からの同時プリとポストシナプスの電気生理学的記録アフリカツメガエル神経筋共培養
March 11th, 2013
このビデオでは、胚の初代培養を成長させるために使用する手順を示していますアフリカツメガエル神経や筋肉細胞と同時プリおよびポストシナプスのパッチクランプ記録を作るための本製剤の有用性。
この手順の全体的な目標は、シナプス結合脊髄ニューロンとゼノプス胚からの筋肉細胞の初代培養物を取得することです。これは、まず、ヒト絨毛膜アトロピンをオスとメスの両方のカエルに注射し、受精卵を採取することにより、Xenopusで繁殖を誘導することによって達成されます。2番目のステップは、ステージ22の胚からゼリーコートとファテルと膜を取り除くことです。
次に、脊髄ニューロンと筋肉を胚から分離し、皮膚を切除して廃棄します。最後のステップは、単離された細胞を培養皿にプレートし、機能的な神経筋接合部の形成を可能にすることです。最終的には、培養中のニューロンと筋肉細胞からの同時ペアパッチクランプ記録により、機能的なシナプス結合を実証できます。
この技術の優れた点は、容易にアクセス可能な脊椎動物のシナプス調製物が得られることです。シナプス後電気生理学的記録による神経伝達物質の放出をモニタリングすると同時に、シナプス前イオンの発生を測定するために使用できます。さらに、この方法は明確でわかりやすく、解剖顕微鏡以外の特別な機器を必要とせず、培養物を室温で簡単な培養培地に保存することができます。
この調製は、シナプス前、生化学的、および生物物理学的事象が神経伝達物質の放出とどのように結合するかなど、シナプス生理学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。さらに、それはまたの研究にも有用です 神経調節シナプス形成とシナプス可塑性 この手順を開始するには、添付の原稿に従って必要な溶液を準備します。次に、ガラス製パスティアピペットの端にミニューチンピンを接着することにより、少なくとも2つのマイクロ解剖ツールを製作します。
佐野アクリル接着剤で、ピンの鋭い端がピペットの端から約0.5センチメートル伸びるようにします。培養物を準備する2日前に、雌の目立つ赤みがかった爪のアイカと雄の前足の平面の暗い色素沈着を観察して、繁殖準備ができているXUSのペアを特定します。次に、各カエルをネットで囲み、腹側を下にしてネット付きのシンクに保持して、逃げられるようにします。
1ミリリットルのHCGをネットを通して、背側リンパ袋の1つに皮下注射して、動物が新しく産まれた受精卵を踏みにじらないようにします。タンクの底に1〜2インチを取り付けた半インチのメッシュサイズのスクリーンフロアを取り付けます。次に、繁殖ペアを蓋付きの10ガロンの水タンクに一緒に入れます。
受精卵が画面の下の床で観察されるまで、カエルを12〜48時間邪魔しておきます。次に、動物をタンクから取り出しますが、卵は少なくとも24時間以上邪魔されずに放置します。このカエルのペアは、6週間後に再交配することができます。
次に、タンクの底から胚をほぐし、生理食塩水を10%含む60×15mmの培養皿4つまたは5つに移します。新しいクーペのスキームに従って胚をステージごとに並べ替え、左のような明るい、茶色と白のモデリングで外観が滑らかなFaber胚が理想的です。一方、右側のように大きな黒または白の斑点がある胚は、一般的に不健康で使用できません。
層流フードの内側にラベルを付け、約半分の360 x 15 mmの滅菌培養皿に10%生理食塩水と1つのCMFを充填します。滅菌ガラスパスティエピペットを使用して、フード内のステレオズーム解剖顕微鏡の8つで10%生理食塩水を含む皿の1つに5〜10、ステージ22〜24の胚を移し、2対の滅菌鉗子を使用して各胚からゼリーコートとビエル膜を取り除きます。裸の胚を一度に1つずつ、残りの2つの生理食塩水の皿に通し、最後にCMFを含む皿に通して洗います。
次に、各胚を一対の鉗子で優しく、しかししっかりと保持し、マイクロ解剖ツールを使用して、動物の最も背側に位置する神経管と関連する筋節を切除します。これを行うには、神経管の位置の両端に1つ、神経管のすぐ腹側に3つのスライスを作成します。次に、解剖された各神経管筋節を、卵黄の顆粒やその他の破片から離れた皿のきれいな部分に移動します。
CMFで約15分後、鉗子を使用して色素沈着した皮膚を解剖した組織から持ち上げ、皮膚を廃棄します。さらに30〜60分後、細胞は互いに解離するため、砂の山を形成します。この手順では、10ミリリットルのチューブ状の培養液を解凍し、次に70マイクロリットルのITSを35ナノグラム/ミリリットルで解凍し、BDNF標識し、35ミリメートルの滅菌培養皿をL15培地でほぼ半分まで充填する。
解剖した胚ごとに1つの培養皿を使用してください。メッキピペットを製作するには、ガラス製のパスティエピペットの両端を持ち、テーパー部分を炎の上に置きます。次に、両端を約10センチメートル引き離します。
その後、先端を約0.2ミリメートルまで降伏させるために端を折る。その後、メッキピペットを使用して、1つの胚から積み上げられた砂を吸い込みます。溶液が吸引される量を最小限に抑えるように注意してください。
次に、細胞を培養皿の底に排出し、それらをいくつかのラインにプレートします。次に、メッキされた細胞の皿を少なくとも15分間邪魔されずに放置して、細胞が皿に付着する時間を確保します。培養で12〜24時間後、プレーティングされた細胞は明確な形態学的特性を発現します。
たとえば、筋肉細胞は紡錘形になり、脊髄ニューロンは長いプロセスを発達させます。尿酸、静脈瘤、筋細胞の間の機能的なシナプス接触は、同時ペアの電気生理学的記録で確認できます。そのためには、記録用の2つのパッチ電極を準備します(1つはシナプス前静脈瘤用、もう1つは筋細胞用です)。
次に、シナプス前電極にインフォテリン含有溶液を充填し、シナプス後電極にカリウム内部溶液を充填します。その後、培養皿内の培地をNFRに交換します。その後、フェイスコントラスト光学系を装着した倒立顕微鏡に移し、シナプス前静脈瘤をアムホテリシン含有電極で、シナプス後筋細胞を他方の電極でパッチしてシナプスの機能を確かめ、パッチクランプアンプで静脈瘤を脱分極させ、シナプス前電流とシナプス後電流を同時に観察します。
この図は、めっき直後の細胞と培養の5倍パワービューを示しており、これは同じ40倍での培養です。これは、ニューロンの体細胞、シナプス前、静脈瘤、およびシナプス後筋細胞を示す培養における神経筋接合部です。ここに示されているのは、シナプス前電流とシナプス後電流です。
マイナス30ミリボルトからプラス40ミリボルトまでのシナプス前静脈瘤に提示される10ミリボルトの増分電圧ステップの適用に応答して、両方の細胞の保持電位がマイナス70ミリボルトであったことを一度習得すると、この技術は約2時間で完了することができる。その後、生細胞培養は最短で24時間で取得でき、数日間維持することができます。この調製物はすでに何年も前から使用されており、神経筋伝達の基本的な特性のいくつかを説明するのに役立ちます。
このビデオが、研究者がこの強力でシンプルな手法に精通するのを助けることで、発見の継続を可能にすることを願っています。
概要
このビデオは、胚性キメラの神経と筋細胞の初代培養を育てる手順を示しています。この準備は、シナプス前後のパッチクランプ記録を同時に行うのに役立ちます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 電気生理学
背景
- キメラの胚は、シナプス生理学を研究するための貴重なモデルです。
- 初代培養により、神経筋接合部の検討が可能になります。
- 同時記録により、神経伝達物質放出メカニズムについての洞察が得られます。
- この技術はアクセスしやすく、専門的な機器を最小限に抑えています。
研究の目的
- シナプス結合した脊髄ニューロンと筋細胞の初代培養を得ること。
- ニューロンと筋細胞の間の機能的な接続を研究すること。
- シナプス生理学における重要な問題を調査すること。
使用した方法
- キメラの繁殖誘導と受精卵の収集。
- 胚からの脊髄ニューロンと筋細胞の分離。
- 分離した細胞の培養皿への播種。
- ニューロンと筋細胞からの同時ペアパッチクランプ記録。
主な結果
- 培養中に機能的なシナプス結合を確立できます。
- 培養細胞には特徴的な形態学的特性が現れます。
- 電気生理学的記録によりシナプス活性が確認されます。
- この準備は神経伝達物質放出の研究に効果的です。
結論
- この方法はシナプス生理学を研究するための簡単なアプローチを提供します。
- 神経調節とシナプス可塑性の探求を可能にします。
- この技術は神経科学における基本的な問題に答えるのに有用です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This Xenopus nerve-muscle co-culture system provides a vertebrate model for studying synaptic transmission mechanisms, enabling mechanistic de-risking in early-stage target validation for neuromodulator discovery. Simultaneous pre- and post-synaptic electrophysiological recordings deliver quantitative, causally linked data on ion channel function and neurotransmitter release, supporting predictive confidence in lead compound effects on synaptic physiology. The preparation’s accessibility, room-temperature compatibility, and rapid synapse formation facilitate scalable assay development for phenotypic screening of compounds affecting neuronal excitability or synaptic plasticity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by coupling presynaptic ionic current measurements with postsynaptic neurotransmitter release readouts.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct observation of ion channel modulation effects on synaptic output in a vertebrate context.
- Predictive Value: Provides mechanistic insight into how molecular targets influence synaptic function, aiding portfolio triage of neuromodulator candidates.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates stable, functional synapses within 12–24 hours, enabling timely compound screening windows.
- Quantitative Output: Delivers simultaneous pre- and postsynaptic current measurements as correlated electrophysiological endpoints for dose-response analysis.
- Scalability & Reuse: Uses simple culture media and room-temperature maintenance, supporting multi-well adaptation and cross-project reagent sharing.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models vertebrate neuromuscular junction biology, applicable to studies of neuromuscular disorders and synaptic dysfunction.
- Translational Continuity: Bridges molecular target engagement (e.g., ion channel modulators) to functional synaptic outcomes, informing preclinical efficacy predictions.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables early detection of off-target effects on synaptic transmission, reducing late-stage attrition risk in CNS drug development.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing mechanistic readouts that inform compound progression decisions.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking presynaptic biophysical events (ion fluxes) to postsynaptic responses (neurotransmitter release).
- Screening: Delivers reproducible, dual-parametric electrophysiological outputs suitable for automated patch clamp integration in medium-throughput screening.
- Analytics: Generates synchronized pre- and postsynaptic current traces enabling correlation analysis, IC50/EC50 determination, and kinetic profiling of compound effects.
- Translational Research: Connects ion channel modulation to synaptic strength changes, offering a biomarker-aligned functional readout for preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable vertebrate synaptic platform for iterative screening across multiple target classes (e.g., ion channels, GPCRs, SNARE regulators).
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in synaptic pharmacology by providing direct, simultaneous pre- and postsynaptic measurements.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through defined culture protocols and room-temperature stability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering causally linked electrophysiological data, increasing confidence in target engagement translations.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on validated effects on synaptic vesicle release and presynaptic excitability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell dissociation, patch clamp electrophysiology, and vertebrate tissue handling.
- Dependent on electrophysiology rigs with dual-channel recording capacity and micromanipulators for paired neuron-muscle targeting.
- Necessitates standardization of embryo staging, dissection timing, and culture conditions across users for data comparability.
- Adaptation to disease-relevant models may require genetic or pharmacological perturbation of Xenopus embryos to mimic human pathophysiology.
- Limited to acute synaptic studies (several days post-plating) due to overgrowth constraints, necessitating timely experimental execution.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:41
Pre-experimental Preparation
3:24
Microdissection of Xenopus embryos
4:51
Preparation of Nerve-muscle Co-cultures
5:52
Patch Clamping Nerve-muscle Synapses
7:02
Results: Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures
7:36
Conclusion
