ビデオトラッキングソフトウェアによって分析されるマウスの短期および長期の自発運動

本実験の全体的な目的は、実験的な処置を施したマウスの異なるグループ間で、短期的および／または長期的な自発運動量の差を検出することです。これは、マウスのホームケージ内での活動をリアルタイムでビデオ録画することで達成されます。第二のステップとして、ビデオトラッキングソフトウェアを用いて、動物の自発運動量をリアルタイムで、あるいは録画データから解析します。

次に、スコアリングされた運動パラメータを統計解析用の二次ソフトウェアにインポートします。これにより、移動距離、移動速度、移動時間などの評価パラメータに基づき、処置や条件が短期的および長期的な運動活性に及ぼす影響を明らかにすることができます。ラインクロッシングやエミッター埋込などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、侵襲的で結果に影響を及ぼす可能性のある外科的手術を必要とせず、マウスの運動活性をより詳細に検討できる点にあります。

一般的に、この手法を初めて行う方は、その後のビデオトラッキングで最適な画質を得るためのケージや機器のセットアップに手間がかかり、習得までに時間を要するため、苦労することがあります。短期間の自発運動量は、動物のコードカラーとコントラストの高い床敷きを入れた、単独飼育マウスのホームケージ内で測定します。実験前に、動物を床敷きに少なくとも24時間慣らしておく必要があります。

試験室を準備するために、まず、120 gigabytes 以上のメモリを搭載した暗視機能付きビデオカメラを記録エリアの上方に設置します。室内の環境音は 70 decibels を超えてはいけません。断続的な背景ノイズが避けられない場合は、ホワイトノイズジェネレーターを使用してそれらのノイズを打ち消してください。

また、試験室の環境条件を動物の通常の飼育条件に近づけることも重要です。新しい被験者をセットアップする前に、記録エリアを清掃し、ケージの床材と同色のブッチャーペーパーまたはラボベンチペーパーで表面を覆ってください。次に、0.5インチのプラスチック製で不透明なケージ仕切りを配置します。試験表面に置く仕切りは、床材と同色で清潔である必要があります。

次に、マウスをテストエリアに運び、ケージをディバイダーの間に設置します。解析を容易にするため、ケージは常に同じ向きに配置してください。テストの際は、厚さ1/4インチの透明プレキシガラスでケージを覆います。

十分な換気を確保するため、プレキシガラスに少なくとも11個の1/4インチの穴を開ける必要があります。次に、赤い電球を装着したブルーダークランプライトを設置し、ケージを照らします。そして、ビデオトラッキングシステムの能力を超えない範囲で、カメラの視野をテストケージの中心に合わせます。

本システムでリアルタイムに追跡できるマウスは8匹に限定されています。次に、ビデオカメラのディスプレイを確認しながら、照明の角度と位置を調整し、プレキシガラス製のケージ上部へのグレアや反射を取り除いてください。視覚的なアーティファクトのない、マウスの鮮明な映像を得ることが、良好な結果を得るための最も重要なステップとなります。

LMAの経時的な変動による潜在的な影響を最小限に抑えるため、各グループには必ず実験群と対照群の両方の個体を含めてください。テストの直前に、マウスの視界を遮る可能性があるため、ケージ内のネスティング材や環境エンリッチメント材を取り除きます。ビデオ撮影では、関連する実験情報を記載したスレートから録画を開始してください。

ビデオを正確に識別するため、カメラのディスプレイにあるタイマーを使用してテスト時間を追跡し、動物の視界に入らないようにしてください。録画時間中は、この状態を維持します。テスト終了後、すべての資材を各ケージに戻してください。

動物を再度テストする場合は、テストの間に餌と水へのアクセスを再開させてください。テストセッションのビデオ録画は、ハードディスクドライブなど、ビデオトラッキングシステムと互換性のあるアーカイブメディアに保存します。ビデオトラッキングシステムを用いて、ビデオをリアルタイムで解析します。まず、ケージの床全体をトラッキングのための関心領域（ROI）として選択してください。

Figma taxの評価などの高度な解析を行う場合は、ハイスループット研究のためにケージ内に複数のROIを作成します。ビデオ内のすべてのケージを、個別の全ケージ床面ROIを用いて同時に解析します。VTSを設定して、総移動距離、移動速度、および移動時間を算出します。計算完了後、データを保存および追加解析のためにスプレッドシートファイルにエクスポートします。

長期試験は短期試験と同様に実施します。ただし、餌と水にアクセスするための新しい開口部を備えた、改造済みのケージが必要です。まず、標準的なケージの短辺の壁に、直径 5.5 centimeter の穴を開けます。

次に、1/4インチの亜鉛メッキ鋼メッシュに1/2インチの開口部を切り抜き、同じメッシュを用いて研磨し、鋭利な端を取り除きます。その後、開口部のメッシュに接続可能な餌用ペレットの外付けホッパーを作製します。次に、リベット用の穴を開けます。その後、アルミリベットとステンレス製ワッシャーを使用して、ケージの穴をメッシュと取り付けたホッパーで覆います。

水分を供給するため、標準的な50 milliliterのコニカルチューブと、ドリップ防止用吸水チューブを挿入できるよう穴を広げた1穴ゴム栓を用いて水ボトルを作成します。この水ボトルをケージに固定してください。

ベルクロテープを使用して、シッパーチューブをメッシュで覆われた開口部に挿入します。ケージをプレキシガラスの蓋で覆った状態でも、短期自発運動量測定法で概説した手順と同様に、マウスは食物と水にアクセスし続けることができます。長期測定は、通常12時間、または現在の明暗サイクルのフェーズの期間中に行われます。

長期的な自発運動量試験は、通常、ビデオ録画を行わずにリアルタイムで解析されます。ただし、補助カメラを使用するか、メインカメラに接続されたDVDレコーダーを介して録画を行うことが可能です。マウスの試験期間はビデオトラッキングシステムの処理能力が許容する限りまで延長でき、短期試験と同様に、ケージからは巣作り用の濃縮材料のみを取り除き、トウモロコシ芯やおがくずの床材はそのまま残します。

VTSにおいて、リアルタイム解析のためのビデオトラッキングシステムをセットアップします。記録対象となる各ケージについて、トラッキングROIをフロア全体に設定してください。短期アッセイと同様に、総移動距離、移動速度、および移動時間を算出するようにシステムを設定します。

その後、解析を行い、データをスプレッドシートにエクスポートして保存し、短期的自発運動量測定（short-term locomotor assays）を繰り返し用いて解析します。リポポリサッカライド（lipopolysaccharide）投与後、個別換気ケージ（IVC）で飼育されたマウスは、環境ケージ（EC）で飼育されたマウスよりも、投与による短期的LMAの低下からより速く回復することがわかりました。LPS投与群間では、初期の自発運動量の低下は同様でしたが、基底状態の自発運動量への回復は、IVC飼育マウスにおいてより迅速でした。また、移動速度および移動時間についても同様の結果が得られました。

本解析では、検出変数を用いて、秒速2センチメートルの移動で追跡を開始し、秒速1.75センチメートルで追跡を停止するように設定しました。12時間の活動サイクルを2回連続して行う小規模な運動能試験を実施しました。正常マウスにおいて、移動距離、移動速度、および移動時間のいずれにも有意な差は認められませんでした。

有意な差が認められない傾向が、大規模なサンプルサイズでの反復試行においても継続する場合、本アッセイは長期的な運動機能アッセイに用いられる植込み型送信機の代替として利用可能であることがデータから示唆されます。この手順を実施する際は、実験前の飼育条件に特に留意することが重要です。すべての実験群および対照群の動物は、特に明暗サイクル、室温、および相対湿度に関して、同様の環境条件下に置かれる必要があります。

また、本手順の後、個体が騒音や臭気刺激にさらされることを最小限に抑える必要があります。特定の実験処置が、全般的な自発運動量に影響を与えることなく、うつ様行動を誘発するかどうかなど、追加の疑問を解消するためには、強制水泳試験などの他の手法を用いることができます。