Name: 超高速液体クロマトグラフィー - 質量分析（UPLC-MS）による血清中の大規模非標的メタボロームプロファイリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: 学ぶ血清中の非標的メタボロームプロファイリング手法。UPLC-MSを用いてメタボライト抽出からデータ解析までの確実なワークフローを確立し、小さな分子バイオマーカーの同定と品質管理による再現性の向上を実現します。

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提示されたチュートリアルは、コロラド州立大学のプロテオミクスおよびメタボロミクス施設内で実施および開発されました。この施設は、CSU Research Administration Resources for Scholarly Projectsによって部分的に資金提供を受けています。

1. サンプル構成
<ol>
	<li>スプレッドシートでサンプル調製用のプレートマップを作成するには、最初の列にロード順にサンプルリストを入力します。2 番目の列に、オートサンプラーソフトウェアの正しい命名法を使用して 96 ウェルプレートの位置を入力します。</li>
	<li>QCサンプル用に各プレートに1つのウェルを保存します。</li>
	<li>LCオートサンプラーが一度に2つのプレートを処理できる場合は、サンプルリストを190のバッチに分割し、この情報を2番目のワークシートに保存します。</li>
	<li>これらの各バッチ内で、ランダム化関数[Excelでは「= rand()」]を使用して、注入順序をランダム化します。次に、注入順序をコピーして LC-MS サンプルキューソフトウェアシステムに貼り付けます。ランダム化は、バッチ間、バッチ内で発生し、注入反復間で一意である必要があります。</li>
</ol>
2. 血清および品質管理(QC)サンプル調製手順
<ol>
	<li>実験のクロマトグラフィー溶出全体にわたる質量と保持時間がわかっている化合物を最低4つ含むQCサンプルの10 mLストックを調製します。(注:カフェイン、レセルピン、スルファジメトキシン、テルフェナジンの濃度はそれぞれ2μg/mL)です。</li>
	<li>血清サンプルを氷上で解凍し、~5秒間穏やかにボルテックスします。</li>
	<li>12チャンネルピペッターの先端をメタノールで事前に濡らして、サンプル分注中の先端の滴下を防ぎます。次に、370 μlの冷メタノールを96ウェルプレートの各ウェルに加えます。</li>
	<li>各サンプル100μlをプレートマップから対応するプレート位置に移します。プレートを覆い、-80°Cで30分間インキュベートしてタンパク質を沈殿させます。</li>
	<li>4°C遠心分離機で3,200 x gで30分間プレートを回転させ、250 μlの上清を新しい96ウェルに移し、遠心分離を繰り返します。</li>
	<li>次に、上清の60 μlアリコートをUPLCまたはLCオートサンプラーに適した3枚の96ウェルプレートに移します。</li>
	<li>100 μlのQCサンプルミックスをプレート上の予約ウェル位置に加えます。</li>
	<li>各プレートを粘着フィルムで密封します。ウェルに穴を開けると溶媒がすぐに蒸発する可能性があるため、注入は各プレートから1回だけ行う必要があります。サンプルキュー内のプレートは、-20°Cで短期的に保存できます。</li>
</ol>
3. UPLC-MSデータ取得
<ol>
	<li>オートサンプラーを4°Cに設定し、最初の2つのプレートをオートサンプラーに入れます。</li>
	<li>2つの代替逆相グラジエントのいずれかを使用して取得方法を設定します。グラジエントAは非極性分子に偏っていますが、グラジエントBは中極性分子のカバレッジを向上させます。
	<ol>
		<li>グラデーションA: 
		<table border="1">
			<tbody>
				<tr>
					<td>時間 (分)</td>
					<td>%A</td>
					<td>%B</td>
					<td>曲線</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>0.0</td>
					<td>100</td>名
					<td>0</td>
					<td> </td>
				</tr>
				<tr>
					<td>0.1</td>
					<td>100</td>名
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>1.0</td>
					<td>60</td>名
					<td>40</td>名
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>3.0</td>
					<td>30</td>名
					<td>70</td>名
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>11.0</td>
					<td>0</td>
					<td>100</td>名
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>17.0</td>
					<td>0</td>
					<td>100</td>名
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>17.1</td>
					<td>100</td>名
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>23.0</td>
					<td>100</td>名
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		</li>
		<li>グラデーション B 
		<table border="1">
			<tbody>
				<tr>
					<td>時間 (分)</td>
					<td>%A</td>
					<td>%B</td>
					<td>曲線</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>0.0</td>
					<td>100</td>名
					<td>0</td>
					<td> </td>
				</tr>
				<tr>
					<td>1</td>
					<td>100</td>名
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>13</td>名
					<td>5</td>
					<td>95</td>名
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>16</td>名
					<td>5</td>
					<td>95</td>名
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>16.05</td>
					<td>100</td>名
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>20</td>名
					<td>100</td>名
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>質量分析計を50-1,200 m/zのポジモードスキャンでデータを収集するように設定します。その他の特定の機器条件は、使用するシステムによって異なります。以下は、Waters Xevo G2 Q-TOF 質量分析計で使用する条件を示しています: コリジョンエネルギー = 6V。スキャン時間 = スキャンあたり 0.2 秒。キャピラリー電圧 = 2,200 V;ソース温度 = 150 °C 脱溶媒温度 = 350 °C 脱溶媒ガス流量 (N2) = 800 L/hr)。</li>
	<li>QCサンプルを各2プレートバッチの開始時に5回注入します。最初の 2 回の注入で UPLC-MS システムをコンディショニングした後、3 回目から 5 回目の注入のピーク面積(<25% RSD)、保持時間(+/- 0.05 分)、および質量精度(+/- 3 ppm)をモニターします。これらのパラメータは、データ集録に使用する機器の仕様に合わせて調整する必要がある場合があります。</li>
	<li>QCサンプルに合格した場合は、これら2つのプレートの血清サンプルに関するデータを取得します。QCサンプルが失敗した場合、問題が解決されてQCサンプルが合格するまで、サンプルデータは収集されません。私たちの研究室では、これらのパラメーターが3日間の注入(つまり、2つの96ウェルプレートの注入)にわたって一貫して安定していることを発見しました。この期間にシステムが不安定であることがわかった場合は、より頻繁なQC注入が適切な場合があります。QCサンプルは、低品質のデータを修正するのではなく、低品質のデータが収集されるのを防ぐために使用されます。</li>
</ol>
4. ピーク検出、積分、アライメント、正規化
これらの手順を実行するためのさまざまなオプションがあり、これにはフリーウェアやベンダー固有のツールが含まれます。この手順はビデオチュートリアルではスキップされていますが、ここでは例としてアプローチを以下に説明します。
各サンプルについて、このタイプの実験から生成される分析データは、保持時間、m/z値、およびスペクトル強度によって記述されるイオンのプロファイルです。ノンターゲット代謝物プロファイリング実験は多数のサンプルで構成されるため、データセットのその後の統計解析を可能にするために、ピーク検出、保持時間のアラインメント、および正規化を行う必要があります。
<ol>
	<li>Waters DataBridge ソフトウェアを使用して、生データを .cdf 形式にエクスポートします。XCMSソフトウェアパッケージ10(フリーウェア<a href="http://metlin.scripps.edu/xcms/" target="_blank">http://metlin.scripps.edu/xcms/ で入手可能)を使用してピーク検出と保持時間のアライメントを実行し</a>、R統計環境11で実行します。この Web サイトには、ソフトウェアのダウンロード方法と実行方法に関するドキュメントが含まれています。</li>
	<li>XCMS 内で「matchedfilter」法を使用し、パラメーターを half max = 8 sec、S/N ratio = 3、抽出したイオンクロマトグラムごとに最大 100 ピークとします。フィーチャのグループ化、保持時間補正、再グループ化、および fillPeaks の手順を実行します。XCMSソフトウェアの出力は、検出可能なすべての特徴が行としてリストされ、各実験サンプルが列としてリストされ、セルに各サンプルの各特徴のピーク面積が入力されたデータマトリックスです。このデータセットの転置は、ダウンストリームの統計ワークフローに組み込むために必要になる場合があります。</li>
	<li>特定のサンプルの各特徴のピーク面積を、抽出されたイオンピーク面積の合計で割ることにより、データ行列をRで正規化します(そのサンプルの総イオン電流、またはTICと呼ばれます(視覚的なデータ解釈に適した数値に100,000を掛けます)。</li>
	<li>外れ値を削除します。データの外れ値は、良好なサンプルの不適切な注入または不適切なサンプルの適切な注入のいずれかによって生じる可能性があります。
	<ol>
		<li>外れ値パッケージを使用して、(1) TIC値と(2) PCスコアを99.9%の信頼度でRで異常値検出を実行します。</li>
		<li>外れ値が存在する場合は、対応するデータファイルが削除され、ピーク検出、アライメント、および正規化の手順が再度実行されます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>正規化されたピーク面積をサンプル識別子で平均化します(複数回の注入を平均化するため)。これは、統計解析を実行する前に行う必要があります(注:注入のレプリケートは分析のばらつきを考慮しますが、真の生物学的レプリケートとして使用することはできません)。</li>
</ol>
5. 統計分析
メタボロミクス実験では、データの解釈に多変量統計手法と単変量統計手法の両方が必要です。一般的に使用される2つの手法には、主成分分析と分散分析(ANOVA)があります。データの統計分析には複数の方法があり、オープンソースと商用の両方のソフトウェアツールが利用可能です。この手順はビデオチュートリアルではスキップされていますが、ここでは例としてアプローチを以下に説明します。
<ol>
	<li>Rのデータセットにaov関数を適用してANOVAを実行します。</li>
	<li>Benjamini-Hochberg 調整 (R の p.adjust 関数) を使用して誤検出を考慮します。</li>
	<li>パレートスケール(単位分散も適用可能)と平均中心化データセットを使用してPCAを実行します。PCスコアと負荷量はどちらも、RのpcaMethodsパッケージを使用して計算されます。</li>
	<li>ANOVA p値、負荷量スコア、およびフォールド変化パラメーターを使用して、実験的治療に関連する変動を最もよく表している分子的特徴を決定します。</li>
	<li>対象の各分子特性を手動で調べて、分子イオン、付加物(ナトリウム、カリウム、二量体など)、または中性損失に対応するかどうかを判断します。</li>
</ol>
6. 代謝物の同定
ここで紹介するワークフローは非常に一般的で、どの機器プラットフォームからの結果にも適用できます。別の戦略については、「ディスカッション」セクションで説明します。
<ol>
	<li>統計的に有意なすべての特徴量(ステップ6の分析から決定)について、生データを確認し、親イオン、ナトリウム付加体、同位体、フラグメントがデータセット全体で同様の傾向をたどっていることを確認します。たとえば、親イオンのANOVAから導出されたp値は、その同位体と類似している必要があります。これは、両方の分子特性が同じ代謝産物に対応していることを示しています。.</li>
	<li>統計的に有意な分子的特徴の精密質量測定および/または中性損失(複数の同位体が有意な場合はC12同位体を選択)を、次のような社内(利用可能な場合)または公開されている代謝物データベースに対して検索します。
	<ol class="lroman">
		<li>ヒトメタボロームデータベース (<a href="http://www.hmdb.ca/" target="_blank">http://www.hmdb.ca/</a>)</li>
		<li>メトリン (<a href="http://metlin.scripps.edu/metabo_search_alt2.php" target="_blank">http://metlin.scripps.edu/metabo_search_alt2.php</a>)</li>
		<li>マスバンク (<a href="http://www.massbank.jp/?lang=en" target="_blank">http://www.massbank.jp/?lang=en</a>)</li>
		<li>脂質マップ (<a href="http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html" target="_blank">http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html</a>)</li>
		<li>米国国立標準技術研究所 MS サーチ (<a href="http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/" target="_blank">http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/</a>)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ソフトウェアを使用して、重要な分子特性の正確な質量と同位体分布から分子式を予測します。Waters ソフトウェアでは、これは MassLynx パッケージの Elemental Comp ツールを使用して実行されます。</li>
	<li>質量誤差(お客様の装置プラットフォームに適したもの)、予測される分子式、実験デザインに関して観察された傾向における生物学的関連性、および保持時間(例:逆相クロマトグラフィーを使用すると、脂質やその他の非極性化合物の保持時間が長くなります)により、候補代謝物の同定をフィルタリングします。</li>
	<li>その後の実験を行い、統計的に有意な分子特性のMS/MSフラグメンテーションを取得します。代謝物の同定は、可能な限り、実験のフラグメンテーションピークと保持時間を、同じ装置で取得した真正の標準試料の一致に基づいて行う必要があります。あるいは、実験のフラグメンテーションをスペクトルデータベースと一致させることもできます。</li>
	<li>同定の信頼性は、メタボロミクス標準イニシアチブの推奨事項に基づいて報告されたすべての代謝物同定に割り当てる必要があります12. 
	レベル 1:真正な化合物に対する直交分析パラメーター(精密質量、保持時間、MS/MS フラグメンテーション)に基づく信頼性の高い分子同定. 
	レベル2とは、物理化学的特性および/または文献またはスペクトルライブラリとのスペクトル類似性に基づく推定同定を指します。 
	レベル3とは、物理化学的特性またはスペクトル類似性に基づく化合物クラスの推定的同定を指します。 
	レベル4は未知の化合物を指します。</li>
</ol>

<ol><li>Theodoridis, G., Gika, H. G., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry-Based+Holistic+Analytical+Approaches+for+Metabolite+Profiling+in+Systems+Biology+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry-Based Holistic Analytical Approaches for Metabolite Profiling in Systems Biology Studies.</a> Mass Spectrom. Rev. 30, 884-906 (2011).</li>
<li>Zelena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+robust+and+repeatable+UPLC-MS+method+for+the+long-term+metabolomic+study+of+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of a robust and repeatable UPLC-MS method for the long-term metabolomic study of human serum.</a> Analytical Chemistry. 81, 1357-1364 (2009).</li>
<li>Michopoulos, F., Lai, L., Gika, H., Theodoridis, G., Wilson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UPLC-MS-based+analysis+of+human+plasma+for+metabonomics+using+solvent+precipitation+or+solid+phase+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">UPLC-MS-based analysis of human plasma for metabonomics using solvent precipitation or solid phase extraction.</a> Journal of Proteome Research. 8, 2114-2121 (2009).</li>
<li>Kamburov, A., Cavill, R., Ebbels, T. M., Herwig, R., Keun, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+pathway-level+analysis+of+transcriptomics+and+metabolomics+data+with+IMPaLA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Integrated pathway-level analysis of transcriptomics and metabolomics data with IMPaLA.</a> Bioinformatics. 27, 2917-2918 (2011).</li>
<li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MetPA%3A+a+web-based+metabolomics+tool+for+pathway+analysis+and+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MetPA: a web-based metabolomics tool for pathway analysis and visualization.</a> Bioinformatics. 26, 2342-2344 (2010).</li>
<li>Johnson, C. H., Gonzalez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+of+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities of metabolomics.</a> J. Cell. Physiol. 227, 2975-2981 (2012).</li>
<li>Issaq, H. J., Waybright, T. J., Veenstra, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+biomarker+discovery%3A+Opportunities+and+pitfalls+in+analytical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Cancer biomarker discovery: Opportunities and pitfalls in analytical methods.</a> Electrophoresis. 32, 967-975 (2011).</li>
<li>Zhou, B., Xiao, J. F., Tuli, L., Ressom, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC-MS-based+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">LC-MS-based metabolomics.</a> Mol. Biosyst. 8, 470-481 (2012).</li>
<li>Weckwerth, W., Morgenthal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics%3A+from+pattern+recognition+to+biological+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Metabolomics: from pattern recognition to biological interpretation.</a> Drug Discov. Today. 10, 1551-1558 (2005).</li>
<li>Smith, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((METLIN+-+A+metabolite+mass+spectral+database%5BTitle%5D)+AND+%22Ther.+Drug+Monit%22%5BJournal%5D)">METLIN - A metabolite mass spectral database.</a> Ther. Drug Monit. 27, 747-751 (2005).</li>
<li>Culpepper, S. A., Aguinis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R+is+for+Revolution%3A+A+Cutting-Edge%2C+Free%2C+Open+Source+Statistical+Package%5BTitle%5D)+AND+%22Organ+Res.+Methods%22%5BJournal%5D)">R is for Revolution: A Cutting-Edge, Free, Open Source Statistical Package.</a> Organ Res. Methods. 14, 735-740 (2011).</li>
<li>Sumner, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+minimum+reporting+standards+for+chemical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Proposed minimum reporting standards for chemical analysis.</a> Metabolomics. 3, 211-221 (2007).</li>
<li>Vuckovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+trends+and+challenges+in+sample+preparation+for+global+metabolomics+using+liquid+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Current trends and challenges in sample preparation for global metabolomics using liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Anal. Bioanal. Chem. 403, 1523-1548 (2012).</li>
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<li>Nordstrom, A., Want, E., Northen, T., Lehtio, J., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+ionization+mass+spectrometry+strategy+used+to+reveal+the+complexity+of+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiple ionization mass spectrometry strategy used to reveal the complexity of metabolomics.</a> Analytical Chemistry. 80, 421-429 (2008).</li>
<li>Horai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MassBank%3A+a+public+repository+for+sharing+mass+spectral+data+for+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">MassBank: a public repository for sharing mass spectral data for life sciences.</a> J. Mass Spectrom. 45, 703-714 (2010).</li>
<li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+metabolite+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Advances in metabolite identification.</a> Bioanalysis. 3, 1769-1782 (2011).</li>
<li>Broeckling, C., Heuberger, A., Prince, J., Ingelsson, E., Prenni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assigning+precursor-product+ion+relationships+in+indiscriminant+MS%2FMS+data+from+non-targeted+metabolite+profiling+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Assigning precursor-product ion relationships in indiscriminant MS/MS data from non-targeted metabolite profiling studies.</a> Metabolomics. , 1-11 (2012).</li>
<li>Kangas, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+identification+software+%28ISIS%29%3A+a+machine+learning+approach+to+tandem+mass+spectral+identification+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">In silico identification software (ISIS): a machine learning approach to tandem mass spectral identification of lipids.</a> Bioinformatics. 28, 1705-1713 (2012).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

このチュートリアルは、UPLC-MS による大規模な非標的代謝物プロファイリングを実施するための出発点として機能することを目的としています。このワークフローは、メタノール水溶液溶媒で抽出し、C8 または C18 UPLC カラムに保持し、陽イオンとして検出できる代謝物に焦点を当てています。特定の代謝物クラスに対する事前に決定されたバイアスがなく、グローバルプロファイルを生成する仮説が望まれる状況では、このプロトコルは、さまざまな化学クラスからの血清代謝物の大部分を検出するため、価値があります(つまり、 中 程度の極性から非極性の化合物)。予算と時間が許せば、さまざまな抽出方法、クロマトグラフィー分離、およびイオン化モードを組み込むことで、代謝物のカバレッジを簡単に拡大できます 13,14 15。
経時的なデータの安定性は、数週間または数か月にわたってデータが収集される可能性がある大規模な実験では、重要な分析上の考慮事項です。アプローチの偏りのない全体的な性質を考えると、データの正規化を目的とした内部標準(または内部標準のパネル)を組み込むこ...

「メタボロミクス」という用語は、多くのものを包含することができます。 例えば、メタボロミクス実験は、NMRやガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、質量分析法など、さまざまな分析プラットフォームを使用して行うことができます。 さらに、メタボロミクス実験は、標的法または非標的法、あるいは両方の組み合わせで実施することができます。 ターゲットメタボロミクス実験では、目の前の生物学的問題にとって重要な分子のパネルを指向的に解析します(例えば、TCAサイクルに関与する低分子は、その経路の正確な定量を可能にします)。 このような状況では、生物学的仮説が分析で標的とする代謝物の選択を決定しており、分析ステップはこれらの分子の検出に最適化されています。 あるいは、ノンターゲットメタボロミクス実験が仮説を立てています。 この場合、実験は広範かつ偏りのない方法で行われ、できるだけ多くの代謝物を検出できるようにします。 ノンターゲット実験の結果は、研究の次のステップを推進します(多くの場合、ターゲットメタボロミクスワークフローが含まれる場合があります)。 また、2つのアプローチを組み合わせることも可能であり、その場合、実験はノンターゲット方式で行われ、同時にデータ内の既知の分子のパネルが監視されます。 
ここで紹介するチュートリアルは、特に血清のノンターゲット代謝物プロファイリングに焦点を当てています。 上述したように、ノンターゲットアプローチは、検出可能な代謝物の偏りのないビューを提供し、大量の情報を生成することができ、最終的には新たな発見を可能にします。このアプローチの使用は、特に超高速液体クロマトグラフィーと質量分析(UPLC-MS)を組み合わせたもので、(1)実験デザイン、(2)サンプル収集、(3)サンプル調製、(4)UPLC-MSによるデータ取得、(5)データ前処理(ピーク検出、波形解析、アライメント、正規化)、(6)統計データ解析(単変量および多変量の両方)、(7)代謝物の同定、(8)生物学的なステップで、広く普及しています1、2、3。解釈。 
現在、UPLC-MSベースのノンターゲット代謝物プロファイリングとその後のデータ前処理ステップのための確立された標準法はありません。 この標準化の欠如は、代謝物プロファイリングの主要な分析課題の1つに一部起因しています。メタボロームの化学的多様性。 この多様性のため、単一の抽出法または質量分析取得法では、1回の分析ですべての代謝物を包括的にカバーすることは不可能です。 概念的には、複数の抽出(水溶液、メタノール、クロロホルム:メタノールなど)と、さまざまなクロマトグラフィー条件(逆相、HILICなど)およびさまざまなイオン化モード(陽イオン、陰イオン、化学イオン化など)を組み合わせることで、代謝物のカバレッジを最大化できます。). しかし、多くの場合、研究者は特定の化学クラスに対して事前に決定されたバイアスを持っていないため、特に大規模な実験では、複数の抽出や機器の取得を行う費用は保証されません。 したがって、ここで紹介するビデオチュートリアルは、UPLC-MSによる血清の大規模なノンターゲット代謝物プロファイリングの一般的な手順を提供するように設計されています。 これにより、新規および既存のラボがこれらのタイプの実験を行うことができ、さまざまなサンプルタイプ、特定の化学クラス、またはターゲット分析のアプローチを拡大できるビルディングブロックが可能になります。 具体的には、このプロトコルには、血清サンプル調製、大規模研究のためのサンプル組織化、UPLC-MSデータ取得、品質管理(QC)手順、および代謝物の同定のステップが含まれます。 また、データの前処理と統計分析の戦略についても説明します。
このチュートリアルの範囲外であるため、このプロトコルは実験デザイン、サンプル収集、または生物学的データの解釈のステップには焦点を当てません。 しかし、これらのトピックに関する文献には多くのリソースが存在しており、著者はメタボロミクスに不慣れな研究者に、これらを徹底的に探求することを奨励しています4、5、6、7、8、9。 特に、実験計画は非常に重要であり、ノンターゲットメタボロミクス実験の成功に不可欠です。 適切な生物学的複製やサンプル収集手順の一貫性(ベンチでの時間、保管温度、保管時間、凍結融解など)などの要素を考慮して、実行可能な研究を確保し、データの適切な生物学的解釈を促進する必要があります。

<table><tbody><tr><td>96ウェルプレート - 500 &mu;lウェルVWR</td><td></td><td>40002-020</td>これらは<td>サンプル調製に使用されます</td></tr><tr><td>96ウェルプレートマット</td><td>VWR</td><td>89026-514</td><td>これらはサンプル調製に使用されます</td></tr><tr><td>96ウェルプレート - 350 &mu;l ウェルズ</td><td>ウォーターズ・コーポレーション</td><td>WAT058943</td><td>これらはサンプル注入に使用されます</td></tr><tr><td>96ウェルプレートマット</td><td>ウォーターズ・コーポレーション</td><td>186000857</td><td>これらはサンプル注入に使用されます</td></tr><tr><td>96ウェルプレートヒートシール</td><td>ウォーターズコーポレーション</td><td>186002789</td><td>これらはサンプル注入または長期保存に使用できます</td></tr><tr><td>96ウェルプレートヒートシーラー </td><td>ウォーターズコーポレーション</td><td>186002786</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS グレード メタノール</td><td>Fluka</td><td>34966</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS グレード アセトニトリル</td><td>Fluka</td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS グレード aater</td><td>Fluka</td><td>39253</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS グレード ギ酸</td><td>Fluka</td><td>56302</td><td></td></tr><tr><td>マルチチャンネル電動ピペット</td><td>VWR</td><td>89000-674</td><td></td></tr><tr><td>Pipett tips</td><td>Eclipse (Light Labs から購入)</td><td>B-5061/B-4061</td><td></td></tr><tr><td>チルド遠心分離機 - Allegra X-12R</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A - 接触 Beckman Coulter</td><td></td></tr><tr><td>Acquity Ultra performance 液体クロマトグラフィー (UPLC) システム</td><td>Waters Corporation</td><td>N/A - 接触 Waters Corporation</td><td></td></tr><tr><td>UPLC C8 カラム (グラジエントオプション a)</td><td>Waters Corporation</td><td>186002876</td><td></td></tr><tr><td>UplC T3 カラム (グラジエントオプション b) </td><td>WatersCorporation</td><td>186003536</td><td></td></tr><tr><td>Xevo G2 Q-TOF 質量分析計</td><td>Waters Corporation</td><td>N/A - Waters Corporation</td><td></td> までお問い合わせください</tr></tbody></table>

超高速液体クロマトグラフィー - 質量分析（uplc-ms）による血清中の大規模非標的メタボロームプロファイリング

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

超高速液体クロマトグラフィーと質量分析(UPLC-MS)を組み合わせたノンターゲット代謝物プロファイリングは、代謝を調査するための強力な技術です。 このアプローチは、診断テストや新しい治療法の開発、および疾患プロセスの理解を深めることを可能にする、偏りのない詳細な分析を提供します。 メタボロームの固有の化学的多様性は、重大な分析上の課題を生み出し、すべての代謝物を検出できる単一の実験的アプローチはありません。 さらに、個々の代謝の生物学的変動と代謝の環境要因への依存性により、意味のある生物学的解釈に必要な適切な統計的検出力を達成するためには、大量のサンプルが必要です。 これらの課題に対処するために、このチュートリアルでは、UPLC-MSによる血清の大規模な非標的代謝物プロファイリングの分析ワークフローについて概説します。この手順には、サンプルの整理と調製、データ取得、品質管理、代謝物同定に関するガイドラインが含まれており、大規模な実験で信頼性の高いデータ取得が可能になり、UPLC-MSによるノンターゲット代謝物プロファイリングを初めて行うラボの出発点となります。

UPLC-MSによる非標的メタボロームプロファイリング実験の基本的な分析手順を図1に概説します。各サンプルの生データは、ベースピーククロマトグラムとして可視化できます。図2は、本チュートリアルのグラジエントオプション(a)で分析した血清サンプルのベースピーククロマトグラムの例です。上述の統計解析の後、統計的に有意なすべての分子特徴についてメタボライトの同定を試みます。確実な同定（レベル1）には、同一の分析装置を用いて得られた実験的な分子特徴と、推定されるメタボライトの認証標準品との間で、クロマトグラフィーの保持時間、正確な質量、およびフラグメンテーションパターンの照合が必要です。図3は、ヒト血清中のカフェインのレベル1メタボライト同定の例を示しています。
本プロトコルでは、サンプルの整理と調製、UPLC-MSデータの取得と品質管理、および分析的な代謝物同定に焦点を当てています。ピーク検出、アライメント、標準化、および統計解析のステップは、非標的代謝物プロファイリング実験の結果を得る...

超高速液体クロマトグラフィーと質量分析(UPLC-MS)を組み合わせたノンターゲット代謝物プロファイリングは、代謝を調査するための強力な技術です。 この記事では、サンプルの組織化と調製、データ取得、データ解析、品質管理、代謝物の同定など、血清のノンターゲット代謝物プロファイリングに利用される一般的なワークフローについて概説します。

超高速液体クロマトグラフィー - 質量分析（UPLC-MS）による血清中の大規模非標的メタボロームプロファイリング

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

この手順の全体的な目的は、大規模な実験において血清のロバストな非標的メタボロームプロファイリングを行うことです。まず、プレート形式でメタボライトを抽出します。次に、経時的な分析安定性を確保するために、ロバストなQCサンプルおよび分析手法を確立します。次に、QCサンプルおよびランダム化した血清サンプルの質量分析データを繰り返し取得し、データのプリプロセッシング、統計解析、および代謝物の同定に進みます。U-P-L-C-M-Sによる非標的代謝物プロファイリングの結果は、血清中の低分子バイオマーカーの同定に利用できます。本プロトコルでは、血清の分析手法について解説します。しかしながら、この手法は尿、組織、細胞培養抽出液などの他の生物学的流体の分析にも容易に拡張できます。サンプル調製用のプレートマップを作成するには、スプレッドシートを開きます。最初の列に、ロード順にサンプルリストを入力してください。2番目の列には、オートサンプラーソフトウェアの正しい命名法に従って、96ウェルプレートの位置を入力してください。各プレートの1ウェルをQCサンプルのために残しておきます。LCオートサンプラーが一度に2枚のプレートを処理できる場合は、サンプルリストを190個ずつのバッチに分け、この情報を2番目のワークシートに保存します。これらの各バッチ内で、注入順序をランダム化してください。次に、注入順序をLCMSサンプルキューソフトウェアシステムにコピー＆ペーストします。サンプルキューの最初の3行は、カラムコンディショニング注入用に予約してください。実験のクロマトグラフィー溶出範囲をカバーし、質量と保持時間が既知の化合物を最低4種類含むQCサンプルのストック溶液を10 milliliter調製します。血清サンプルを氷上で解凍し、約5秒間緩やかにボルテックスします。サンプルの分注時にチップから液が滴下するのを防ぐため、12チャンネルピペッターのチップをメタノールで事前濡らしします。次に、96ウェルプレートの各ウェルに冷メタノールを 370 µL 加え、プレートマップに従い、各サンプル 100 µL を対応するプレート位置に加えます。プレートに蓋をし、-80°Cで30分間インキュベートします。タンパク質を沈殿させるため、プレートを3,200 ×g、4°Cで30分間遠心分離します。その後、上清250 µLを新しい96ウェルプレートに移し、遠心分離の手順を繰り返します。次に、snatを60 µLずつ、UPLCまたはlcオートサンプラーに適した3枚の96ウェルプレートに分注します。プレートの予約済みウェル位置に、QCサンプルミックスを100 µL添加します。各プレートを接着フィルムで密封します。オートサンプラーを4 °Cに設定します。最初の2枚のプレートをオートサンプラーにセットします。2つの代替逆相グラジエントのいずれかを用いて、データ収集メソッドを設定します。グラジエントAは非極性分子に偏っています。一方、グラジエントBは中程度の極性を持つ分子をより広くカバーすることができます。質量分析計をポジティブモードに設定し、質量電荷比50から1200までをスキャンしてデータを収集します。詳細な装置条件は、各分析の開始時に使用するシステムによって異なります。サンプルプレートを準備し、QCサンプルを手動で5回注入します。3回目から5回目のQC注入を用い、ピーク面積のRSDが25%未満であること、保持時間が±0.05分以内であること、および質量精度が±3 ppm以内であることを確認します。これらのパラメータは、データ取得に使用する装置の仕様に合わせて調整する必要がある場合があります。QCサンプルが合格した場合は、全データセットの取得が完了した時点で、これら2枚のプレートの血清サンプルのデータを取得します。全データセットに対して、質量分析データの特徴量検出、アライメント、および正規化を行います。次に、統計解析を行い、生物学的に関心のある分子の特徴を決定します。これらの手順はテキストプロトコルに記載されています。以下のワークフローは、代謝物同定プロセスの概念的な概要を示しています。代替戦略をテキストプロトコルで提供しています。ソフトウェアを使用して、主要な分子特徴の正確な質量と同位体分布から分子式を予測します。次に、得られた正確な質量の測定値を、社内または公開のメタボライトデータベースで検索します。データベースを用いて、予測分子式の質量誤差、保持時間、インソースフラグメンテーション、および実験計画に関して観察された傾向における生物学的妥当性に基づき、候補代謝物のフィルタリングと同定を行います。これにより、推定代謝物同定（putative metabolite identification）が得られます。確定的な同定には、実験で得られた化合物の正確な質量、保持時間、およびフラグメンテーションを、推定代謝物の標準物質と照合して一致させる必要があります。最後に、メタボロミクス標準イニシアチブ（Metabolomic Standards Initiative）の推奨事項に基づき、報告されたすべての代謝物同定に対して同定信頼度を割り当てます。このワークフローは、U-P-L-C-M-Sによる非標的代謝物プロファイリング実験を行うための基本的な分析手順を示しています。生データはベースピーククロマトグラムとして可視化できます。この例では、統計解析後にグラジエント分析を行った血清試料を示しています。生物学的に重要であり、かつ統計的に有意なすべての分子特徴について、メタボライトの同定を試みます。ここでは、実験的な分子特徴と想定されるメタボライトの真正標準品との間で、クロマトグラフィーの保持時間、正確な質量、およびフラグメンテーションパターンを照合することにより、ヒト血清中のCaffeineを同定しました。これはレベル1の代謝物同定の例です。このビデオを視聴することで、UPLC-msを用いた血清の大規模な非標的代謝物プロファイリングにおいて、分析安定性を確保する方法について十分に理解できるはずです。ただし、分析安定性は代謝物プロファイリング実験を成功させるための重要な側面の一つに過ぎません。実験設計、およびその後のデータ解析と解釈も同様に不可欠です。ただし、これらのトピックについては、本ビデオチュートリアルの範囲外となるため、テキストプロトコル内で導入および解説しています。

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Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

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学ぶ血清中の非標的メタボロームプロファイリング手法。UPLC-MSを用いてメタボライト抽出からデータ解析までの確実なワークフローを確立し、小さな分子バイオマーカーの同定と品質管理による再現性の向上を実現します。

超高速液体クロマトグラフィー - 質量分析（UPLC-MS）による血清中の大規模非標的メタボロームプロファイリング

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