からの同時プリとポストシナプスの電気生理学的記録

本手順の全体的な目的は、ゼノプス胚からシナプス結合した脊髄ニューロンおよび筋細胞の初代培養細胞を得ることです。これは、まずオスとメスの両方のカエルにヒト絨毛性ゴナドトロピンを注射してゼノプスの繁殖を誘導し、受精卵を回収することによって達成されます。次のステップは、ステージ22の胚からゼリーコート、卵黄および膜を除去することです。

次に、胚から脊髄ニューロンと筋肉を単離し、皮膚を除去して廃棄します。最後のステップは、単離した細胞を培養皿に播種し、機能的な神経筋接合部を形成させることです。最終的に、培養したニューロンと筋細胞から同時にペアパッチクランプ記録を行うことで、機能的なシナプス接続を実証することができます。

この手法の優れた点は、脊椎動物のシナプス標本を容易に得られることです。この標本を用いれば、ポストシナプスの電気生理学的記録による神経伝達物質放出のモニタリングと、プレシナプスのイオン発生の測定を同時に行うことができます。さらに、その方法は明快かつ簡便であり、解剖顕微鏡以外の特別な装置を必要とせず、得られた培養物はシンプルな培養液中で室温保存することが可能です。

この調製法は、シナプス前終末における生化学的および生物物理学的イベントが神経伝達物質の放出とどのように結合しているかを含む、シナプス生理学分野における重要な問いに答えるために有用です。さらに、ニューロモジュレーション、シナプス形成、およびシナプス可塑性の研究にも有用です。本手順を開始するために、付属の原稿に従って必要な溶液を調製してください。次に、ガラス製パステールピペットの先端に微小ピンを接着し、微小解剖ツールを少なくとも2本作製します。

Sanoアクリル接着剤を使用して、ピンの尖った端がピペットの末端から約0.5 centimeters飛び出すように固定します。培養準備の2日前までに、メスにある顕著な赤色の爪aikaと、オスの前足の平面部分にある暗色の色素沈着を確認し、繁殖準備が整ったXUSのペアを特定します。次に、それぞれのカエルをネットで捕まえ、ネットに入れたままシンクの中で腹側を下にして保持し、カエルが逃げ出せる状態にします。

動物が産み落とされたばかりの受精卵を踏みつけないようにするため、ネット越しにHCG 1 mLを背側リンパ嚢のいずれかに皮下注射します。タンクの底から1〜2インチの高さに、メッシュサイズが0.5インチのスクリーン床を設置します。その後、繁殖ペアを蓋付きの10ガロンの水槽に一緒に入れます。

スクリーンの下の底面に受精卵が観察されるまで、12〜48時間カエルをそのままにしておきます。その後、カエルをタンクから取り出しますが、卵はさらに少なくとも24時間そのままにしておきます。このペアのカエルは、6週間後に再び交配させることができます。

次に、タンクの底から胚を離し、10% salineを含む4〜5枚の60×15 mm培養皿に移します。Newport and Faberのスキームに従って、胚をステージ別に分類します。左側の例のように、外観が滑らかで、淡い茶色や白色の斑点がある胚が理想的です。一方、右側の例のように、大きな黒色または白色の斑点がある胚は、一般的に不健康であり、使用には適していません。

ラミナーフローフード内で、360 × 15 mmの滅菌培養皿数枚に10% salineを、もう1枚の皿にCMFをそれぞれ半分ほど満たし、ラベルを貼ります。滅菌済みのガラスパステールピペットを用いて、ステージ22から24の胚を5〜10個、10% salineが入った皿の1つに移します。フード内の実体顕微鏡下で、2組の滅菌鉗子を用いて、各胚からゼリーコートと卵膜を除去します。裸の状態になった胚を、残りの2枚の10% salineの皿に1つずつ順に通過させて洗浄し、最後にCMFが入った皿に移します。

次に、各胚をピンセットで優しく、かつしっかりと保持し、マイクロディセクションツールを用いて、動物の最も背側に位置する神経管および関連する筋節を除去します。神経管の両端に1回ずつ、そしてその腹側に1回、計3回の切開を行うことでこれを行います。その後、切り出した各神経管筋節を、卵黄顆粒やその他の破片のない、ディッシュ内の清潔な場所へ移動させます。

CMF中で約15分経過後、ピンセットを使用して色素沈着した皮膚を解剖した組織から剥離させ、皮膚を廃棄します。さらに30〜60分経つと、細胞が互いに解離し、砂山状に蓄積します。この手順では、10 milliliterチューブの培地を融解し、次に35 nanograms per milliliterのITSを70 microliters加え、BDNFラベルを添加し、35 millimeter滅菌培養皿にL 15培地を約半分まで満たします。

解剖した胚1つにつき、培養皿を1枚使用します。播種用ピペットを作成するには、ガラス製パスツールピペットの両端を持ち、先端のテーパー部分を火にかざします。その後、両端を約10センチメートルまで引き離します。

続いて、端を折り、先端が約0.2 mmになるようにします。その後、プレーティングピペットを用いて、胚1個分から砂の山を吸い上げます。この際、溶液の吸引量を最小限に抑えるよう注意してください。

次に、細胞を培養皿の底に排出し、数本のライン状に播種します。その後、細胞が皿に接着するまで、播種した細胞が入った皿を少なくとも15分間静置します。培養後12〜24時間で、播種した細胞に明確な形態学的特徴が現れます。

例えば、筋細胞は紡錘形になり、脊髄ニューロンは長い突起を伸ばします。神経末端の膨大部（varicosity）と筋細胞との間の機能的なシナプス接触は、同時ペア電気生理学的記録によって確認できます。この操作を行うには、記録用のパッチ電極を2本準備し、一方をシナプス前側の膨大部に、もう一方を筋細胞に適用します。

次に、シナプス前電極にinfo terin含有溶液を、シナプス後電極にカリウム内部溶液を満たします。その後、培養皿中の培地をNFRに交換します。続いて、位相差光学系を備えた倒立顕微鏡へと移し、アンフォテリシン含有電極でシナプス前静脈拡張部（varicosity）を、もう一方の電極でシナプス後筋肉細胞をパッチクランプし、シナプスの機能性を確認します。パッチクランプアンプを用いて静脈拡張部を脱分極させ、シナプス前およびシナプス後電流を同時に観察します。

この図は、播種直後の細胞および培養の状態を5倍の倍率で示したものであり、もう一方は同じ培養物を40倍で示したものです。こちらが培養における神経筋接合部であり、ニューロンの細胞体、シナプス前終末の静脈瘤状膨大（varicosity）、およびシナプス後の筋細胞が示されています。ここに、シナプス前電流およびシナプス後電流が示されています。

シナプス前終末に-30 mVから+40 mVまで10 mV刻みの電圧ステップを印加し、その応答を測定した際、両細胞の保持電位は-70 mVに設定した。この手法に習熟すれば、約2時間で完了できる。その後、早ければ24時間で生存細胞の培養株を得ることができ、数日間にわたって維持することが可能である。この調製法はすでに数年前から使用されており、神経筋伝達の基本的性質の一部の解明に寄与している。

このビデオが、研究者の皆様にこの強力かつシンプルな手法に習熟していただく一助となり、さらなる発見へとつながることを期待しています。