレスデン工科大学：著者は、薬理学および毒物学の部門（ウルスラレイブンズ頭）のメンバーに彼らの最も深い感謝の意を表したい。 著者の研究は、ドイツ研究財団（Do769/1-1-3）、心房細動コンピテンスネットワークを通じて教育研究のドイツ連邦環境省（01Gi0204）と循環器病研究のためのドイツ語センターを通じて欧州連合によってサポートされていますEuの心房細動におけるトランスレーショナルリサーチのためropeanネットワーク（EUTRAF、FP7-HEALTH-2010、大規模な統合プロジェクト、提案番号261057）および欧州·北米の心房細動·リサーチ·アライアンス（ENAFRA）財団Leducq（07CVD03）の付与。 ビデオファイルに示す概略図はセルヴィエ医療技術を用いて製造された。

実験プロトコルは、ローカル倫理委員会によって承認される必要があり、すべての患者は書面によるインフォームドコンセントを与える必要があります。我々の研究は、ハイデルベルク大学（＃2011-216N-MA）、医学部マンハイムの倫理委員会によって承認され、人類の福祉のためにすべての、制度的、国内および国際的なガイドラインに準拠して行った。すべての患者は書面によるインフォームドコンセントを与えた。 0。ヒト心房組織の取得心肺バイパス移植のための心臓切開手術を受ける患者におけるルーチンカニュレーション手順の間、右心耳の先端部は、通常、除去され、心房心筋細胞の単離に使用することができる。筋細胞Cを防止、BDM、収縮抑制剤、切除後の組織サンプルは、2,3 -ブタンジオンモノオキシムを（ 表I含む滅菌のCa 2 +を含まない輸送溶液を50ミリリットルファルコンチューブにすぐに転送されますontracture）。 30と45分の間の輸送時間で、我々は孤立した心房心筋細胞の数と質の両方に対する冷却または酸素化の明確な利点を認識しませんでした。研究室への一般的な輸送にはできるだけ迅速にする必要があります。長い輸送時間が避けられない場合は、酸素溶液中で4℃輸送℃で有利かもしれない。 1。 Prearrangements <ol><li>ジャケット付ビーカー（ 表II）の温度を制御thermocirculator、スイッチオン。ビーカー内の温度が37℃に等しいことを確認してください全体の分離プロセス全体ビーカー内の温度を一定に維持するために、ガラス蓋付きビーカーをカバーしています。 </li><li> 3ガラス製ビーカーにコラゲナーゼIおよびプロテアーゼXXIVを秤量し、室温で保管してください。酵素は、使用直前に希釈することができる。 </li><li>のCa 2 20mlのを保存+ 4でペトリ皿に自由溶液℃の</li><li>のCa 2ストア250ミリリットル37℃の水浴中で+自由溶液℃に</li></ol> 2。ティッシュの清掃<ol><li>ペトリ皿（〜直径10cm）に輸送ソリューションと一緒に組織サンプルを転送し、大体ハサミを使用して脂肪組織を削除します。 </li><li>組織試料を秤量する。 200〜600 mgの細胞単離のために使用される。残りの組織が保存生化学分析のために液体窒素中で凍結することができる。 </li><li> 20ミリリットルのCa 2 + 4で無料のソリューション°Cを含むペトリ皿に組織サンプルを転送し（ステップ1.3を参照）、約1mm 3サイズでの小さなチャンクに組織サンプルをチョップ。 </li><li>次の手順は、100％O 2、37℃で、連続処刑の下に実行されるべきである。ピペットチップは、強力な泡立ちを避けるために、連続した空気流を生成するために、酸素チューブに配置することができる。 </li><li>中のCa 2 +を含まない溶液と一緒にティッシュの塊を転送ジャケットビーカーへと磁気攪拌棒で約3分間注意深くかき混ぜる。 </li><li>攪拌を停止し、組織の塊は数秒のために落ち着くことができます。ナイロンメッシュ（200ミクロン、 表II）を通して上清を慎重にひずみ。メッシュから鉗子を使用してビーカーに拘束され、組織の塊を返します。 </li><li>リフィルのCa 2ビーカー+送料液及び洗浄工程を2.4と2.5を2回繰り返す。 </li></ol> 3。最初の酵素消化<ol><li>コラゲナーゼやプロテアーゼを含んだ20ミリリットル酵素溶液E1（ 表I）で組織の塊を再停止し、10分間注意深くかき混ぜる。 </li><li> 20μMのCa 2 +の最終濃度を得るために、10のCaCl 2溶液を40μLを加える。 </li><li> 35分後には、組織の塊のほとんどがビーカーに残るような方法でナイロンメッシュ（200ミクロン、 表II）を注意深く上清を負担。残りを返すメッシュからビーカーに組織塊を雨が降った。 </li></ol> 4。第二酵素消化<ol><li>私はわずか20ミリリットル酵素溶液E2含むコラゲナーゼ（ 表I）で再び組織の塊を再懸濁します。 20μMのCa 2 +の最終濃度を得るために、すぐに10のCaCl 2溶液を40μLを加える。 </li><li>第二消化中さらに時折組織血栓をチョップするはさみを使用しています。 </li><li> 5分後、細胞の解離をチェックするパスツールピペットを使用してサンプルを取る。棒状、横紋心筋が表示されるまで、この2〜3分ごとに繰り返します。 </li><li>攪拌を停止し、組織の塊が約20〜30秒間、落ち着くことができます。 </li><li> 50ミリリットルファルコンチューブ（チューブ）にナイロンメッシュ（200ミクロン、 表II）を注意深く上清を負担。メッシュからビーカーに拘束され、組織の塊を返します。 </li><li> 20ミリリットルストラでビーカー内の組織チャンクを再懸濁さらにGE溶液（ 表I）10とディスペンサーと20ミリリットル血清ピペットを用いて穏やかな機械的粉砕により細胞を解離する。気泡が細胞の生存と品質に有害であるので、気泡の形成を避けるようにしてください。 </li><li> 50ミリリットルファルコンチューブ（チューブB）にナイロンメッシュ（200ミクロン、 表II）を注意深く上清を負担。 </li></ol> 5。決勝のCa 2 +濃度の最終準備と調整<ol><li> 10分間、95×gでファルコンチューブAとB（ステップ4.5および4.7を参照）の両方を遠心します。 </li><li>吸引により慎重に両方のチューブから上清を取り除きます。ペレットを乱さないようにしてください。上清を捨てる。 </li><li> 1.5 mlのストレージソリューション（ 表I）各（室温）の両方でペレットを再懸濁する。 </li><li> 2回ずつファルコン〜10のCaCl 2溶液の7.5μLを加え、慎重にかき混ぜる。各ステップの後に10分間インキュベートする。 </li><li>0.2mMの最終のCa 2 +濃度を得るために10のCaCl 2溶液15μlのを追加します。 </li></ol> 6。蛍光灯のCa 2 +指示薬フルオ-3 AM（ 図1）と筋細胞のロード<ol><li> 2 mlのマイクロ遠心チューブ（エッペンドルフチュー​​ブ）内に細胞懸濁液1.5mlの（チューブおよび/またはチューブB）に移す。 </li><li>次の手順は、蛍光のCa 2 +インジケーターフルオ-3の光感度を考慮して実行する必要があります。 </li><li>プルロニックF-127（ 表III）原 ​​液（20％無水DMSO中w / v）で取得するための44μlのフルオ-3の膜透過性のアセトキシメチルエステル誘導体（フルオ-3 AM、 表III）50μgのを溶かす1mMのフルオ3、最大で1週間、-20℃で保存することができる原液、AM。 </li><li> 15μlのを追加フルオ-3は1.5の細胞懸濁液（ステップ6.1を参照）を振とうを含むマイクロチューブに原液AM慎重に。 </li><li>光学的に不透明なボックスで10分間細胞懸濁液をインキュベートする。 </li><li>簡単に言えば、約6,000 rpmで遠心。 </li><li>上清を捨て、1.5 mlの浴溶液（ 表IV）でペレットを再懸濁する。 </li><li>実験を開始する前に脱エステル化のために約30分間、細胞懸濁液にしておきます。 </li></ol> 7。同時パッチクランプと落射蛍光Ca 2 +の測定パッチクランプ測定は、この見直しの主要な話題ではないので、我々はこの技術の深さの説明に多くを提供する他の出版物への興味を持った読者を参照してください。11-14完全を期すために、我々は測定するためのプロトコルの簡単な要約を提供する活動電位またはL型Ca 2 +電流は、同時のCa 2 +過渡録音と一緒に両方。 実験中筋細胞を風呂solutiと37℃で灌流さ急速灌流システム（Octaflow IITM、ALA科学機器、NY）を用いて、（ 表IV）で。電圧クランプ実験のために、K +電流を浴溶液に4 -アミノピリジン（5ミリモル/ L）及び塩化バリウム（0.1ミリモル/ L）を添加することによってブロックされる。ホウケイ酸ガラス微小電極が使用され、ピペット溶液（ 表V）で満たされたときMΩ2-5の抵抗を傾けるしている必要があります。フルオ-3に加えて（ステップ6を参照）筋細胞のローディングAM、フルオ3はピペット溶液（ 表V）に含まれている。蛍光は488 nmで励起して放出された光は、（&lt;520 nm）での[Ca 2 +] iは仮定に変換されます<img alt="式（1）" fo:content-width="1.540in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1.jpg" /> ここで、k Dフルオ-3（864のn =解離定数M）、F =フルオ-3蛍光;各実験の終了時に得られたF = 最大のCa 2 + -飽和蛍光12の両方の電気信号及び落射蛍光のCa 2 +信号が同時に記録される。活動電位は1.2倍しきい値強度の1ミリ秒電流パルスを使用して、現在のクランプモードで0.5 Hzで刺激される。 L型Ca 2 +電流は、100ミリ秒に続いて、高速のNa +電流を不活性化するために-40 mVまで-80 mVの、100ミリ秒ランプパルスの保持電位を用いた電圧クランプモードで測定されている0.5 Hzで+10 mVのにテストパルス。

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</ol>

ワージントン生化学社は、ビデオファイルの生産コストをカバーすることによって、この出版物を支持した。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公表することを決定、または原稿の準備で何の役割を持っていた。

ここでは、心臓切開手術を受けた患者から得られた右心房付属器からのヒト心房筋細胞の単離のための方法が記載されている。細胞質のCa 2の測定のために、これらの心筋細胞を使用するために、我々は+貯蔵溶液からEGTAを省略して、以前に記載された方法4-11に適合。 すでに1970年には筋細胞が+消化中のCa 2の存在下で解離しているが、それらのすべては、したがって拘縮および非生存。16,17にあったことが観察された、細胞単離のCa 2 +を含まない溶液中で行われる。しかし、のCa 2の生理的濃度の再導入は急速+ Ca 2 +の流入および細胞死をもたらした。これは、もともとはジマーマンとフルスマンによって灌流心の中で観察されたCa 2 +のパラドックス現象として記載されている。7.0のpHの低下、など、分離培地の18修正&lt;22のCa 2 +パラドックスを防止するために提案されているストレージを含む溶液EGTAで&gt; 19タウリン20又はCa 2 +少量の添加（ステップ3.2および4.1を参照のこと）、21ならびに単離された筋細胞の記憶（商標）17は、しかし、のCa 2 +が EGTAを介してバッファリングのCa 2 +過渡二相崩壊におけるL型Ca 2 +電流誘起のCa 2 +過渡振幅および結果の振幅を減少させることは周知である。23そこで、EGTAを省略典型的なプロパティと相性減衰でのCa 2 +トランジェントを得るために全体の分離プロセス全体。のCa 2から細胞を保護するために+パラドックス我々は、0.2 mMのまで段階的にストレージソリューションの最終のCa 2 +濃度を増加させた。 コラゲナーゼの選択は、おそらく成功した筋細胞分離のための最も重要なステップです。従来のコルagenasesはクロストリジウムヒストリチカムから得られた粗製の製剤であり、他のプロテイナーゼ、polysaccharidasesとリパーゼの数に加えて、コラゲナーゼを含んでいます。彼らの一般組成のコラゲナーゼに基づいて、異なるタイプに細分化されます24ワージントンコラゲナーゼ·タイプIとIIが正常に我々の現在記述されたプロトコルでは、人間の心房筋細胞を単離する。4-10,15,25-30ために使用されてきた私たちは、コラゲナーゼの使用をお勧めします我々はまた、コラゲナーゼタイプIIを使用して生細胞の許容量を得ることができたものの、Iを入力します。しかしながら、単一のコラゲナーゼタイプ内の酵素活動に関する重要なバッチ間変動がある。これらのバリエーションは、慎重なバッチの選択と分離手順を最適化するための様々なバッチのテストが必要。ワージントン生化学株式会社（からオンラインで利用可能なバッチ·選択ツール<a href="http://www.worthington-biochem.com/cls/match.php" target="_blank">http://www.worthington-bio</a>chem.com / CLS / match.php）は、ヒト心房筋細胞を単離するのに適していることが示された組成物で使用可能なバッチを見つけるために使用することができる。現在、我々は、コラゲナーゼは、250 U / mgのコラゲナーゼ活性を345 U / mgでcaseinase活動、2.16 U / mgのクロストリパイン活性および0.48 U / mgのトリプシン活性（ロット＃49H11338）Iを入力してください。 本稿に記載された手順を用いて得られた細胞をパッチクランプ研究のCa 2 +トランジェント測定およびまた両方図15の組合せに対して8時間以内に使用することができ、これらの細胞は電場刺激に応答して細胞の収縮の測定を可能パッチクランプピペットを（未発表の観察）を使用して、または電気刺激。

パッチクランプ法と細胞のCa 2探査による心臓イオンチャネルの電気生理学的特性を研究+異常が孤立した心筋細胞を必要とする処理。これらは通常、消化酵素に対する心臓組織サンプルのインビトロ曝露（コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、ペプチダーゼ等）後に得られる。 1955 2で実行可能な心筋細胞の単離の最初の報告以降のプロトコルの多量は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、モルモットおよびヒトを含む様々な種から単心房および心室の心筋細胞を収穫するために開発されている。このレビューでは、人間の心房筋細胞の分離に焦点を当てています。我々はワージントン生化学社、USA（が提供する&quot;ワージントン組織解離ガイド&quot;を参照して他の種からの心筋細胞を単離するための手順について<a href="http://www.tissuedissociation.com" target="_blank">www.tissuedissociation.com</a> ）。 らによって記載されている方法から派生しています。3ここでは、するために以前に公表されたメソッドから構成されている技術は、のステップバイステップの説明を提供パッチクランプ実験のためだけでなく、同時に細胞内Ca 2 +測定のためだけでなく、適切な心房筋細胞を得る。4-11

<table><tbody><tr><td> </td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;輸送溶液&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td>&lt;em&gt;保存溶液&lt;/em&gt;: 1%</td></tr><tr><td>BDM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31550</td><td>&lt;em&gt;輸送溶液&lt;/em&gt;: 30</td></tr><tr><td>DL-β-ヒドロキシ酪酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6501</td><td>&lt;em&gt;保存溶液&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>&lt;em&gt;輸送溶液&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+不含溶液&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;酵素溶液E1およびE2&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;保存溶液&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>L-グルタミン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1251</td><td>&lt;em&gt;保存溶液&lt;/em&gt;: 70</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;輸送溶液&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;$\text{Ca}^{2+}$不含溶液&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;酵素溶液E1およびE2&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;保存溶液&lt;/em&gt;: 20</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>&lt;em&gt;輸送溶液&lt;/em&gt;: 1.2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+不含溶液&lt;/em&gt;: 1.2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;酵素溶液E1およびE2&lt;/em&gt;: 1.2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;保存溶液&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9397</td><td>&lt;em&gt;輸送溶液&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+除去溶液&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;酵素溶液E1およびE2&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td>&lt;em&gt;輸送溶液&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+不含溶液&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;酵素溶液E1およびE2&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>&lt;em&gt;輸送溶液&lt;/em&gt;: 100&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+不含溶液&lt;/em&gt;: 100&lt;br/&gt; &lt;em&gt;酵素溶液E1およびE2&lt;/em&gt;: 100</td></tr><tr><td>タウリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86330</td><td>&lt;em&gt;輸送溶液&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;$\text{Ca}^{2+}$不含溶液&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;酵素溶液E1およびE2&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;保存液&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ I</td><td><a href="http://www.worthington-biochem.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Worthington</a></td><td>4196</td><td>&lt;em&gt;酵素溶液E1およびE2&lt;/em&gt;286 U/ml</td></tr><tr><td>プロテアーゼXXIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8038</td><td>&lt;em&gt;酵素溶液E1およびE2&lt;/em&gt;5 U/ml*</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;輸送溶液&lt;/em&gt;: 7.00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+不含溶液&lt;/em&gt;: 7.00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;酵素溶液E1およびE2&lt;/em&gt;: 7.00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;保存溶液&lt;/em&gt;: 7.40</td></tr><tr><td>で調整した</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;輸送溶液&lt;/em&gt;1 M NaOH&lt;br/&gt; &lt;em&gt;$\text{Ca}^{2+}$不含溶液&lt;/em&gt;1 M NaOH&lt;br/&gt; &lt;em&gt;酵素溶液E1およびE2&lt;/em&gt;1 M NaOH&lt;br/&gt; &lt;em&gt;保存液&lt;/em&gt;1 M KOH</td></tr><tr><td colspan="4">特に断りのない限り、濃度はmMで表記。BDM：2,3-ブタンジオンモノオキシム。*Protease XXIVはEnzyme solution E1にのみ含まれている。</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表I. 溶液。&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ナイロンメッシュ (200 &amp;#956;m)</td><td>VWR-Germany</td><td>510-9527</td><td></td></tr><tr><td>ジャケット付き反応ビーカー</td><td>VWR</td><td>KT317000-0050</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表II. 特定装置&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3 AM（特別パッケージ）</td><td>Invitrogen</td><td>F-1242</td><td></td></tr><tr><td>プルロニック F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表III. 心筋細胞へのFluo-3 AMローディングに使用する試薬&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-アミノピリジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A78403</td><td>&lt;em&gt;バス溶液&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>塩化バリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342920</td><td>&lt;em&gt;バス溶液&lt;/em&gt;: 0.1</td></tr><tr><td>CaCl2 &amp;#215; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td>&lt;em&gt;バス溶液&lt;/em&gt;: 2</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>&lt;em&gt;バス溶液&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td>&lt;em&gt;バス溶液&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;バス溶液&lt;/em&gt;: 4</td></tr><tr><td>MgCl₂ &amp;#215; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td>&lt;em&gt;バス溶液&lt;/em&gt;: 1</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>&lt;em&gt;バス溶液&lt;/em&gt;: 140</td></tr><tr><td>プロベネシド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761</td><td>&lt;em&gt;バス溶液&lt;/em&gt;: 2</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;バス溶液&lt;/em&gt;: 7.35</td></tr><tr><td>〜で調整した</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;バス溶液&lt;/em&gt;1 M HCl</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表IV. パッチクランプ用バス溶液&lt;/strong&gt; *4-アミノピリジンおよびBaClは、ボルテージクランプ実験にのみ使用した。</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DL-アスパラギン酸カリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2025</td><td>&lt;em&gt;溶液をピペットで分注する&lt;/em&gt;: 92</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>&lt;em&gt;溶液をピペットで分注する&lt;/em&gt;: 0.02</td></tr><tr><td>GTP-Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9002</td><td>&lt;em&gt;溶液をピペットで分注する&lt;/em&gt;: 0.1</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td>&lt;em&gt;溶液をピペットで分注する&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;溶液をピペットで分注する&lt;/em&gt;: 48</td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>&lt;em&gt;溶液をピペットで分注する&lt;/em&gt;: 1</td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td>&lt;em&gt;溶液をピペッティングする&lt;/em&gt;: 4</td></tr><tr><td>Fluo-3</td><td>Invitrogen</td><td>F3715</td><td>&lt;em&gt;溶液をピペットで分注する&lt;/em&gt;: 0.1</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>7.20</td></tr><tr><td>～で調整した</td><td></td><td></td><td>1 M KOH</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表V. パッチクランプ用ピペット溶液*。 &lt;/strong&gt;*実験当日は、ピペット溶液は使用直前まで氷上で保存する。**実験当日は、1 mMストック溶液からFluo-3を添加する。</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

カルシウムの同時測定のための人間の心房筋細胞の分離<sup&gt; 2 +</sup&gt;過渡と膜電流

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

パッチクランプ法と心臓細胞のCa 2 +の処理異常の探査と心臓イオンチャネルの電気生理学的特性の研究では、孤立した心筋細胞を必要とします。さらに、これらの技術を用いて患者から心筋細胞を調査する可能性は、例えば心房細動（AF）などの心臓疾患の分子基盤を解明する貴重な要件である。1は、ここでは両方に適しているヒト心房筋細胞の単離のための方法を記載パッチクランプ研究と細胞内Ca 2 +濃度の同時測定。まず、開胸手術を受けた患者から得られた右心耳は、小さな組織の塊（ &quot;チャンク法&quot;）に切断し、+を含まない溶液のCa 2で洗浄されています。その後、組織の塊を20μMのCa 2 +とソリューションを含むコラゲナーゼおよびプロテアーゼで消化されています。その後、隔離された筋細胞はハーヴです組織懸濁液の濾過と遠心分離によりSTED。最後に、セル記憶溶液中のCa 2 +濃度を0.2mMの段階的に調整される。我々は簡単に+とCa 2 +の分離の過程でバッファリングし、また活動電位と膜電流の代表的な録音を提供し、両方一緒に同時のCa 2 +トランジェント測定、これらの孤立した筋細胞で行わでのCa 2の意味を議論する。

図2Aは、単離されたヒト右心房筋細胞から3つの代表的な例を示しています。我々はCellFinder顕微鏡スライド（上の細胞懸濁液（ステップ5.5）10μlのピペットで細胞収率定量化する<a href="http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html" target="_blank">http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.htmlを</a> ）。 16.5±3.1 cells/10液（nは= 29）対5.1±2.3 cells/10μL： 図2Bにおいて平均細胞の収量は明らかに慢性AF（CAF）が低いセルの利回りの傾向患者サンプル（チューブがあることを示すそれぞれSRとCAFで（N = 10）、P &lt;0.05;チューブB：17.9±3.9 cells/10液（N = 29）対5.9±SRとCAFで2.0 cells/10液（N = 9）、それぞれに、p = 0.107）。 活動電位の測定および細胞質のCa 2 +過渡電流の同時録画の代表例を図3に示されている。調べた細胞、Tの約90％で彼はアクション電位トリガのCa 2 +放出が明確と通常細胞の収縮を引き起こす。既報の通り、細胞の整合性のために認められた指標である静止膜電位は、-73.9平均約±2.7 mVの（N = 10分の23筋/患者）及び-77.7±1.8 mVの（N = 8分の19筋/患者）SRとCAFであった（P&gt; 0.05）。15 図4は、電位依存性L型Ca 2 +電流と細胞質のCa 2 +トランジェントの代表、同時録画を示しています。非選択的β-アドレナリン受容体アゴニストイソプレナリン（1μM）の適用は、無傷のβ-アドレナリン作動性シグナル伝達カスケードを示唆し、私はCa、Lと細胞質のCa両方の振幅2 +トランジェントを向上させます。 <img alt="図1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1.jpg" /> Figure 1。筋のFluo-3のフローチャートは、（ステップ6.1から6.5を参照）プロトコルをロードしています。 M / V、質量/体積。 <img alt="図2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2.jpg" /> 図2。ストレージソリューションの1時間後、単離されたヒト右心房筋細胞。Bは、ストレージソリューションのセル10μlに数え細胞収率の±SEM（ステップ5.5を参照）を意味します。 nは、各グループ内製剤の数を指す。 *はp &lt;0.05。 <img alt="図3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3.jpg" /> アクション電位トリガのCa 2洞調律から心房筋細胞における+トランジェント（CAT）とCHRの図3。代表レコーディングプロピオン心房細動の患者。トップ：刺激（0.5ヘルツ）に使用注入電流膜（I M）。下：膜電位（V M）、およびトリガ猫（下）の同時記録。 （フォークトらの許可を得て再プロット。2012）15 <img alt="図4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4.jpg" /> L型Ca 2上イソプレナリン（1μM）の効果図4代表的録音+現在のトリガ型のCa 2洞調律、慢性心房細動の患者からの心房筋細胞における+トランジェント（CAT）。トップ：電圧クランププロトコル（0.5 Hz）です。下：現在の総純膜の同時記録（I M）、主にL型Ca 2 +電流（中央）とトリガ猫（下）を反映している。 （フォークトから許可を得て再プロット、ら2012年）15 <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table1.jpg" alt="表1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table1highres.jpg" /> 表Iソリューション。 <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table2.jpg" alt="表2" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table2highres.jpg"/> 表II。特定の機器。 <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table3.jpg" alt="表3" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table3highres.jpg"/> 表III。フルオ-3と筋細胞のローディングのための物質がAM。 <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table4.jpg" alt="表4" fo:conteNT-幅= &quot;2.5インチ&quot;のfo：SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50235/50235table4highres.jpg&quot; /&gt; 表IV。パッチクランプ用浴溶液。 <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table5.jpg" alt="表5" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table5highres.jpg"/> パッチクランプ*表V.ピペット溶液。

我々は、細胞内Caために使用することができ、ヒト心房筋細胞の単離を記載<sup&gt; 2 +</sup電気生理学的パッチクランプ研究との組み合わせで&gt;測定。

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

本手順の全体的な目的は、カルシウム・トランジェントと膜電流の同時測定に適したヒト心房筋細胞を単離することである。右心房検体は心臓開胸手術を受ける患者から採取され、迅速に搬送されて手順が開始される。本手順の最初のステップは、組織を洗浄し、小さな組織片に切断することである。第2ステップでは、蛋白分解酵素を用いて組織を2段階で酵素消化し、心房筋細胞を単離します。最終ステップでは、カルシウム感受性蛍光色素を筋細胞にロードします。最終的に、エピ蛍光顕微鏡法とパッチクランプ法の併用により、カルシウムトランジェントを膜電流または活動電位と同時に記録します。本手法は、心房細動などの心疾患の背景にある細胞内カルシウムハンドリング異常の分子基盤の理解に役立ちます。本手法を実演するのは、当研究室のシニアテクニシャンであるClaudia Liraです。冠動脈バイパス術または僧帽弁置換術のために開胸手術を受ける患者から採取したヒト心房組織は、搬送液を用いて速やかに研究室まで運搬してください。研究室に到着後、組織サンプルと溶液を10 cmディッシュに移します。次に、ハサミを使用して脂肪組織をおおまかに除去します。次に、組織サンプルを量ります。細胞分離用に200〜600 mgを確保し、残りは生化学的解析のために液体窒素で凍結保存します。細胞分離用の組織を冷却したカルシウムフリー溶液が入ったディッシュに移し、組織を洗浄するため、1 mm³の細片に刻みます。カルシウムフリー溶液とともにジャケット付きビーカーに移します。37 °Cまで加熱します。激しい気泡の発生を防ぐため、ピペットチップでキャップをしたラインから酸素を供給します。マグネティックスターラーを用いて、組織を約3分間注意深く攪拌します。その後、組織を静置させます。次に、上清を200 micronのナイロンメッシュで注意深くろ過します。組織の大部分はビーカー内に残しておく必要があります。ビーカーに37 °Cに加温したカルシウムフリー溶液を補充します。次に、ピンセットを用いてメッシュ上のろ過された組織塊をビーカーに戻し、洗浄手順を2回繰り返します。手順のこの部分は、コラゲナーゼとプロテアーゼを含む37 °Cに加温した酵素溶液E1を20 milliliters準備することから始めてください。最終洗浄ステップの後、カルシウムフリー溶液を慎重に漉し、洗浄した組織をE1溶液に再懸濁させます。メッシュ上に回収された組織をビーカーに戻します。懸濁液を10分間慎重に攪拌します。次に、10 millimolar 塩化カルシウムを 40 µL 加え、さらに35分間攪拌を続けます。その後、上清をナイロンメッシュで慎重にろ過します。組織の大部分はビーカーに残しておく必要があります。コラゲナーゼIのみを含む酵素溶液E2を20 milliliters調製し、ビーカーに補充します。メッシュで回収した組織をビーカーに戻します。その後、直ちに10 millimolar 塩化カルシウム溶液を 40 microliters 加えて2回目の消化を行い、適宜ハサミを用いて組織の塊を細かく刻みます。5分後、懸濁液をサンプリングし、顕微鏡下で細胞の解離状態を確認します。棒状の横紋心筋細胞が明確に観察されるまで、2〜3分おきにサンプリングを繰り返します。その後、攪拌を停止し、組織を沈殿させます。沈殿後、上清をナイロンメッシュで注意深くろ過し、50 milliliterのプラスチックチューブに回収します。次に、組織を20 millilitersの保存溶液に懸濁させ、メッシュでろ過した組織片をビーカーに戻します。緩やかな機械的撹拌により、細胞をさらに分散させます。20 milliliter ピペットを使用し、気泡の形成を避けるようにしてください。次に、上清をナイロンメッシュで丁寧にろ過し、ろ過後、回収した上清の両方を 90 5G で 10 分間遠心分離します。細胞をペレットにするため、ペレットを乱さないように吸引して上清を除去します。各ペレットを室温で1.5 millilitersの保存溶液に懸濁します。次に、各チューブに10 millimolar塩化カルシウム溶液を7.5 microliters加え、10分間待ちます。次に、塩化カルシウムをさらに 7.5 µL 加え、さらに 10 分間待ちます。待機後、10 mM 塩化カルシウムを 15 µL 三回目に加え、溶液中の塩化カルシウムの最終濃度を 0.2 mM に調整します。この単離の目的は、細胞内カルシウム測定に適した細胞を得ることにあります。したがって、保存液からEGGAなどのカルシウム緩衝液を完全に除外することが極めて重要です。細胞懸濁液1.5 millilitersを2 millilitersマイクロ遠心チューブに移します。以降の手順は、蛍光カルシウムインジケーターの光感受性に留意して実行してください。Flu O3。まず、1 mMのFlu O3ストック溶液を作製します。この溶液は-20 °Cで最大1週間保存可能です。次に、1.5 mLの細胞懸濁液にflu oh 3:00 AMストック溶液を15 µL加えます。混合液を注意深く攪拌し、不透明なボックスの中で室温で10分間インキュベートします。インキュベート後、組織を約6,000 RPMで短時間遠心分離します。次に、上清を捨て、ペレットを1.5 millilitersのバス溶液で再懸濁します。実験を開始する前に、脱エステル化のため、細胞懸濁液を約30分間静置します。その後、概説したプロトコルに従い、パッチクランプ法とエピ蛍光カルシウム測定を同時に行います。心筋細胞を心房組織から単離し、セルファインダー顕微鏡スライドを用いて定量化した。平均細胞回収量から、慢性心房細動患者のサンプルでは細胞回収量が低下する傾向があることが明確に示された。Fluo-3をロードした心筋細胞を、カレントクランプ構成にて0.5 Hzで刺激して活動電位を誘発させたところ、調査した細胞の約90%に規則的な収縮が認められた。この刺激に反応して、蛍光顕微鏡に切り替えることで、細胞収縮を開始させる筋小胞体からの活動電位誘発性カルシウム放出を可視化します。洞調律および心房細動の患者からの代表的な記録は、次のように示しています。患者の活動電位は通常、スパイクとドーム状の形態を示しますが、活動電位の三角形化と短縮は心房リモデリングの典型的な特徴です。心房細動患者における細胞内カルシウム・トランジェントの同時記録により、心房細動患者由来の心筋細胞では拡張期カルシウムレベルの上昇とカルシウム・トランジェント振幅の減少が明らかになった。L型カルシウム電流を記録するため、4-アミノピリジンと塩化バリウムを用いてカリウム電流を遮断した。細胞は、保持電位-80 mV、-40 mVへの100 msのランプ波、および10 mVへの100 msのテストパルスを用い、ボルテージクランプ構成にて0.5 Hzで刺激した。代表的な記録は、心房細動がL型カルシウム電流の減少に関連していることを示しています。同様に、心房細動においては、拡張期カルシウムレベルが上昇し、カルシウムトランジェントの振幅は低下していました。非選択的βアドレナリン受容体作動薬であるイソプロテレノールの適用により、L型カルシウム電流および細胞質カルシウムトランジェントの振幅が増加しました。両群において、この結果は細胞が正常なβアドレナリン作動性シグナル伝達カスケードを有していることを示唆しています。以上の結果から、本手法により、パッチクランプ法とカルシウムトランジェント測定の同時実施に適した、高品質でカルシウム耐性の高い心筋細胞が得られることが示されました。さらに、得られた心筋細胞は、細胞短縮能の測定、免疫染色、またはTTU染色に有用であると考えられます。

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Biology

生物学

KVチャネル機能不全は、心臓不整脈に関連付けられています。我々はKvをチャネルの補助サブユニットのノックアウトマウスからの心房と心室の心筋細胞を単離するための体系的なプロトコルを利用するような不整脈を引き起こす分子メカニズムを研究するために。隔離された心筋細胞は、その後すぐに携帯電気生理学的研究、生化学的または免疫蛍光法（IF）のアッセイのために使用することができます。...

マウス心房と心室の心筋細胞における分離とKvチャンネル録音

心疾患の細胞に基づく現在の知識は、ほとんどの動物モデルの研究に依存しています。ここでは、説明し、人間の心室心筋の小さな外科的サンプルから単実行可能な心筋細胞を得るための新しい方法を検証する。ヒト心室筋細胞は、電気生理学的研究および薬物試験のために使用することができる。...

離と新鮮な外科的試料からのヒト心室の心筋細胞の機能解析

方法は、パッチクランプ電気生理学やイメージング研究のための成体マウスから洞房結節筋細胞（のSAM）の単離のために実証されています。単離された細胞を直接使用することができ、またはそのような遺伝的にコードされたレポーターとして、関心対象のタンパク質の発現を可能にするために、培養物中に維持することができます。...

成体マウスから洞房結節筋細胞の単離、培養、および機能解析のための方法

このプロトコルを記述する高時空分解能、膜電位のデュアル録音を含む光学マッピング システムを利用したマウスの心房の電気生理学的評価と Ca2...

高解像度光学マッピングとマウスの心房の電気生理学的評価

ここでは、保存された駆出率とメタボリック症候群関連心不全ラットモデルから単一セル心房心筋細胞を分離するため、蛍光ベースの最適化手順をについて説明します。心腔の内圧の手動調節、機能そのまま心筋興奮収縮連関研究に適した屈する実装されます。...

保存された駆出率とメタボリック症候群関連心不全ラットモデルから心房の心筋細胞の単離

このプロトコルは、チャンク消化アプローチを使用して、成人マウス心臓から単一の心筋細胞を単一の心筋細胞を分離するために使用される。このアプローチは、パッチクランプ研究で心房筋細胞電気生理学を特徴付けるために使用できる右または左心房筋細胞を単離するために使用されます。...

成体マウスからの心房筋細胞の単離

提示は、ビブラートメカット心筋切れスライスからヒトおよび動物心室心筋細胞を単離するためのプロトコルである。カルシウム耐性細胞の高収率(最大200細胞/mg)は、少量の組織(&lt;50mg)から得ることができます。このプロトコルは、最大36時間の冷たい虚血にさらされた心筋に適用可能です。...

ビブラートムカット心筋切れ切り切れからヒト心室心筋細胞を分離

単成マウス心臓の心房と心室の両方から筋細胞と非筋細胞を同時に分離する方法について説明する。このプロトコルは、高生存性心筋細胞および非筋細胞の一貫した収量をもたらし、フェノタイピングおよびインビトロ分析のための最適な細胞特異的培養条件を詳述する。...

心房筋細胞、心室筋細胞、および非筋細胞の同時分離と培養

マウスモデルは、不整脈形成の重要なメカニズムを研究することを可能にする。そのためには、パッチクランプ測定を行うために高品質の心筋細胞が必要です。ここでは、カルシウム一過性物質とL型カルシウム電流を同時に測定できる逆行性酵素ベースのランゲンドルフ灌流を介してマウス心房筋細胞と心室筋細胞を分離する方法について説明します。...

Ca2+過渡現象とL型カルシウム電流の同時測定のための高品質マウス心房および心室筋細胞の分離

このプロトコルは、成体マウスからの心房および心室筋細胞の同時分離のための大歯カンヌレーションの深さを含むランゲンドルフ法の修飾を記述する。...

成体マウスからの心房と心室筋細胞の同時分離のためのランゲンドルフ法の改変

学ぶ 人心房筋細胞の分離法とカルシウム過渡・膜電流の同時測定技術。パッチクランプと蛍光顕微鏡を用いて、心房細動などの心疾患における細胞内カルシウム動態異常の分子基盤を解明する研究方法を習得できます。

カルシウムの同時測定のための人間の心房筋細胞の分離

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