ハイスループットSHAPEを使用したRNA二次構造予測

この手順の全体的な目標は、一塩基分解能でRNA二次構造を予測することです。これは、まず、SがRNAの一本鎖または柔軟な領域を分離する求電子試薬を使用して、折り畳まれたRNAを化学的に修飾することによって達成されます。2番目のステップは、逆転写を使用して、化学的に修飾されたRNAの部位を検出することです。

次に、逆転写のCD NA生成物をキャピラリー電気泳動により分画します。最後のステップは、データの処理と正規化です。最終的に、RNA構造ソフトウェアを使用して、形状解析から導き出された疑似自由エネルギー制約を使用してRNAの二次構造を予測します。

この手法は、RNA構造が触媒RNAと非現行RNAの機能をどのように制御しているか、ウイルスのRNAゲノムがそれらのゲノムの多機能をどのように制御しているかなど、分子生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の意味は、RNAの二次構造に関する洞察を得ることが構造ベースの医薬品の設計に役立つ可能性があるため、ウイルス性疾患や癌の治療と診断にまで及びます。この方法は、in vitro転写によって産生されるRNAの構造に関する洞察を提供しますが、形状試薬は細胞透過性であるため、in vivoでも適用できます。

この手順を開始する前に、in vitro転写によってRNAを調製してください。市販のトランスクリプションキットを使用する。RNAは、0.5マイクロリットルのマイクロ遠心チューブ内の摂氏マイナス20度からマイナス80度のTEバッファーに保存する必要があります。

12ピコモルのRNAを水で18マイクロリットルに希釈し、チューブを軽くたたいて10 x reナチュレーションバッファーミックスの2マイクロリットルを加え、続いてチューブ内の混合物を短時間回転させて85°Cに1分間加熱し、次いで1秒あたり0.1°Cの速度で4°Cに冷却する。100マイクロリットルの水と30マイクロリットルの5×折り畳みバッファーをマイクロ遠心分離チューブに加えます。その後、チューブの内容物を摂氏37度で、折り畳まれるRNAに応じて30〜60分間インキュベートします。

一般に、より長く、より構造化されたRNAのマグネシウム依存的なフォールディングは、より長いインキュベーション時間を必要とします 72マイクロリットルのアリコートを2つの0.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブのそれぞれに移します。次のステップは、8マイクロリットルの無水ジメチルスルホキシドをコントロールミックスに追加し、取っておきます。次に、8マイクロリットルの10 xとMIAを修飾混合物に加えます。

改質およびコントロールミックスを摂氏37度で50分間インキュベートします。8マイクロリットルの3つの酢酸ナトリウムpH、5.28マイクロリットルの100ミリモルEDTA、240マイクロリットルの冷たいエタノール、および1ミリリットルあたり10ミリグラムの1マイクロリットルを追加します。修飾混合チューブにグリコーゲンを修飾RNAを沈殿させ、チューブの内容物をマイナス20°Cで2時間冷蔵し、次いで14,000Gで4°Cで30分間遠心分離する。

次に、ペレットを70%エタノールの冷遠心分離機で5分間2回洗浄します。各洗浄後、マイクロピペットで上清を取り除き、ペレットを5分間風乾します。室温で、0.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブで逆転写するための改変サンプルとコントロールサンプルを調製します。

修飾反応には、5マイクロリットルの修飾RNA、6マイクロリットルの水、および1マイクロリットルの10マイクロモルsci 5標識プライマー溶液を混合します。コントロール反応には、5マイクロリットルのコントロールRNA、6マイクロリットルの水、および1マイクロリットルの10マイクロモルsci 5.5標識プライマー溶液を混合します。チューブをサーマルサイクラーに入れ、RNAへのプライマーをひざまずかせます。

ひざまずく間に、2.5 x RTミックスを準備します。各RT反応について、よく混合し、摂氏37度で5分間インキュベートしてから、ひざまずく反応に加えます。ひざまずく反応の温度が摂氏50度に達したら、2.5XRTの8マイクロリットルを追加します。

混合し、摂氏50度で50分間インキュベートします。次に、1マイクロリットルの4モルの水酸化ナトリウムを加え、90°Cに3分間加熱してRNAを加水分解しました。氷上で反応を冷却し、2マイクロリットルの2モル塩酸を加えて中和します。

次に、修飾反応と制御反応を組み合わせ、3モルの酢酸ナトリウムと100ミリモルのEDTAの総反応容量の0.1容量または10分の1を追加します。1.5容量の冷たいエタノールと1マイクロリットルあたり10ミリグラム/ミリリットルです。グリコーゲン。これにより、CDNAが溶液から析出します。溶液を2時間冷蔵し、次に摂氏4度で14, 000Gで30分間遠心分離します。

65°Cに10分間加熱することにより、40マイクロリットルの脱イオン形態アミドでペレット化されたCD NAを冷たい70%エタノール再懸濁液で2回洗浄し、続いて少なくとも30分間激しいボルテックスを行い、0.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブミックス40マイクロリットルのDDA終端ミックスでシーケンシング反応を調製する。5PICAモルのDNAテンプレート、4.6マイクロリットルの10 x seaseバッファー、および10マイクロリットルのよく読まれたD 2標識プライマー。これに4.6マイクロリットルのQUIN Aを加え、水で希釈して総容量を82マイクロリットルにします。

同様に、DDTおよびlycor IR 800標識プライマーを使用して、2回目のシーケンシング反応を調製します。次に、所定のUSB推奨条件を使用したPCR増幅に進みます。16マイクロリットルの3モル酢酸ナトリウムpH 5.2、16マイクロリットルの100ミリモルEDTA、10ミリグラム/ミリリットルのグリコーゲンの1マイクロリットル、および480マイクロリットルの95%エタノールを加えてDNAを沈殿させ、その後、摂氏4度で30分間摂氏4度でインキュベートし、摂氏4度で30分間14,000Gで遠心分離します。

ペレット化したCD NAを100マイクロリットルの脱イオン型アミドに再懸濁し、摂氏65度に10分間加熱した後、少なくとも30分間激しくボルテックスします。次に、プールされた形状サンプルの40マイクロリットルをプールされたシーケンシングラダーの10マイクロリットルと混合し、サンプルの総量を96ウェルサンプルプレートにピペットで移し、キャピラリー電気泳動装置をプログラムして準備し、製造元の指示に従って実行を開始します。色分けされた4つの重なり合ったトレースは、以下のように4組の反応生成物がキャピラリーを通過することによって生成され、青色のトレースはNMIA修飾RNAの逆転写によって生成された逆転写生成物を示しています。

Green Traceは、折り畳まれたがそれ以外は修飾されていないRNAからの逆転写産物を示しています。黒のトレースは D-N-A-D-D-G シーケンシング ラダーを示し、赤のトレースは DDT シーケンシング ラダーを示します。生のキャピラリー電気泳動トレースは、形状ファインダーソフトウェアを使用して分離、処理、整列、および統合されます。

データ解析は、キャピラリー電気泳動システムからエレクトロフェログラムを形状ファインダーにインポートすることから始まります。中央のデータビューウィンドウには、各データ処理ステップに関するグラフィカルなフィードバックが表示されます。画面の左下にあるツールインスペクタウィンドウには、スクリプトインスペクタで選択したツールのパラメータが表示されます。

画面上部のスクリプティングインスペクターには、データに適用されたツールが表示され、蛍光バックグラウンド、蛍光チャネル間のスペクトルのオーバーラップ、モビリティシフト、逆転写の早期終了に起因する異なるタグ付きプライマーシグナル減衰によって付与されるエレクトロフェログラムを調整し、形状ファインダーで異なる蛍光色素でラベル付けされた一般的な製品の蛍光強度の違いを整列させ、統合ツール。セットアップ機能を使用して、個々のピークにIDを自動的に割り当て、この情報をユーザー入力で定義されたRNA配列と相関させ、2つのシーケンシングラダーを使用して、ヌクレオチド反応性プロファイルをRNA構造5.3ソフトウェアで使用される二次構造アルゴリズムに組み込んだり、密接に関連するRNAのプロファイルを比較したりします。標準化された方法で図形データを正規化します。

これを行うには、後続の計算から外れ値を除外します。有効な最大反応性を決定し、すべての反応性値を有効な最大値で割って正規化します。RNA構造ソフトウェアは、形状解析からの疑似自由エネルギー制約を使用して、実験的に支持されたRNA二次構造を予測するために使用されます。

このソフトウェアは、DRNA構造に対する最小エネルギーのグラフィカル表現と、これらの構造のテキスト表現を提供します。ドットブラケット表記では、配列とドットブラケットアノテーションはRNA構造ビューアにインポートする必要があります。ここに示されているのは、形状から派生した反応性プロファイルを使用してRNA構造5.3で生成されたHIV rev応答要素ステムループ2領域の2D構造であり、Java軽量アプレットを使用して視覚化されています。青色のヌクレオチドは反応性が低く、赤色のヌクレオチドは反応性が高く、一度習得すれば、適切に実行すれば2日で行うことができます。

この手順を試みる際には、得られたRNAモデルを慎重に解釈してから、この手順に従うRNA二次構造に関する最終的な結論に達する必要があることを覚えておくことが重要です。複雑な三次相互作用を解明し、最終的には研究者がこれらのRNAの構造を3次元で決定することを可能にするために、空間切断法によるヒドロキシラジカルプローブのような他の方法を実行することができます。