メディカルインプラントのグラフェンコーティング

この手順の全体的な目標は、金属形状のメモリー合金ニチノールをグラフェンでコーティングして、血液接触インプラント材料の血液適合性を改善する方法を実証することです。これは、まず化学蒸着法を用いて銅箔上にグラフェンを成長させることによって達成されます。2番目のステップは、銅箔をエッチングで除去し、準備したグラフェンをニチノール基板に移すことです。

次に、グラフェン被覆ニチノール基質を用いて、内皮細胞や平滑筋細胞の培養を行います。細胞適合性を定量化するための別のアッセイは、グラフェンでコーティングされたニチノール基質にタンパク質、フィブリノーゲン、アルブミンの両方をコードすることにより、血液適合性をチェックすることです。最終的には、マイクロラミン分光法、共焦点顕微鏡法in vitro細胞毒性アッセイ、およびSDSページタンパク質分析を使用して、グラフェンコーティングの成功、細胞形態の改善、細胞生存率の向上、および血液適合性の向上を示します。

この技術やポリマーコーティングのような既存の技術の主な利点は、グラフェンコーティングが非常に耐久性があり、耐腐食性があることです。グラフェン固有の材料特性は、タンパク質の吸収を減少させ、タンパク質の確認変化による凝固因子の活性化を減少させることが期待されるため、この技術の意味はステント技術の起源の改善にまで及びます。この方法では、グラフェンでコーティングされたニチノールステントについての洞察を得ることができますが、心臓弁やカテーテルなどの他のシステムにも使用できます。

まず、1インチの石英管状炉に1センチ×1センチの銅箔を置き、50 SCCMの水素と450 SCC CMのアルゴンヌの存在下で摂氏1000度に加熱します。次に、1SCCMと4SCCMのメタンを1000°Cの炉に異なる流量で20〜30分間導入します。水素アルゴンとメタンを流しながら、炉内でサンプルを室温まで冷却します。

炉からサンプルを取り出した後、それらを4.5ミリメートルの正方形に切断し、4%アノールで希釈したPMMAを使用して銅箔を4, 000RPMでスピンコートし、続いて150°Cで5分間の熱処理を行います。銅箔が完全にエッチングされるまで、CE100エッチングを使用して銅箔をエッチングします。10%塩酸で10分間すすぎ、次に脱イオン水で10分間すすぎます。

グラフェンPMMAサンプルを取得するには、グラフェンサンプルを4.5平方ミリメートルのニチノール基板に移します。次に、摂氏450度で300 SCCMのアルゴンと700 SCCMの水素で2時間浸します。PMMAを除去するには、最後にニチノール基質をアセトンで洗浄して残留PMMAを溶解し、グラフェンニッケルチタンサンプルを取得します。

毒性試験を開始するには、記載されているSCCMがグラフェンの化学気相成長に使用されるメタンフローに対応する96ウェルプレートに、手付かずのニチノール1つのSCCMまたは4つのSCCMグラフェンニチノール基質を追加します。次に、ラット大動脈内皮細胞を1ウェルあたり10〜5番目の細胞で、手付かずのニチノールを1つのSCCMまたは4つのSCCMを含有するウェルの一部で。グラフェンニチノール基質は、種子ラット大動脈平滑筋細胞を異なるウェルセットで同様の方法で。

を3日間または7日間、摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターで1日おきに培養します。終了時点で、平滑筋細胞を含むウェルから培地を取り出し、それぞれに0.5ミリグラム/ミリリットルMTTを含む新しい培地を追加します。細胞をさらに3時間インキュベートします。

次に、培地を静かに取り出し、各ウェルに100マイクロリットルのジメチルスルホキシドを加えます。MTT結晶が溶解するまで10分間待った後、溶液を別のウェルプレートに移します。MTSアッセイでは、最終時点で内皮細胞を含むウェルから培地を取り出します。

120マイクロリットルのMTS溶液と交換し、3時間インキュベートします。次に、ウェルの内容物を新しいプレートに移します。490ナノメートルで吸収剤を読み取り、吸光度を元のニチノールサンプルの平均吸光度に正規化することにより、生存率を決定します。

サンプルごとにこの手順を少なくとも 5 回繰り返します。ラット大動脈平滑筋細胞の共焦点イメージングでは、基質を8チャンバースライドに配置し、1つのチャンバーをコントロールとして空のままにします。次に、すべてのチャンバー内の細胞をチャンバーあたり25,000個の細胞で播種し、摂氏37度と二酸化炭素5%で3日間インキュベートします。

スライドから培地を取り除いた後、PBSバッファーに4%ホルムアルデヒドを溶かして20分間、基質上の細胞を接着します。PBSで洗浄し、0.1%Triton Xで1分間パーマアーゼします。PBSで洗浄した後、100マイクロリットルのLOR 4 88 PHIN溶液を1.9ミリリットルのPBSバッファーに加えます。

アクトンを可視化するには、250マイクロリットルのLOR 4 88 Phinで細胞を45分間染色し、PBSバッファーで2回洗浄します。次に、dpiを含む蛍光封入剤で核を染色します。ニコンの共焦点tiを使用して共焦点画像を収集します。

アルブミンおよびフィブリノーゲンタンパク質吸収実験を開始する前に、キャリパーで基質の寸法を測定してください。ほぼ正方形のサンプルと平均の各辺について3つの測定を行います。長さと幅を取得するには、手付かずのニチノールサンプル、1つのSCCMグラフェンニチノールサンプル、および4つのSCCMグラフェンニチノールサンプルを2つの12に配置します。

ウェルプレートは、1ミリグラム/ミリグラムのアルブミンを含むPBS緩衝液を添加します。プレートの1つに室温を加え、別々に3時間インキュベートします。3種類のサンプルを、1ミリグラム/ミリリットルを含むPBSバッファーでインキュベートします。

PBSで試料を洗浄した後、室温で3時間フィブリノーゲンを、微量遠心チューブ内で同試料を200μLの還元性試料緩衝液と混合し、5分間煮沸する。サンプルをTグリシンSDSバッファーと脱イオン水の体積比1〜9体積比で希釈し、4〜15%トリスポリアクリルアミド電気泳動ゲルを90ボルトで100分間泳ぎます。スプロ赤ストック溶液を 7.5% 酢酸中で 1 対 5, 000 の比率で希釈します。

次に、希釈したスプロレッド溶液でゲルを60分間染色します。アルミホイルで包み、Fluor chem SPを使用してスプロレッドを軽いイメージゲルから保護し、Image Jソフトウェアを使用して蛍光強度を定量化します。次に、各サンプルの蛍光強度を基質の総面積で正規化し、フィブリノーゲン吸収とアルブミン吸収を比較します。

化学気相成長法により、銅結晶粒を模倣した多結晶グラフェンサンプルが得られました ラーメン分光法を使用して、1つのSCCMおよび4つのSCCMサンプルに単層グラフェンの存在を確認しました。1つのSCCMサンプルは、調製されたグラフェンの単層の性質を示す強いGPRバンドを示します。対照的に、4つのSCCMサンプルは比較的弱いGPRバンドを示しており、ここに描かれているグラフェンの数層の存在は、ニチノール基板に転写されたグラフェンの原子間力顕微鏡画像であることが確認されています。

サンプルの詳細な測定により、約5ナノメートルの表面粗さの値が得られました。表示。これは、1つのSCCMグラフェンニチノール基板上の手付かずのニチノール基板上、および4つのSCCMグラフェンニチノール基板上の制御ガラススライド上で成長した平滑筋細胞の共焦点光学顕微鏡画像です。細胞は、両方のグラフェンニチノール表面で緻密で球形であり、これはより良好な細胞形態を示しています。

MTT および MTS アッセイでは、1 つおよび 4 つの SCCM グラフェンニチノール基質は、元のニチノールと比較して平滑筋細胞の生存率に有意な差を示さないことが示されています。MTSアッセイは、内皮細胞の3日間の細胞生存率がコントロールと有意差がなかったことを示しています。走査型電子顕微鏡の画像は、手付かずのニチノール基質上で成長した内皮細胞がまばらで細長いのに対し、1つおよび4つのSCCMグラフェンニチノール基質上では楕円形で密集していることを示しています。

これらの結果は、グラフェンコーティングが内皮細胞の球状細胞形態の改善につながることを示しており、1つのSCCMおよび4つのSCCMグラフェンニチノールサンプルは、元のニチノールサンプルと比較して低いフィブリノーゲンアルブミン比を示し、グラフェンから生じるより優れた血液適合性を示唆しています。フェルミ準位の平衡化は、フィブリノーゲンのエネルギー準位図とグラフェンの電子状態の密度によって示されます。フィブリノーゲンからグラフェンニチノールへの電子移動は、フィブリノーゲン分子の占有電子状態から、同じエネルギーレベルのグラフェンニチノールの空の電子状態にのみ可能です。

単層グラフェンと数層グラフェンはどちらも室温で半金属であり、フューリーレベルでの電子密度が低いため、フィブリノーゲンからグラフェンへの電荷移動が弱くなります。グラフェンは、血漿タンパク質からの弱い電荷移動を示すGBバンドラインの形状または周波数の変化を示さない。カーブフィッティングから得られたD畳み込みピークは黒で示され、インプラントコーティングとしてのグラフェンの有用性と生存率を示しています。

グラフェン被覆銅ペニーを5%の過酸化水素に曝露した。ペニーのグラフェン被覆部分は変わらず、被覆されていない部分は過酸化水素溶液によって変色しました。また、70%硝酸に浸漬したグラフェンニチノールは、GB帯の周波数に変化を示さず、グラフェンコーティングが非常に耐久性が高いことを確認しました。

さらに、グラフェンニチノール中のグラフェンコーティングは、グラフェン膜の不透過性を示す下にある銅のXレートに減少しました。このビデオを見れば、グラフェンと生物医学インプラントを移植して生体適合性を向上させる方法についてよく理解できるはずです。