Name: exの子宮内エレクトロポレーションと全半球植：早期皮質の発達についての研究のための簡単な実験方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: 学ぶ ex uteroエレクトロポレーションと全半球エクスプラント法を用いたマウス胎児の早期皮質発達研究。この手法により遺伝子機能や薬理学的影響を評価できます。

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この作品は、NINDS（NS066071）とNIAAAからの助成金をサポートされていました。 （P50AA017823）エコへ。著者は、ロバート·クインと動物のケアのための実験動物資源学科のスタッフに感謝します。私たちは夏の学部リサーチフェロー（SURF）などの支援については、テクニカル·サポートのためにニコールBelletierをジャドソンベルモントに感謝します。また、コメントにデビッドキャメロンに感謝し、原稿の以前のバージョンで編集します。

プラスミドグリーン蛍光タンパク質発現との1。 のEx子宮内エレクトロポ<ol><li>プラスミドDNAの注射液は、蒸留H 2 O中0.33 mg / mlの最終作業濃度まで希釈したCAG-EGFP DNAを27を用いて製造されるキアゲン遠藤フリーマキシプレップは、形質転換された細菌からプラスミドを精製するために使用されています。 〜0.02％（w / vの最終）での高速グリーン色素が注入トレーサとしてのDNA溶液に添加される。 </li><li>外科領域を用意し、70％エタノール溶液でベンチトップと解剖顕微鏡のステージを下スプレーして拭いてください。前切開に70％エタノールで手術用のハサミとピンセットをスプレーし、水分を拭き取ります。 </li><li>すべての動きは、少なくとも1分間停止するまで時限妊娠スイス/ウェブスターダムは加圧シリンダからCO 2を充填し、ダムが監視されるチャンバ内に転送することによりE13に屠殺されています。 CO 2吸入によって犠牲にした後の胚は子宮から取り出され、内に配置10cmペトリ皿含む氷冷ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）。 </li><li>慎重に周囲の胚体外膜から各胚を分析し、氷冷HBSSに保つ。 </li><li>冷HBSSを含む第二の10cmペトリ皿に個別に各胚を転送します。将来の分析のために皮質領域から空間的に分離した皮質領域に注入するために世話をして、左大脳半球の脳室にDNA速い緑混合の2-3μlを注入するためにハミルトンシリンジを使用しています。 </li><li>エレクトロポには、鉗子で軽く胚を保持し、軽く頭の背側正中線上にピンセット電極の正のパドルを置き、軽く胚のあごの下に負のパドルを置く。エレクトロポを950ミリ秒間隔で区切った50ミリ長さの5〜30 Vのパルスを提供するようにプログラムBTX830エレクトロで達成される。これらの設定はBTX830モデル用です。他のシステムは、製造業者の命令に従って使用することができるNS。 </li></ol> 2。全体の半球植準備<ol><li>エレクトロポレーション後の胚は氷冷HBSSに戻されています。脳は胚ヘッドから皮膚と軟骨頭蓋骨を除去するために2つの＃5宝石商の鉗子を用いて除去する。鉗子は、その後、頭蓋骨から無傷の脳を削除するには、脳の下にスライドさせる。エレクトロポレーションした半球（左）は、脳から離れて解剖され、添付された中脳組織が削除されます。解剖手順ケアを通して左半球皮質を覆う髄膜に損傷を与えないように注意されています。 </li><li>一度解剖し、各胚は、カット1ミリリットルピペットチップでピペッターを使用してHBSS中に転送されます。半球は優しくコラーゲンコート培養インサート上に排出されます。最大6つの半球の外植片には、各24ミリメートルの挿入時に内側を下に配置されている。一度配置された、過剰HBSSをインサートから削除され、挿入はその後6ウェル皿のウェル1 35ミリメートルに配置されます。井戸はエクサが含まれていますメディアのctly 2.7ミリリットル：グルタマックスと2％のB-27を補充し、1％G5および1％ペニシリン - ストレプトマイシンを含むDMEM-F12培地。井戸からのメディアの数滴は、各外植片の上にピペッティングすることができますが、ウェルあたり2.7ミリリットルのオリジナル過剰にメディアを追加しないでください。 </li><li>外植片はコラーゲンフィルター上に配置されていたら、外植片を含む6ウェルディッシュはビラップスローゼンバーグ（BR）の室（また、水の加湿皿を含む）に置かれます。 95％/ 5％酸素/ CO 2混合ガスは、チャンバを閉じて密封し、95％/ 10％酸素/ CO 2ガス供給管を切断する前に、少なくとも1分間チャンバー内に注入される。 BR室は、その後培養期間の残りの37℃の組織培養インキュベーター、1-2 DIVに配置されます。 </li></ol> 3。組織学的検査のための植組織の固定<ol><li>ドラフト内で予熱した（〜80＆ド100ml中のホルムアルデヒドの最初の可溶化8グラムによってパガーノ固定溶液を調製グラム、C）蒸留H 2 O可溶化を促進し、穏やかに攪拌し、NaOHを集中して1-3滴を追加します。一度500mMのスクロース、100mMのHEPES、pH7.4で、50 mMのMgCl 2、250mMスクロース、50mMのHEPES中4％パラホルムアルデヒドの最終濃度5mMのKClであることは、ソリューションに8％パラホルムアルデヒド溶液を1:1で混ぜて可溶化、25 mMのMgCl 2、2.5mMのKClで、pHは7.4。 </li><li>外植片を37℃にパガーノ修正液を温める修正するには迅速に各ウェルの培養物からDMEM/F12メディアのほとんどを除去し、外植片の各ウェルにパガーノ修正5mlを加える。修正で完全に各外植片をカバーすることを確認してください。室温で1時間を修正しました。前に固定の1時間にフィルターから外植片を外さないでください。 </li><li>固定後パガーノ修正液を除去し、修正せずにパガーノ溶液（250mMスクロース50mMのHepes、25mMのMgCl 2を 、2.5mMのKClを、pH 7.4）で置き換えます。埋め込みまで4℃で10％のアジ化ナトリウムや店舗℃で数滴を追加します。 </li></ol> 4。埋め込みとS組織学のためectioning <ol><li>温水（55℃）100mlにふくらはぎ皮ゼラチン10gを可溶化することにより10％ウシ皮膚ゼラチン溶液を調製します。ホットプレートの上に置いてゼラチン溶液は、可溶化されるまで、定期的に60℃と渦を設定します。 </li><li> 10cmペトリ皿の底に10％のゼラチン溶液約10mlを注ぎ、30分が凝固することができます。これは、外植片を埋め込むための &quot;パッド&quot;を形成します。これらのパッドは、事前に準備された日とし、4℃で保存することができますシャーレの底に格子を描き、グリッドの各ボックスに、個々の外植片を転送するために定規を使用しています。残留パガーノ溶液を除去し、ピペッターを使用して、暖かい10パーセントゼラチン溶液で各外植片をカバーし、固化することができます。各外植片が完全にあまりにも多く、一度に温めるゼラチンを添加することによりパッドを溶融しないように注意しながら、ゼラチンで囲まれるまでゼラチン溶液をゆっくり添加を再開します。 〜1時間硬化さゼラチンを可能にします。一度個々ををかたくなにUAL外植片は、ゼラチンの小さなブロックに切り出すことができる。ブロックは、前ビブラトームとセクショニングに24〜48時間の修正パガーノで後固定されています。 </li><li>ゼラチンブロック内の外植片は嗅球を配置し、厚さ100μmにおける前頭面に区画されています。セクションは、収集され、保管され、PBS中の4で+ 0.1％アジ化ナトリウム°Cの免疫組織化学的処理まで。 </li><li>免疫組織化学的検出、24ウェルプレート（ウェルあたり2から3節）にセクションを転送することによって行われます。 + B（PBS + 0.5％トリトンX 100、2％BSA）を0.5ミリリットルPBSTを追加することにより、結合の最初のブロック、非特異的抗体を各ウェルに、穏やかに振盪しながら1時間インキュベートする。適切な一次抗体は、その後、PBST + Bで希釈し、ウェルあたり0.4mlを室温で一晩のインキュベーションのために追加されます。プライマリは3X PBSは、少なくとも10分間ずつ洗浄して洗い流す。二次抗体、2μg/ mlのヘキスト33342核染色法は、その後、PBST + Bで希釈し、サンプルを室温で2時間インキュベートする。穏やかに振盪しながら。三PBSの洗浄（10分毎に）が実行され、その後のセクションでは、90％グリセロール、50mMトリス、pH7.4の、マウントメディアを使用して、スライド上に搭載されている。 </li></ol>

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著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

全体の半球外植片 - - 早期皮質発達の研究（E13-E15）のための我々は実験モデルを改善し、評価した。モデルは、移行および大脳皮質25,37の層6を構成する興奮性ニューロン系統の分化の解析に有用であることが証明されました。システムの主な利点は、準備が単純、脳の発達のこの早期、臨界期中にエレクトロポレーション、薬理学的操作とイメージングのためのニューロン〜3）実験的なアクセス））2 DIVの器官の成長、2 1アール。我々は、形態、方向、およびpreplate分割の期間中に6層の皮質ニューロン7,38の樹枝状成長の微妙な違いを文書化するシステムを使用している。 層6を移入興奮性神経細胞は、主に背側視床39,40に逆数の入力を提供corticothalamic投射ニューロンから構成されている</sup&gt;と皮質41における神経機能の同期で機能的に参加するという仮説を立てている。これらのニューロンは生理的に特化しているが、層の生成、移動および成熟過程6層ニューロンの大脳皮質の2-6のすべての...

連続して生成されたニューロンの協調的な増殖、遊走及び分化を通じて哺乳類大脳皮質を形成する。各ニューロンは脳室帯に生まれた（VZ）と皮質板（CP）の1を形成し 、中間帯（IZ）にVZから移動されています。彼らは異なる皮質領域を通過する際、移行のニューロンが細胞外環境と開発組織内の他の細胞成分（ 例えば放射状グリア）に依存する移行2,3の複数のモードを表示します。皮質ニューロンはその後ニューロン移動の逮捕とdendritogenesis 4の同時プロセスにおける成形皮質板の上部に移行を逮捕。 皮質の発達は、胚の始原日網状層6またはpreplate（PP）、その上に重なるVZパイオニアニューロンの層の設立を通じて、11月13日（E11-13）5との間で開始されます。プロスペクティブその後層6皮質ニューロン（VZで生まれすなわち第一皮質ニューロン）の向きは、そのステレオタイプのパターンで細胞体およびPP 7内の別個の層に合体。これらのイベントは、表面的な限界（将来の皮質第1層）とディープゾーン、サブプレート細胞（一過性皮質の第7層）から成る後者にpreplateを分割します。このプロセスは、preplate分割と呼ばれる、大脳皮質8の将来の成長の基盤となるイベントです。 多くの遺伝的変異は皮質発達9の様々な側面を混乱させることが確認されている。皮質の開発も悪影響コカイン10とアルコール11と摂取毒素への暴露によって影響を受ける可能性があります。開発中に発生する皮質奇形、神経障害（ 例えば自閉症、統合失調症）への貢献者である可能性が高いので、皮質発達に摂動の実証的調査が内在している重要LY。これは、遺伝的または毒素効果の迅速なアッセイを可能にするだけでなく、脳の発達12の初めに、この期間中に差別ニューロン、他のタイプの細胞と細胞外マトリックス（ECM）との間の相互作用の可能性を維持することが皮質の発達を研究するための手法を確立するためにかなりのに重要である。 スライス外植片13は、このようなシステムを提供していると広くアッセイ皮質ニューロンの発達14から16に使用されてきた。しかし、スライスアッセイは、神経細胞の遊走およびラミネーションは、おそらく脳の発達とアンカー放射状グリア足場を囲む髄膜細胞への損傷によって17異常なことができないという欠点に苦しむことができます。放射状グリア繊維はスライスによる基底膜の皮質ニューロンの移行18中断のための重要な基質であるとしてローカルに放射状グリアアーキテクチャを混乱させ、変化した皮質の移行につながる可能性があります。加えてSLI外植片の表面CEDは、これらの分野におけるECMの通常の構図を変化させることができる死んだ細胞の領域を提供します。 より最近のアプローチは適切な健康な細胞型とECMに囲まれているスライスの奥深くにある細胞に自分の分析を当てている。しかし、いくつかのケースでは、これらの新しいアプローチは、元の厚い培養スライスはスライスの比較的正常なインテリアが分析19から21のために利用可能になるように固定後、凍結切片またはパラフィン包埋切片であることを必要とすることができます。文化だけでなく、分析のために固定されたスライスのその後の凍結セクショニングのライブスライスを準備するセクショニングオリジナルビブラトーム両方がこれらのアッセイのためのケアと労力が動作する必要があります。 初期の皮質の発達についての研究のためのシンプルな、補完的なアプローチを提供するために、我々は初期の皮質の発達についての研究を促進する13既存のスライスのアプローチを変更しました。我々は、WHを開発した65分当たりの回転数と16〜18時間22,23に対して許可される器官の成長で振とう培養を関与して既存のE14全半球モデルに似たOLE半球植モデル。我々のアプローチでは、全体の半球の外植片を48時間器官皮質の成長を延長するために、高酸素培養雰囲気21,24内で半透膜13の上に配置されます。また、このアプローチは、皮質ニューロンの開発の一貫したエレクトロポレーションを可能にします。胚が子宮から取り出され、プラスミドDNAを導入するエレクトロポレーションとは、その後、終脳解剖されています。各半球を単離し、コラーゲンコートフィルタで内側を下に配置されます。外植片は、その後、48時間、preplate分割8を含む期間の期間培養する。培養期間中、L6のニューロンは皮質板内に正しく配置区別ニューロン25に前駆体から開発しています。この期間を通じて開発神経細胞は、 生体内の対応するセルに立ち向かうであろう適切なECMと細胞型に囲まれています。このシステムはすでにエタノール毒性26、層6の形成とpreplate分割7,25の根底にある携帯電話のイベントを解読に貴重であると判明しました。

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td><td>GIBCO</td><td>10565</td><td></td></tr><tr><td>G5 Supplement 100X</td><td>Invitrogen</td><td>17503-012</td><td></td></tr><tr><td>B27 Serum-Free Suppl. 50X</td><td>Invitrogen</td><td>1504-044</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep Liquid 100X</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 500 ml</td><td>GIBCO</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>培養インサートコラーゲンコーティング</td><td>Costar</td><td>3492</td><td></td></tr>ウ<tr><td>シ皮膚ゼラチン</td><td>シグマ</td><td>G9382</td><td></td></tr><tr><td>H&#8211;chst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma</td><td>7906</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree プラスミド マキシキット</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BTX 830 エレクトロポレーター</td><td>ハーバード装置</td><td>450052</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット電極 10mm</td><td>ハーバード 装置</td><td>450166</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>Billups Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>ハミルトン シリンジ (5uL)</td><td>ハミルトン</td><td>87930</td><td></td></tr><tr><td>ハミルトン シリンジ ニードル</td><td>ハミルトン</td><td>7803-04</td><td>1 インチ 4</td></tr><tr><td>インチ デュモン #5 鉗子</td><td>FST</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>ファインはさみ タフカット 9 cm</td><td>FST</td><td>14058-09</td><td></td></tr></tbody></table>

exの子宮内エレクトロポレーションと全半球植：早期皮質の発達についての研究のための簡単な実験方法

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

皮質の発達は、前駆細胞、血管、髄膜および関連する細胞外マトリックスを含む神経細胞と非神経要素間の複雑な相互作用を伴います。彼らは適切な器官の環境を提供するため、皮質スライス外植片は、多くの場合、ニューロンの分化·発達を制御し、それらの相互作用を調べるために使用されます。有益なものの、スライス植モデルは異常な細胞積層および移行などの欠点に苦しむことができます。ここでは、皮質切片より準備が簡単で、一貫性のある器官の移行およびラミネーションを示す初期の皮質の発達についての研究のために全体の大脳半球の植​​システムについて報告する。このモデルシステムでは、初期のラミネーションと移行パターンは、preplate分割の期間を含め、in vitroでの 2日間にわたって、通常の前向き皮質層の間に6フォームを進みます。次に、 元の子宮内エレクトロポレーション（EUEP）を開発背内側皮質に開発ニューロンにGFPの発現を標的に〜80％の成功を実現したアプローチ。 全体の半球植モデルはエレクトロポレーション、薬理学的介入とライブイメージングアプローチのための初期の皮質発達にアクセスできるようになります。トランスフェクションおよび面積ターゲティング一貫性の両方を向上させながら、この方法では、 子宮内エレクトロポレーション（IUEP）アプローチで求められる生存の手術を回避することができます。この方法では、神経細胞の増殖、遊走および分化の実験的研究を促進するであろう。

げっ歯類の胚性皮質が発達期間を通して横neurogenetic勾配を示し、そのようなその横新皮質は、背内側皮質28よりも約1日より成熟している。 6層のニューロンの大部分はこのように横皮質でE12に（また、フィールド40 5と呼ばれる）とE13で背内側野（またフィールド1〜5と呼ばれる）で（S期の最終的なを示すIE）が生成されます。 Preplate分割は6層ニューロンの生成後約1日から始まりますので、E13の上の横皮質およびE14の上で背側皮質で開始されます。 preplate分割と皮質板の開発の開始を検討するために、我々は全体の大脳半球がE13からE15（ 図1）に一般的に培養されたことを21,24などのスライス植アッセイを変更しました。 我々は全体の半球外植dの成長を調べることにより、皮質植技術の実行可能性をテストしたTG（Eomes :: EGFP）GSATマウス（ 図2）からerived。このマウス系...

このプロトコルは含ま改良植手順を説明<em&gt; EX子宮</em&gt;マウス胎児から全体の大脳半球のエレクトロポレーション、解剖や文化。準備が早い皮質開発中に遺伝子機能の薬理試験およびアッセイを容易にします。

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

本手順の全体的な目的は、初期皮質発達の研究のために大脳半球全体の外植片を調製することです。まず、胚齢13日のマウス胚を採取します。次に、プラスミドDNA混合液を大脳室に注入し、子宮外電穿孔法を行います。次に、エレクトロポレーションを行った胚から大脳半球全体の切片標本を調製します。最終ステップとして、組織学的解析のために大脳半球全体の切片標本を固定し、薄切します。最終的に、GFPを発現しているニューロンの免疫組織学的解析により、変異または毒素への曝露が皮質ニューロンの発達に及ぼす影響を評価することができます。私はエリック・オルソンです。シラキュースにあるSUNYアップステート医学大学の神経科学・生理学部門に所属しています。本日は、私たちが開発した「全半球外植え（whole Hemisphere X explan）」という手法をご紹介します。スライス外植えなどの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、全半球外植えは調製が簡単であり、2日間の器官培養的な成長が可能であるという点です。この手法は、特定の変異や毒素が初期の皮質発達をどのように阻害するかなど、神経発達分野における重要な疑問への回答に役立ちます。一般的に、この手法に不慣れな人は、髄膜を損傷させずに大脳半球全体を摘出・展開（explan）する準備に習熟が必要となるため、苦労することがあります。組織が機械的な刺激に非常に敏感であるため、解剖および展開組織の移送ステップを習得することは困難であり、本手法の視覚的な実演が極めて重要となります。手順の実演は、私の研究室のポスドクであるTheresa Ozzi博士が行います。このプロトコルでは、市販のキットを使用してプラスミドを精製してください。プラスミドDNAを水で0.33 milligrams per milliliterに調製し、注入トレーサーとしてfast green dyeを約0.02%Weight by volume添加します。手術器具、作業スペース、および顕微鏡は必ず消毒してください。70% ethanolで消毒した後、胚齢13日（E 13）のSwiss Webster母マウスを必要な数だけ二酸化炭素吸入により安楽死させます。胚を取り出したら、氷冷したHBSSを入れた10 cmディッシュに移し、ディッシュを氷上で冷却したまま保持します。周囲の胚外膜から各胚を慎重に剥離します。次に、各胚を個別に、氷冷したHBSSが入った清潔なディッシュに移します。ハミルトンシリンジを用いて、調製したDNAを2〜3 µL、左大脳半球の脳室に注入します。将来的な解析に用いる予定の皮質領域内、またはその付近には注入しないでください。DNAをエレクトロポレーションするために、胚をピンセットで優しく保持し、ツイザー電極の陽極パドルを頭部の背側正中線に軽く当てます。陰極パドルを胚の顎の下に軽く当てます。BTX 830モデルを用い、30 Vのパルスを5回、各50 ms、1秒間隔で照射するプログラムを実行します。その他のシステムを使用する場合は、製造元の指示に従って設定してください。各胚を氷冷したHBSSに戻し、2本の5番精密ピンセットを用いて解剖顕微鏡下で大脳半球全体の剥離操作を行います。胚の頭部から皮膚と軟骨性の頭蓋骨を取り除きます。次に、ピンセットを脳の下に滑り込ませます。頭蓋骨から脳をそのまま取り出すために、中脳組織を含む電気穿孔した半球を切り出します。切り出した皮質半球の上にある髄膜を損傷しないように注意してください。髄膜を損傷させずに電気穿孔した半球を切り出し、除去することが、最も習得が困難なステップであると考えられます。切開後、幅を広げた1 mLピペットチップを使用して、各半球を5 mLの氷冷HBSSに移します。必要に応じて、胚を12ウェル組織培養プレートの別々のウェルに保持して保存できます。次に、最大6つの半球を24 mmのコラーゲンコート培養皿に慎重に移します。インサートを挿入し、内側を下にして配置します。次に、6ウェルプレートの35 mmウェルに、補完済み培地を2.7 mL分満たします。インサートから余分なHBSSを取り除き、培地が入ったウェルにインサートを配置します。ウェル内の培地を数滴、各外植片の上にピペットで滴下してください。培地の量を増やさないでください。X外植片の上に培地を数滴滴下し、X外植片が培地で完全に覆われないようにすることが極めて重要であることが分かりました。これは、X外植片上の2.7 mlの培地に加えて、最大400 µLまで添加することを意味します。ディッシュを、加湿用の水が入ったディッシュが設置されており、少なくとも1分間95%酸素が充満しているBillups-Rothenbergチャンバーに移します。チャンバーを密閉し、ガス供給チューブを取り外します。チャンバーを37°Cのインキュベーターに2日間置き、その間にプレプリ splitting（分割）が行われるようにします。準備段階です。外植体を埋め込むためのパッドを作成します。60 °Cで10%の仔牛皮ゼラチン溶液を調製してください。可溶化した後、溶液約10 millilitersを10 centimeterのディッシュに注ぎます。残りの溶液は後で使用するため、60 degrees Celsiusで保持してください。必要に応じて、パッドが凝固するまで30分間放置します。4°Cで数日間保存可能ですが、使用前に室温に戻す必要があります。固定を行う当日に、ドラフトチャンバー内でPagano固定液および固定剤を含まないPagano溶液を調製します。固定液を37°Cに温めてください。組織を乱さないよう細心の注意を払い、迅速にインキュベーターから外植片を取り出します。培地の大部分を除去し、温めておいた固定液 5 mL と交換します。各外植片が完全に浸っていることを確認してください。組織を室温で1時間固定します。その後、固定液を除去し、Pagano溶液に置換します。固定液は使用しないでください。各ウェルに10%アジ化ナトリウムを数滴加えます。これで、組織をエンベディングパッドに埋め込むまで4°Cで保存できます。定規を用いて、ディッシュの底に格子線を引きます。2〜3 cm四方の正方形に切り出します。個々の外植片を埋め込みパッドに移します。残った溶液をピペットで取り除き、各外植片を温めた10%ゼラチン溶液で覆います。凝固するまで待ちます。ゆっくりと凝固したら、各外植え組織が完全に囲まれるまでゼラチン溶液を追加します。一度に大量のゼラチンを添加するとパッドが溶ける可能性があるため、避けてください。次に、ゼラチンを約1時間静置して凝固させます。凝固後、個々のexplanを小さなゼラチンブロックに切り分け、薄切します。これらのブロックをPagano固定液で1〜2日間後固定することが重要です。切片作成時、外植片の嗅球を上にして配置し、冠状面で100 µmの厚さに切断します。切片は0.1%アジ化ナトリウムを含む冷却済みのPBSで回収してください。切片は、概説した手法で染色を行うまで4 °Cで保存します。前板の分裂前に、E 13で半球全体の外植片を調製しました。背側新皮質において。この組織には、興奮性皮質系統の未熟ニューロンを報告するトランスジェンが導入されていました。同一リターからの皮質外植片を、in vitroで2日間にわたり順次ドロップ固定し、その後の組織学的解析に供しました。初期解析時点であるDIV 0では、フィールド1においてプレップの分割はまだ起こっていませんでした。CPが顕在化し、2D IVまで成長し続けました。したがって、E 13で採取して培養した大脳半球外植片全体は、大脳皮質の成熟を2日間維持し、背側新皮質における初期の分裂を捉えたことで、背側新皮質の正常な組織学的発達が確認されました。2D IV外植片を、コンドロイチン硫酸、プロテオグリカン、および細胞外マトリックス成分で免疫染色しました。背側皮質における2本の免疫反応性のバンドは、in vitro培養期間中にPPPがMZとSPに適切に分裂したことを示していました。PPは、CTIP2およびTBR1を発現する6つの皮質ニューロンによって分割されました。これらのマーカーの免疫染色パターンにより、新しく形成されたcpにおいてこれらの転写因子が適切に発現していることが確認されました。これらの解析を総合すると、記述されたプロトコル全体を用いて、未処置のE13胚の左心室に注入することにより、全半球外植片においてORGANOTYPICな初期皮質発生が起こることが確認されました。vz内の神経前駆細胞において、エレクトロポレーション後の処理によるGFP発現が観察されました。IZおよびcpに強発現するGFP陽性細胞が見られた一方で、重要な点として、形成されつつあるCPの上部に、樹状突起と軸索を伸ばし始めた多数のGFP陽性ニューロン（矢印頭で表示）が観察されました。CPとMZの界面における明確な層の形成は、適切な移行、停止、および層形成が行われたことを示しています。樹状突起はMZへと伸展し、皮質皮質軸索はCPの下方、およびIZへと伸展していた。分化中の細胞はGFP陽性細胞であり、放射状グリア線維に隣接する双極形態のニューロンや、その下方のIZにある多極ニューロンなど、さまざまな成熟段階にあった。また、樹状突起はMZへも伸展しており、そこにはECMタンパク質のreelinが適切に免疫局在していた。したがって、エレクトロポレーションおよび外植片の条件は、皮質ニューロンの正常な発達を可能にします。予想通り、有糸分裂後のGFP陽性ニューロンが形成過程のcpに集積しました。以上のことから、本プロトコルはL6皮質ニューロンを確実に標的とすることができ、それらの遊走および成熟の研究に適用可能です。本手順を広範囲に適用した結果、79%の成功率が得られました。248回の試行のうち195回が、イメージングおよび解析に適した結果となりました。失敗した例の半分は、GFPの発現不全または標的GFPの検出漏れによるものでしたが、習得後の成功率は向上します。適切に行えば、この手法は90分で完了させることができます。この手順を行う際は、電気穿孔後の脳半球を、その後の工程で髄膜が完全な状態で培養できるように、解剖の練習をしておくことが重要です。目的の変異が神経細胞の遊走や樹状突起形成にどのように影響するかといった追加の疑問を解決するために、タイムラプス顕微鏡法などの他の手法を併用することも可能です。

ex-utero-electroporation-whole-hemisphere-explants-simple

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

E15マウス胚の子宮内での脳室内注入とエレクトロポレーションで

子宮内エレクトロポレーションでは、生体内で神経前駆細胞をトランスフェクションするための貴重な方法です。電極の配置とエレクトロの発達タイムポイントに応じて、皮質細胞の特定のサブセットを対象とすることができます。標的細胞は、その後、in vivoまたは遺伝的改変の影響についてin...

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使用して、マウス大脳皮質および海馬における可視化と樹状突起と棘の遺伝子操作<em&gt;子宮内で</em&gt;エレクトロポレーション

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子宮外エレクトロポレーションおよびマウスの海馬組織の器官型スライス培養

このプロトコルは、子宮内エレクトロポレーションを介してC57BL/6中枢神経系の異なる領域を特異的にトランスフェクションする方法を詳細に説明しています。このプロトコルには、皮質、海馬、視床、視床下部、外側中隔核、線条体に発達する領域のトランスフェクションに関する詳細な指示が含まれています。...

Cortex-、Hippocampus-、Thalamus-、Hypothalamus-、横中隔Nucleus-と線条体固有<em&gt;子宮内</em&gt; C57BL / 6マウスでのエレクトロポレーション

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子宮内エレクトロポレーションは、神経部分集団の興奮とシングルセルの接続を研究するためのアプローチ

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Ex 子宮エレクトロポレーションと gaba 作動性介在ニューロンの移行のライブ イメージング用マウス萌芽期の脳の脊髄スライス培養

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時間的および空間的に分離された細胞集団を標的とする子宮エレクトロポレーションの二重

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exの子宮内エレクトロポレーションと全半球植：早期皮質の発達についての研究のための簡単な実験方法

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