exの子宮内エレクトロポレーションと全半球植：早期皮質の発達についての研究のための簡単な実験方法

本手順の全体的な目的は、初期皮質発達の研究のために大脳半球全体の外植片を調製することです。まず、胚齢13日のマウス胚を採取します。次に、プラスミドDNA混合液を大脳室に注入し、子宮外電穿孔法を行います。

次に、エレクトロポレーションを行った胚から大脳半球全体の切片標本を調製します。最終ステップとして、組織学的解析のために大脳半球全体の切片標本を固定し、薄切します。最終的に、GFPを発現しているニューロンの免疫組織学的解析により、変異または毒素への曝露が皮質ニューロンの発達に及ぼす影響を評価することができます。

私はエリック・オルソンです。シラキュースにあるSUNYアップステート医学大学の神経科学・生理学部門に所属しています。本日は、私たちが開発した「全半球外植え（whole Hemisphere X explan）」という手法をご紹介します。スライス外植えなどの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、全半球外植えは調製が簡単であり、2日間の器官培養的な成長が可能であるという点です。

この手法は、特定の変異や毒素が初期の皮質発達をどのように阻害するかなど、神経発達分野における重要な疑問への回答に役立ちます。一般的に、この手法に不慣れな人は、髄膜を損傷させずに大脳半球全体を摘出・展開（explan）する準備に習熟が必要となるため、苦労することがあります。組織が機械的な刺激に非常に敏感であるため、解剖および展開組織の移送ステップを習得することは困難であり、本手法の視覚的な実演が極めて重要となります。

手順の実演は、私の研究室のポスドクであるTheresa Ozzi博士が行います。このプロトコルでは、市販のキットを使用してプラスミドを精製してください。プラスミドDNAを水で0.33 milligrams per milliliterに調製し、注入トレーサーとしてfast green dyeを約0.02%Weight by volume添加します。手術器具、作業スペース、および顕微鏡は必ず消毒してください。

70% ethanolで消毒した後、胚齢13日（E 13）のSwiss Webster母マウスを必要な数だけ二酸化炭素吸入により安楽死させます。胚を取り出したら、氷冷したHBSSを入れた10 cmディッシュに移し、ディッシュを氷上で冷却したまま保持します。周囲の胚外膜から各胚を慎重に剥離します。

次に、各胚を個別に、氷冷したHBSSが入った清潔なディッシュに移します。ハミルトンシリンジを用いて、調製したDNAを2〜3 µL、左大脳半球の脳室に注入します。将来的な解析に用いる予定の皮質領域内、またはその付近には注入しないでください。

DNAをエレクトロポレーションするために、胚をピンセットで優しく保持し、ツイザー電極の陽極パドルを頭部の背側正中線に軽く当てます。陰極パドルを胚の顎の下に軽く当てます。BTX 830モデルを用い、30 Vのパルスを5回、各50 ms、1秒間隔で照射するプログラムを実行します。その他のシステムを使用する場合は、製造元の指示に従って設定してください。

各胚を氷冷したHBSSに戻し、2本の5番精密ピンセットを用いて解剖顕微鏡下で大脳半球全体の剥離操作を行います。胚の頭部から皮膚と軟骨性の頭蓋骨を取り除きます。次に、ピンセットを脳の下に滑り込ませます。

頭蓋骨から脳をそのまま取り出すために、中脳組織を含む電気穿孔した半球を切り出します。切り出した皮質半球の上にある髄膜を損傷しないように注意してください。髄膜を損傷させずに電気穿孔した半球を切り出し、除去することが、最も習得が困難なステップであると考えられます。

切開後、幅を広げた1 mLピペットチップを使用して、各半球を5 mLの氷冷HBSSに移します。必要に応じて、胚を12ウェル組織培養プレートの別々のウェルに保持して保存できます。次に、最大6つの半球を24 mmのコラーゲンコート培養皿に慎重に移します。

インサートを挿入し、内側を下にして配置します。次に、6ウェルプレートの35 mmウェルに、補完済み培地を2.7 mL分満たします。インサートから余分なHBSSを取り除き、培地が入ったウェルにインサートを配置します。ウェル内の培地を数滴、各外植片の上にピペットで滴下してください。

培地の量を増やさないでください。X外植片の上に培地を数滴滴下し、X外植片が培地で完全に覆われないようにすることが極めて重要であることが分かりました。これは、X外植片上の2.7 mlの培地に加えて、最大400 µLまで添加することを意味します。

ディッシュを、加湿用の水が入ったディッシュが設置されており、少なくとも1分間95%酸素が充満しているBillups-Rothenbergチャンバーに移します。チャンバーを密閉し、ガス供給チューブを取り外します。チャンバーを37°Cのインキュベーターに2日間置き、その間にプレプリ splitting（分割）が行われるようにします。

準備段階です。外植体を埋め込むためのパッドを作成します。60 °Cで10%の仔牛皮ゼラチン溶液を調製してください。

可溶化した後、溶液約10 millilitersを10 centimeterのディッシュに注ぎます。残りの溶液は後で使用するため、60 degrees Celsiusで保持してください。必要に応じて、パッドが凝固するまで30分間放置します。

4°Cで数日間保存可能ですが、使用前に室温に戻す必要があります。固定を行う当日に、ドラフトチャンバー内でPagano固定液および固定剤を含まないPagano溶液を調製します。固定液を37°Cに温めてください。

組織を乱さないよう細心の注意を払い、迅速にインキュベーターから外植片を取り出します。培地の大部分を除去し、温めておいた固定液 5 mL と交換します。各外植片が完全に浸っていることを確認してください。

組織を室温で1時間固定します。その後、固定液を除去し、Pagano溶液に置換します。固定液は使用しないでください。

各ウェルに10%アジ化ナトリウムを数滴加えます。これで、組織をエンベディングパッドに埋め込むまで4°Cで保存できます。定規を用いて、ディッシュの底に格子線を引きます。

2〜3 cm四方の正方形に切り出します。個々の外植片を埋め込みパッドに移します。残った溶液をピペットで取り除き、各外植片を温めた10%ゼラチン溶液で覆います。

凝固するまで待ちます。ゆっくりと凝固したら、各外植え組織が完全に囲まれるまでゼラチン溶液を追加します。一度に大量のゼラチンを添加するとパッドが溶ける可能性があるため、避けてください。

次に、ゼラチンを約1時間静置して凝固させます。凝固後、個々のexplanを小さなゼラチンブロックに切り分け、薄切します。これらのブロックをPagano固定液で1〜2日間後固定することが重要です。

切片作成時、外植片の嗅球を上にして配置し、冠状面で100 µmの厚さに切断します。切片は0.1%アジ化ナトリウムを含む冷却済みのPBSで回収してください。

切片は、概説した手法で染色を行うまで4 °Cで保存します。前板の分裂前に、E 13で半球全体の外植片を調製しました。背側新皮質において。

この組織には、興奮性皮質系統の未熟ニューロンを報告するトランスジェンが導入されていました。同一リターからの皮質外植片を、in vitroで2日間にわたり順次ドロップ固定し、その後の組織学的解析に供しました。初期解析時点であるDIV 0では、フィールド1においてプレップの分割はまだ起こっていませんでした。

CPが顕在化し、2D IVまで成長し続けました。したがって、E 13で採取して培養した大脳半球外植片全体は、大脳皮質の成熟を2日間維持し、背側新皮質における初期の分裂を捉えたことで、背側新皮質の正常な組織学的発達が確認されました。2D IV外植片を、コンドロイチン硫酸、プロテオグリカン、および細胞外マトリックス成分で免疫染色しました。背側皮質における2本の免疫反応性のバンドは、in vitro培養期間中にPPPがMZとSPに適切に分裂したことを示していました。

PPは、CTIP2およびTBR1を発現する6つの皮質ニューロンによって分割されました。これらのマーカーの免疫染色パターンにより、新しく形成されたcpにおいてこれらの転写因子が適切に発現していることが確認されました。これらの解析を総合すると、記述されたプロトコル全体を用いて、未処置のE13胚の左心室に注入することにより、全半球外植片においてORGANOTYPICな初期皮質発生が起こることが確認されました。

vz内の神経前駆細胞において、エレクトロポレーション後の処理によるGFP発現が観察されました。IZおよびcpに強発現するGFP陽性細胞が見られた一方で、重要な点として、形成されつつあるCPの上部に、樹状突起と軸索を伸ばし始めた多数のGFP陽性ニューロン（矢印頭で表示）が観察されました。CPとMZの界面における明確な層の形成は、適切な移行、停止、および層形成が行われたことを示しています。

樹状突起はMZへと伸展し、皮質皮質軸索はCPの下方、およびIZへと伸展していた。分化中の細胞はGFP陽性細胞であり、放射状グリア線維に隣接する双極形態のニューロンや、その下方のIZにある多極ニューロンなど、さまざまな成熟段階にあった。また、樹状突起はMZへも伸展しており、そこにはECMタンパク質のreelinが適切に免疫局在していた。

したがって、エレクトロポレーションおよび外植片の条件は、皮質ニューロンの正常な発達を可能にします。予想通り、有糸分裂後のGFP陽性ニューロンが形成過程のcpに集積しました。以上のことから、本プロトコルはL6皮質ニューロンを確実に標的とすることができ、それらの遊走および成熟の研究に適用可能です。

本手順を広範囲に適用した結果、79%の成功率が得られました。248回の試行のうち195回が、イメージングおよび解析に適した結果となりました。失敗した例の半分は、GFPの発現不全または標的GFPの検出漏れによるものでしたが、習得後の成功率は向上します。

適切に行えば、この手法は90分で完了させることができます。この手順を行う際は、電気穿孔後の脳半球を、その後の工程で髄膜が完全な状態で培養できるように、解剖の練習をしておくことが重要です。目的の変異が神経細胞の遊走や樹状突起形成にどのように影響するかといった追加の疑問を解決するために、タイムラプス顕微鏡法などの他の手法を併用することも可能です。