ターゲット-エステラーゼ誘起染料の読み込み（TED）とERカルシウムの直接イメージング

次の実験の全体的な目標は、生細胞の小胞体の内腔で直接カルシウムのダイナミクスを視覚化することです。これは、標的エステラーゼ誘導色素またはTEDベクターコンストラクトで細胞を形質導入し、小胞体内でカルボックスエステラーゼCS 2を過剰発現させることによって達成されます。次に、細胞をアセトメチルエステルカルシウムインジケーターflu oh five NAとインキュベートし、血漿膜とER膜を介して拡散します。

その後、カルボキシルエステラーゼが切断されます。エステル基は、ER内のカルシウム感受性指標を放出します。ルーメンと蛍光カルシウム錯体が形成されます。

生細胞イメージングに基づいて、ER内の遊離カルシウム濃度の変化を示す結果が得られます。この方法は、細胞性カルシウムの恒常性調節に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。カルシウムシグナルはサイトゾルで最も頻繁にモニターされるため、カルシウムが細胞外空間からサイトゾルに流れ込んでいる場所や、細胞内の小胞体カルシウム貯蔵庫からサイトゾルに流れ込んでいる場所を簡単に区別することはできません。

この制限を克服するために、ターゲットを絞ったエステラーゼ誘導ダウンロードを開発しました。この方法では、ERから放出されたカルシウムを直接監視します。このアプローチは無停止です。

原形質膜は無傷のままで、細胞内シグナル伝達カスケードは保存されます。一般的に、個人は経験が必要なため、個人は苦労します。TEDベクター発現では、カルボキシラーゼCES twoに融合したセントタンパク質を発現するベクターコンストラクトを開発しました。

これにより、実験中にARカルシウムイメージングに適した細胞を簡単に特定でき、強い赤色蛍光と中程度から強いカルシウムインジケーター蛍光を特徴とする細胞を同定できます。この蛍光標識は、小胞体全体に均一に分布している必要があり、核領域には存在しません。始める前に。

人工脳脊髄液またはA CSFとインフルエンザoh five NAMをテキストプロトコルに従って準備します。A CSFを室温に予温し、深部グルコースを加え、A CSFをカルボゲンで5分間曝気します。次に、塩化カルシウムと塩化マグネシウムのモルストック溶液を1モルストック溶液をそれぞれ2ミリモルの最終濃度まで加えます。

ライブイメージング顕微鏡とコンピュータープログラムを開始した後、ダミーのイメージングチャンバーで増殖を開始し、チューブシステムを平衡化し、インライン溶液ヒーターと顕微鏡ステージ上のイメージングチャンバーを予熱して、システムを摂氏32〜37度に平衡化します。細胞に染料をロードするためのダウンロード手順を開始する前に、予め温めたA CSFの100マイクロリットルを5ミリモルインフルエンザoh five NAMの1つの0.5マイクロリットルアリコートに加え、水浴で溶液を可溶化し、90秒間超音波処理し、400マイクロリットルの予熱イメージング溶液を4または24ウェルプレートの1ウェルに移します。D溶液を同じウェルに加えて、500マイクロリットルの5マイクロモル溶液を生成します。

次に、ウェル内の細胞を慎重にカバースリップを置き、摂氏37度の細胞培養インキュベーターで適切な時間インキュベートします DIロード時間とD濃度は、細胞の種類、細胞密度、および実験固有のニーズによって異なります。インキュベーション時間が長いと、細胞、特に初代ニュアンス細胞やグリア細胞に害を及ぼす可能性があり、これは生理学的刺激に対する応答性にとって重要です。30分を超えるインキュベーションは、小さなマイクロドメイン、例えば、スパインのMUEにおけるERカルシウムの分布を調査するためのERカルシウム局在化実験にのみ有用であり、インキュベーションの直後に、カバースリップをイメージング溶液を含む別の細胞培養ウェルに移す。

イメージングチャンバーにセルをマウントする準備として、ペイントブラシを使用してイメージングチャンバーに高真空グリースを塗布します。10mmから12mmの少量のカバースリップには自作のイメージングチャンバーを使用しているため、毎分最大15倍のバッファー交換という高速な灌流が可能です。インフルエンザoh fiveとロードされたセルでカバースリップを拾い上げ、それを濡らしておくためにイメージング溶液の小さな滴を追加します。

次に、カバースリップを逆さまにして、細胞をイメージングチャンバーにマウントします。綿棒を使用してカバースリップをシリコン接着剤に押し込み、ガラスカバースリップの底から残留バッファーを拭き取ります。次に、ダミーのイメージングチャンバーを実験イメージングチャンバーと交換します。

細胞選択のための連続灌流により、細胞を5〜10分間洗浄します。レーザー照明の最小限の量を使用して、ER内のインフルエンザOH 5とカルシウム2の急速な光退色、2〜4ヘルツの高いスキャンレート、小さな画像サイズ、および顕微鏡で設定された高ゲインを防ぎます。植物の実験によると。

実験の開始時に、インフルエンザoh fiveとカルシウムラベルの細胞分布と、赤いcarbox cel esterase constructの赤色蛍光ラベルを文書化します。ここで関心のある細胞では、高解像度X、YZ画像スタックによる代表的なニューロンが、特定の実験条件下で小胞体カルシウムダイナミクスを監視するためのXYTイメージングを行います。私たちのシステムの典型的な設定は、テキスト プロトコルの表 2 にリストされています: イメージング溶液バッファーによる連続灌流下での ER カルシウムのモニター変化は、細胞洗浄と貯蔵枯渇のために毎分 1.5 ミリリットルです。サルコ小胞体カルシウム TPA 2 つをブロックすることにより、TP と DHPG による刺激と代謝型グルタミン酸受容体のアゴニストに対して毎分 3 ミリリットルです。

ここでは、グリア細胞を200マイクロモルのA TPで10秒間刺激します。画像を処理するには、Image J プログラムで画像スタックを開き、マルチカラーイメージングを行います。ソフトウェアから求められたら、RBGチャネルを分割します。

関心のある領域を特定します。目的に応じて、ER全体またはERの小さな領域の周囲に関心領域を描画します。時系列アナライザープラグインを使用して、関心領域の平均ピクセル強度を読み取ります。

この式を使用して、デルタFオーバーFゼロによる蛍光のバックグラウンド補正された相対変化を計算します。蛍光の相対的な変化を、Y 軸の F の F の 0 のデルタと x 軸の時間を持つトレースとして示します。この図では、A細胞の皮質アストロサイトと海馬ニューロンが赤色の蛍光TEDベクトルを発現し、低親和性カルシウムインジケーターで標識されています。

蛍光カルシウム指示薬複合体は、すべての細胞タイプの小胞体に局在しています。この図は、インフルエンザOH5N標識グリア細胞を示しています。CIN処理中、CIN処理の前後に細胞の原形質膜が損傷を受けた場合、明るい細胞質標識が見られます。

このことから、インフルエンザoh five Nは、内因性エステラーゼによってサイトゾルでも放出されることが明らかになりました。この実験では、TED標識後、インフルエンザoh five N erで培養海馬ニューロンのカルシウム枯渇は、周囲遮断薬であるサイクロン酸によって引き起こされます。ここで観察される関心領域あたりの平均蛍光密度の大きな変化は、TPで刺激されたマウスコルチコGL細胞のタイムラプスシリーズであることに注意してください。蛍光は突然低下し、ERカルシウムの放出と再充填を表して回復します同時に、赤色蛍光タンパク質の蛍光は、一部の実験で蛍光強度の経時的な変化を示すスレート漂白図の結果としてわずかに減少しますが、すべての実験ではありません。

蛍光値は、刺激中に一部のインフルエンザoh five N複合体が失われるため、初期の蛍光強度レベルに戻らない。この動画は、カルボキシラーゼ2に感染したBHK21細胞を高解像度で、インフルエンザoh 5 Nカルシウム複合体で標識し、TPで刺激している様子を示しています。TPによるカルシウム放出と小胞体カルシウム貯蔵の補充は、小胞体尿細管の微細構造で視覚化されることに注意してください。この手順に参加する際には、完全に健康な細胞のみが生理学的カルシウム反応を示すことを覚えておくことが重要です。

したがって、同じ細胞バッチで1日で一連の相互に関連するカルシウム恒常性実験を行うことをお勧めします。私たちの経験に基づくと、5つのNの染料インフルエンザが最も効果的ですが、このカルシウムインジケーターはあまり違反に強いわけではありません。したがって、この方法は、より漂白耐性の低親和性カルシウムインジケーターの開発から恩恵を受けるでしょう。

このビデオを見れば、合成低親和性カルシウムインジケーターを用いたEカルシウムトランジェントのイメージング方法について十分に理解できるはずです。これらの指標により、カルシウムのダイナミクスを高い時間分解能で監視することができます。このため、私たちの方法は、シナプス可塑性に関与するカルシウムシグナル伝達カスケードの研究や、神経変性疾患の細胞モデルにおけるカルシウム恒常性の変化のモニタリングに役立つ可能性があります。