Name: ターゲット-エステラーゼ誘起染料の読み込み（TED）とERカルシウムの直接イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 学ぶTED法による生細胞の小胞体カルシウムダイナミクス可視化。標的エステラーゼを用いて低親和性カルシウムインジケーターを活性化し、蛍光イメージングで細胞内カルシウム動態をリアルタイムに解析する革新的アプローチです。

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この作品は、ドイツ学術振興（DFG）BL567/3-1とフリードリヒ·バウアー·財団の補助金によって支えられてきた。我々は、Tag-RFP-T2を私達に提供するためロジャーY.ツィン、カリフォルニア大学サンディ​​エゴ校ハワードヒューズ医学研究所研究所に感謝したいと思います。私たちは、ありがたいことに私たちにレンチウイルスプラスミドFUGWを提供し、psPAX2/pMD2.Gためデイヴィッドボルティモア、カリフォルニア工科大学、パサデナ、そしてディディエTrono、ジュネーブ、ジュネーブ、大学を認める。

<ol><li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling%3A+dynamics%2C+homeostasis+and+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 517-529 (2003).</li>
<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 11-21 (2000).</li>
<li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li>
<li>Augustine, G. J., Santamaria, F., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+calcium+signaling+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Local calcium signaling in neurons.</a> Neuron. 40, 331-346 (2003).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuronal calcium signaling.</a> Neuron. 21, 13-26 (1998).</li>
<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73, 862-885 (2012).</li>
<li>Neher, E., Sakaba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+roles+of+calcium+ions+in+the+regulation+of+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release.</a> Neuron. 59, 861-872 (2008).</li>
<li>Jaepel, J., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+ER+calcium+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Capturing ER calcium dynamics.</a> European Journal of Cell Biology. 90, 613-619 (2011).</li>
<li>Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+and+pathophysiology+of+the+calcium+store+in+the+endoplasmic+reticulum+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Physiology and pathophysiology of the calcium store in the endoplasmic reticulum of neurons.</a> Physiological Reviews. 85, 201-279 (2005).</li>
<li>Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraluminal+calcium+as+a+primary+regulator+of+endoplasmic+reticulum+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function.</a> Cell Calcium. 38, 303-310 (2005).</li>
<li>Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+Ca2%2B+from+a+nonmitochondrial+intracellular+store+in+pancreatic+acinar+cells+by+inositol-1%2C4%2C5-trisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Release of Ca2+ from a nonmitochondrial intracellular store in pancreatic acinar cells by inositol-1,4,5-trisphosphate.</a> Nature. 306, 67-69 (1983).</li>
<li>Choi, J. H., Ryu, S. H., Suh, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On%2Foff-regulation+of+phospholipase+C-gamma+1-mediated+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Enzyme+Regulation%22%5BJournal%5D)">On/off-regulation of phospholipase C-gamma 1-mediated signal transduction.</a> Advances in Enzyme Regulation. 47, 104-116 (2007).</li>
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<li>Erdmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+calmodulin+with+Sec61alpha+limits+Ca2%2B+leakage+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Interaction of calmodulin with Sec61alpha limits Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum.</a> The EMBO Journal. 30, 17-31 (2011).</li>
<li>Schäuble, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiP-mediated+closing+of+the+Sec61+channel+limits+Ca%282%2B%29+leakage+from+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">BiP-mediated closing of the Sec61 channel limits Ca(2+) leakage from the ER.</a> The EMBO Journal. , (2012).</li>
<li>Park, M. K., Choi, Y. M., Kang, Y. K., Petersen, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endoplasmic+reticulum+as+an+integrator+of+multiple+dendritic+events%5BTitle%5D)+AND+%22The+Neuroscientist+%3A+a+review+journal+bringing+neurobiology%2C+neurology+and+psychiatry%22%5BJournal%5D)">The endoplasmic reticulum as an integrator of multiple dendritic events.</a> The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 14, 68-77 (2008).</li>
<li>Cooney, J. R., Hurlburt, J. L., Selig, D. K., Harris, K. M., Fiala, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+compartments+serve+multiple+hippocampal+dendritic+spines+from+a+widespread+rather+than+a+local+store+of+recycling+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Endosomal compartments serve multiple hippocampal dendritic spines from a widespread rather than a local store of recycling membrane.</a> The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2215-2224 (2002).</li>
<li>Holbro, N., Grunditz, A., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+distribution+of+endoplasmic+reticulum+controls+metabotropic+signaling+and+plasticity+at+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differential distribution of endoplasmic reticulum controls metabotropic signaling and plasticity at hippocampal synapses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15055-15060 (2009).</li>
<li>Terasaki, M., Slater, N. T., Fein, A., Schmidek, A., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+network+of+endoplasmic+reticulum+in+cerebellar+Purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Continuous network of endoplasmic reticulum in cerebellar Purkinje neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7510-7514 (1994).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J. Vis. Exp. (23), e1067(2009).</li>
<li>Lang, S., Schäuble, N., Cavalie, A., Zimmermann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+calcium+imaging+combined+with+siRNA+mediated+gene+silencing+identifies+Ca%282%29%28%2B%29+leak+channels+in+the+ER+membrane+and+their+regulatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live cell calcium imaging combined with siRNA mediated gene silencing identifies Ca(2)(+) leak channels in the ER membrane and their regulatory mechanisms.</a> J. Vis. Exp. (53), e2730(2011).</li>
<li>Rudolf, R., Mongillo, M., Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+forward+to+seeing+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Looking forward to seeing calcium.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 579-586 (2003).</li>
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<li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+Ca2%2B+based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388, 882-887 (1997).</li>
<li>Montero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+dynamic+changes+in+free+Ca2%2B+concentration+in+the+endoplasmic+reticulum+of+intact+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Monitoring dynamic changes in free Ca2+ concentration in the endoplasmic reticulum of intact cells.</a> The EMBO Journal. 14, 5467-5475 (1995).</li>
<li>Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+the+environmental+sensitivity+of+yellow+fluorescent+protein.+Mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).</li>
<li>Ishii, K., Hirose, K., Iino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+shuttling+between+endoplasmic+reticulum+and+mitochondria+underlying+Ca2%2B+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Ca2+ shuttling between endoplasmic reticulum and mitochondria underlying Ca2+ oscillations.</a> EMBO Reports. 7, 390-396 (2006).</li>
<li>Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2-mediated+alterations+in+endoplasmic+reticulum+Ca2%2B+analyzed+with+an+improved+genetically+encoded+fluorescent+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17404-17409 (2004).</li>
<li>Hofer, A. M., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+for+in+situ+measurement+of+calcium+in+intracellular+inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate-sensitive+stores+using+the+fluorescent+indicator+mag-fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Technique for in situ measurement of calcium in intracellular inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive stores using the fluorescent indicator mag-fura-2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2598-2602 (1993).</li>
<li>Solovyova, N., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+free+calcium+in+the+neuronal+endoplasmic+reticulum%3A+an+overview+of+modern+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Monitoring of free calcium in the neuronal endoplasmic reticulum: an overview of modern approaches.</a> Journal of Neuroscience Methods. 122, 1-12 (2002).</li>
<li>Solovyova, N., Veselovsky, N., Toescu, E. C., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+dynamics+in+the+lumen+of+the+endoplasmic+reticulum+in+sensory+neurons%3A+direct+visualization+of+Ca%282%2B%29-induced+Ca%282%2B%29+release+triggered+by+physiological+Ca%282%2B%29+entry%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) dynamics in the lumen of the endoplasmic reticulum in sensory neurons: direct visualization of Ca(2+)-induced Ca(2+) release triggered by physiological Ca(2+) entry.</a> The EMBO Journal. 21, 622-630 (2002).</li>
<li>Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+non-disruptive+strategy+to+target+calcium+indicator+dyes+to+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum.</a> Cell Calcium. 44, 386-399 (2008).</li>
<li>Blum, R., Verkhratsky, A., Petersen, O. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlum%2C+R+%22Calcium+imaging+of+intracellular+organelles%3A+endoplasmic+reticulum%22">Calcium imaging of intracellular organelles: endoplasmic reticulum</a>. 43, Humana Press. (2010).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+photostability+of+bright+monomeric+orange+and+red+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 5, 545-551 (2008).</li>
<li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li>
<li>Zufferey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-inactivating+lentivirus+vector+for+safe+and+efficient+in+vivo+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery.</a> Journal of Virology. 72, 9873-9880 (1998).</li>
<li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15, 871-875 (1997).</li>
<li>Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FM+dyes+enter+via+a+store-operated+calcium+channel+and+modify+calcium+signaling+of+cultured+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21960-21965 (2009).</li>
<li>Blum, R., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlum%2C+R+%22Calcium+measurement+methods%22">Calcium measurement methods</a>. Verkhratsky, A., Petersen, O. H. Vol. Neuromethods 43 (Springer protocols), Humana Press. 147-167 (2010).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+esterase-ester+pair+for+targeting+small+molecules+with+cellular+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Selective esterase-ester pair for targeting small molecules with cellular specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4756-4761 (2012).</li>
<li>Samtleben, S., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+for+direct+ER+calcium+imaging+with+targeted-estersase+induced+dye+loading%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Improved vectors for direct ER calcium imaging with targeted-estersase induced dye loading.</a> , In preparation (2012).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

TED方法の利点と欠点は、最近の刊行物34,35で広く議論されている。上述した他の方法に比べて、TEDは、細胞を破砕し、灌流の問題を回避する。さらに、二つの側面が強調される必要がある。 ERカルシウムイメージングのためのTEDの原理はTEDベクター構築の助けとの低親和性合成AM-エステルの（2）効率的かつ優先的なリリースで、ERの内腔に積極的にカルボキシルエステラーゼの（1）対象となる表現が必要ですER内腔のカルシウム色素が挙げられる。 1。 TEDベクター構築 図3は TEDベクター構築物の開発をまとめたものです。 TEDは、CESファミリータンパク質（EC 3.1.1.1）に基づいて開発されました。これらのタンパク質は、小胞体内腔にメンバーが常駐しています。 in vitroで CESタンパク質の組換え政権が安定に発現した後に最高の作品研究のためタンパク質または中等度の発現レベルとウイルス感染後に。現在のところ、エステラーゼ活性を有する他のタンパク質を...

ERの生理的なカルシウム応答を解決するために、我々は、ERに合成炭酸カルシウム感受性色素の捕捉を改善するための新しい戦略を開発した。方法は、細胞外カルシウムの存在下で自由ERカルシウムの直接、無停止リアルタイム監視を可能にします。 ERカルシウムの機能とシグナリングカルシウム信号は、異なる細胞型、 例えば、筋肉細胞、ニューロンおよび学習および記憶1,2におけるシナプス伝達の関与に筋収縮を媒介からグリア細胞とその機能の範囲に見出される。カルシウムは遺伝子転写、細胞増殖、神経細胞の興奮性、細胞死および他の細胞シグナル伝達事象1-7の調節に関与しているため、遊離カルシウム濃度の変化は、高い科学的関心である。これらのすべての細胞内カルシウムシグナルは、細胞内カルシウム機能的に接続され、貢献店舗ダイナミクス8-10。 すべてのカルシウムシグナルの間で共通の特徴は、主にERやミトコンドリア、細胞外空間、細胞質と細胞小器官の間でのカルシウムの流れです。これは、異なるシグナル伝達成分によって感知されるこれらの細胞小器官内のカルシウム濃度のダイナミックな変化を引き起こす。一般的には100〜800μmの間のERの範囲内カルシウム濃度は、細胞質ゾルのカルシウム濃度は、100nMの近隣にあり、細胞外空間内濃度は1〜2 mMの程度である。従って、細胞質ゾルのカルシウム2,9,10に向かって流れに対して高い化学的駆動力が存在する。 最も一般的に調査し、ER由来のカルシウムシグナルは、その後ホスホリパーゼC（PLC）を活性化するGタンパク質共役受容体（GPCR）の刺激に依存します。順番にPLCはイノシトール1,4,5 -三リン酸（IP 3）1を生成します。その視聴にIP 3の結合時ER-膜におけるeptor（IP 3 -録音、 図1）は 、カルシウムイオンは、ER内腔から放出される。歴史的には、ERからIP 3媒介カルシウム放出は初めてだった-たとえ間接的に- Streb ら腺膵臓細胞で測定された1983年11インチ 。本書は、初めてアセチルコリン、ホスホリパーゼC、およびIP 3が関与するシグナル伝達カスケードを示唆した。カルシウム放出のこの方法は、一般的にIP 3誘発性カルシウム放出（IICR）（ 図1）と呼ばれます。受容体チロシンキナーゼリンクIP 3標高12後シグナリングERカルシウムの増殖因子や神経栄養因子の作用によるホスホリパーゼCγのキナーゼ依存的活性化。 IICRに加えて、カルシウム上昇は電位依存性カルシウムチャネル（CA V）、およびリアノジン再によるその後のカルシウム誘発性カルシウム放出（CICR）を経由して、たとえば、イオンチャネル型カルシウム流入によって媒介され得るceptors（RYR）。 IICRとCICRは生理的にストア作動性カルシウム流入（SOCE）にリンクされています。 SOCEはERのカルシウム放出するためのセンサであるSTIM（間質相互作用分子）の作用を有している。 STIMは、一過性受容体電位チャネル（トリプトファン）13、往来カルシウムチャネル14、さらには電位依存性カルシウムチャネル15（ 図1）を介して細胞外のカルシウム流入を刺激することが示されている。 ERカルシウムの損失が動的に積極的にポンプカルシウムバックERにサーコ-小胞体カルシウムATPアーゼ（SERCA）の作用によって救出されています。などタプシガルギンなどの薬物とのSERCAをブロックすると、細胞質コンパートメントにERカルシウムの継続的損失を発表。このERカルシウム&quot;リーク&quot;などSec61タンパク質複合体16,17（ 図1）のように小胞体膜内の細孔複合体によって引き起こされる。 1998年には、Berridgeは、モデル、 &quot;ニューロンモデル内ニューロン&quot;、whicを発表hはニューロンのカルシウム5を統合するERの原則生理的役割を示唆している。このモデルは、神経細胞の原形質膜5の細胞内の&quot;画像&quot;を形成する連続的なER膜システムの存在を考慮する。このバイナリ真核生物の膜システムは、ニューロンにおける高速と低速のカルシウムシグナルの時間的·空間的統合のための基本的な前提条件であると主張しました。同じニューロンの異なる棘や樹状突起に同時にまたはその後のどちらか起こるカルシウムシグナルは、細胞の細胞体または彼らは5,18を総括しているERを介して核に付与されています。そして、その合計がシグナル伝達カスケードのニューロンの興奮性、遺伝子転写の調節や統合に影響を与えることがある。したがって、ERは、カルシウムシグナルの統合をサポートしています。この概念の一つの前提条件は、いくつかの研究で主張されていると、少なくとも体性-Dのために証明されている単一のセル内のERの継続ですendriticエリアと短距離軸索投射19-21。長い軸索投射内ER継続性があるかどうかは議論の問題です。 ER膜上の遊離カルシウムの流れを測定するための戦略カルシウムシグナルは、最も頻繁に細胞質ゾル22,23に監視されています。したがって、容易のCa 2 +を細胞外から6,24又は細胞内貯蔵から細胞質内に流入されているかどうかを区別することができない。この制限を克服するために、直接ERカルシウムイメージングのための方法論的な戦略が開発されている。要約すると、以下の戦略が使用されます。（1）ER-ターゲット遺伝子組み換えタンパク質の指標25-27タンパク質ベースの低親和性のCa 2 +インジケーターはタンパク質を感知カルシウムとの組み合わせで生物発光タンパク質イクオリンやGFPを使用しています。これらの遺伝子組み換えのCa 2 +インジケータ（GECIs）ができますシグナルペプチドの助けを借りて、ERを対象とすることが、積極的に保持し、検索のモチーフを使用してERに保持されます。カメレオン原則上の共通ERのCa 2 +指標ベースとカメレオンYC4.3 26,28です。カメレオンスプリットYC7.3ER 29と、カメレオンD1 30。 （2）インジケーター色素のAM-エステル低親和性のCa 2 + 指標31,32。AM-デリバティブの直接エステラーゼ系色素ローディング （MAG-たFura2-AM、MAG-Fluo4-AMまたはFluo5N-AM）が合格親油性、カルシウムと小文字を区別しない状態での生体膜。その後、細胞質ゾルで同様ERで、内因性エステラーゼAM-エステル基の開裂とは、細胞質内のアクティブな染料ある程度の後ろとERに残して、Ca 2 +のインジケータを解放。細胞質カルシウム濃度が十分にデ以下に留まるようしたがって、このアプローチは限り、ERの高いカルシウム濃度の条件下で有用である特に特徴的なカルシウムシグナル（低μMに例えば nM）を間に低親和性指標の護制限、。 （3） 細胞膜透過性32との組み合わせでAM-エステルローディング。すべて残り細胞質のCa 2 +指示薬は、人工細胞内バッファに&quot;マイルド&quot;洗剤（ 例えばサポニン）少量の細胞膜透過処理によって除去される。したがって、細胞内膜を直接形質膜における&quot;細孔&quot;を介して、細胞内のバッファ内のIP 3を、例えば 、刺激されてもよい。 （4）ER内腔や細胞質ゾル 32,33 中のCa 2の細胞全体の構成や同時測定+下の細胞質ゾルの透析。セルが最初に低親和性のCa 2 +指示薬（ 例えば MAG-たFura2-がロードされAM、）、レシオメトリックUV光。その後、パッチピペット、残っCYTの助けを借りてosolic低親和性のCa 2 +インジケーターは高親和性のCa 2 +指示薬（ 例えばフルオ-3、可視光）を含む緩衝液を用いて細胞質ゾルの外透析されています。この戦略は、細胞質およびER派生信号の同時記録が可能。 （5） 目標-エステラーゼ誘発性染料ローディング 8,34。カルボキシルエステラーゼ（CES）は、ERの内腔に標的化および低親和性のCa 2 +指標のAM-エステル体を効率的に捕捉するための高エステラーゼ活性を提供する。 標的と-エステラーゼ誘導し染料ロード（TED） ER内腔に低親和性のCa 2 +指標のターゲッティング改善するには、TEDが開発されました。 TEDは、発現構築物によって達成されるER標的マウスカルボキシルエステラーゼ（CES2）（ 図2）の過剰発現を必要とします。換えCES-コンストラクトを発現する細胞は、中のカルシウムのAM-エステルフォームでインキュベートするdicator色素（Fluo5N-AM、 図2）。次に、ERで、染料は、したがって、ER内腔8に高濃度で染料をトラップ、高エステラーゼ活性によりCa 2 +の敏感な、膜不浸透性のCa 2 +指示薬複合体（Fluo5N/Ca 2 +）に変換されます、34。方法はSERCA 17の遮断後にインスタンスに対して直接&quot;リークチャネル&quot;を介して、代謝、プリンまたはグルタミン酸受容体8,34を介して、例えばIICR-経路を介して、小胞体のカルシウム放出を調査し、ERカルシウム枯渇を可視化するために特に便利です、34。我々の経験に低親和性のCa 2 +指示薬Fluo5N-AMは、現在TED染料ローディング戦略で使用する利用可能な最善の指標である。 Fluo5N-AMは、Ca 2 +のための低親和性を持っている（解離定数K D〜90μM、 図2）、ほぼ非蛍光そのAM-形であるが、calciu際高い蛍光発光を提供していますMバインディング8,34。 Fluo5N/Ca 2 +錯体は、そのようなFITC、アレクサ488、またはeGFPのような標準的な染料に対応〜490ナノメートルの標準光源で励起することができる。細胞質カルシウム信号は殆ど低μMの範囲の濃度に到達しない為、ほとんど細胞質内Fluo5N 35によって検出される。 TEDのパフォーマンスを向上させるには、いくつかの組換えベクター構築物（ 図3）を開発した。もともと、CES2のコード配列（のRefSeqアクセッション番号NM_145603、CES2c）と最高のTEDのパフォーマンスに基づいてTEDベクトルはCES構築物の安定発現で観察されています。新しいTEDベクターは、赤色蛍光タンパク質TagRFP-T2 36に融合CES2のコア要素を表現する。これらのベクターは、それらが形質導入細胞識別し、Fluo5N/Ca 2の変化を正規化するための内部コントロールとして赤色蛍光を使用するために使用することができるという利点を有し+蛍光。赤色蛍光はまた刺激条件でERとERダイナミクスの変化の構造分布を可視化する可能性を提供しています。

<table><tbody><tr><td>(S)-3,5-DHPG (ジヒドロキシフェニルグリシン)</td><td>Tocris</td><td>0805</td><td></td></tr><tr><td>5';-ATP-Na2, ATP 二ナトリウム塩水和物</td><td>Sigma</td><td>A26209-1G</td><td></td></tr><tr><td>B-27 supplement,50x</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルバモイルコリン (シャルバコール)</td><td>Sigma</td><td>C4382-1g</td><td></td></tr><tr><td>シクロピアゾン酸 (CPA)</td><td>Ascent scientific</td><td>Asc-300</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM with Glutamax</td><td>Invitrogen-Gibco</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>Ca/Mg を含まないダルベッコ PBS 1x</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>子牛胎児血清</td><td>Invitrogen-Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-5N-AM, 10 x 50 &mu;g</td><td>Invitrogen</td><td>F14204</td><td></td></tr><tr><td>グルタミン酸</td><td>上昇科学</td><td>Asc-049</td><td></td></tr><tr><td>グルタマックス</td><td>Invitrogen</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>ハムの F12 栄養素混合物</td><td>Invitrogen-Gibco</td><td>21765-029</td><td></td></tr><tr><td>ハンクス BSS(1x) Caなし、Mg なし、フェノールレッド、HBSS</td><td>PAA Laboratories</td><td>H15-010</td><td></td></tr><tr><td>馬血清</td><td>SHD3250YK</td><td>Linearis</td><td></td></tr><tr><td>イオノマイシン Ca2+塩</td><td>Ascent scientific</td><td>Asc-116</td><td></td></tr><tr><td>マウス EGF </td><td>PreproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement 100x</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Invitrogen-Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127、低紫外線吸収率、2g</td><td>Invitrogen</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td>Poly-DL-ornithine 臭化水素酸塩 PORN</td><td></td><td>Sigma P8638</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-リジン臭化水素酸塩</td><td>Σ</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Σ</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Calbiochem</td><td>586005-1mg</td><td></td></tr><tr><td>TryLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>Worthington</td><td>LS-003707</td><td></td></tr><tr><td>Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean)</td><td>Sigma</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>共焦点システム:倒立レーザー走査顕微鏡:FV1000とIX81</td>オ<td>リンパスの</td><td></td><td>ユーザー固有の構成</td></tr><tr><td>共焦点システム:レーザーコンバイナーFV10およびダイオードレーザー(405、473、559、635)</td><td>オリンパス</td><td></td><td>ユーザー固有の構成</td></tr><tr><td>共焦点システム:スキャンヘッドFV10-SPD スペクトル検出器付き</td><td>オリンパス</td><td></td><td>ユーザー固有の構成</td></tr><tr><td>ヒーターコントローラー TC-344B</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>64-0101</td><td>インラインソリューションヒーター</td></tr>を制御する <tr><td>NIH ImageJソフトウェア</td><td>WS Rasband, ImageJ, 米国国立衛生研究所, <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a>, 1997--2006</td><td></td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35</td><td>オリンパス</td><td>N2709100</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ: UPLFLN40XO</td><td>オリンパス</td><td>N1478700</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15</td><td>オリンパス</td><td>N1480700</td><td></td></tr><tr><td>灌流チャンバー、逆</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>灌流チャンバー RC-49FS</td><td>ワーナー・インスツルメンツ</td><td>W4 64-1709</td><td></td></tr><tr><td>灌流チューブ:PT-49</td><td>ワーナー・インスツルメンツ</td><td>64-1730</td><td>灌流</td></tr><tr><td>ポンプ用 MiniPlus 3 (4チャンネル)</td><td>ギルソン</td><td>n.a.</td><td>灌流ポンプ</td></tr><tr><td>シングルインライン溶液ヒーター SH-27B</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>64-0102</td>ヒーター<td>コントローラーによって制御され</td></tr><tr><td>ます 吸引チューブ:ST3R</td><td>灌流用</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>64-1407</td></tr><tr><td>加熱インサート:テンポコントロール37-2デジタル2チャンネル</td><td>ペコン</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

ターゲット-エステラーゼ誘起染料の読み込み（ted）とerカルシウムの直接イメージング

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

カルシウム動態の可視化は、細胞生理学におけるカルシウムの役割を理解することが重要である。カルシウム動態を調べるために、合成蛍光Ca 2 +のウインカが人気となっている。ここでは、TED（=ターゲット·エステラーゼ誘導される色素ロード）、のCa 2 +放出異なる種類の細胞の小胞体内腔におけるインジケーター色素を改善するための方法を示しています。今日まで、TEDは、細胞株、グリア細胞、およびin vitroでのニューロンに使用した。ベクターコンストラクトを用いた小胞体内腔に高いカルボキシルエステラーゼ活性の標的効率的組換えでTED拠点その急行カルボキシルエステラーゼ（CES）。最新のTEDベクトルは、このように同時2カラー撮像を可能にし、赤色蛍光タンパク質に融合CES2のコア要素を含んでいる。対応するER構造が赤で表示されている間、ER内遊離カルシウムのダイナミクスは、一つの色に結像される。プロシージャの先頭で、細胞をレンチウイルスで形質導入されています。その後、感染した細胞再は、最終的に生細胞のイメージングを可能にするためにカバースリップ上に播種した。その後、生きている細胞は、インスタンスFluo5N-AM、MAG-Fluo4-AM、またはMAG-たFura2-AMのため、低親和性のCa 2 +指標のアセトキシメチルエステル（AM-エステル）フォームでインキュベートする。のCa 2 +指標と親水性蛍光色素/ Ca 2 +の錯体のAM形からの疎水性側鎖を切断オフER内エステラーゼ活性が形成され、ER内腔に閉じ込められている。色素ローディング後、細胞を倒立型共焦点レーザー走査顕微鏡で分析される。細胞は継続的にリンガーのようなソリューションで灌流し、ERのカルシウムダイナミクスタイムラプスイメージングによる直接可視化されています。 ERカルシウムストアの補充は、蛍光強度の増加を生じるのに対し、ERからのカルシウム放出は、関心のある領域における蛍光強度の減少によって識別される。最終的に、経時的に蛍光強度の変化はΔF/ F 0の計算によって決定される。

このプロトコルは、無料のERカルシウムの直接イメージングのための非破壊的なアプローチを提供します。低親和性合成のCa 2 +指標が解放され、標的ER、組換えエステラーゼ酵素活性の助けを借りて、ERの内腔に閉じ込められている。 ER内腔へのCa 2 +指示薬色素の改良された負荷は、ERカルシウムストアダイナミクスの直接かつ高速イメージングを可能にします。 TEDのセルタイプ方法の実現可能性は、HEK293 34ヒーラ17、SH-SY5Y、培養アストロサイト8,40とプライマリ海馬と皮質ニューロン8,34,41、細胞株でBHK21を示されている。 TEDコンストラクトを安定的に発現しているときに私たちの実験では、TEDは比較的弱いプロモーター（ユビキチンプロモーターなど ）35を用いた自己不活性化レンチウイルスベクター37,39によって優先的に...

標的と-エステラーゼ誘導し染料ロード（TED）は、蛍光イメージングによる細胞内カルシウムストアのダイナミクスの解析をサポートしています。それは合成の低親和性のCaローカルマスキングを改善し、小胞体（ER）に換えカルボキシルエステラーゼの標的に対するメソッド拠点<sup&gt; 2 +</supER内腔&gt;インジケーター色素。

ターゲット-エステラーゼ誘起染料の読み込み（TED）とERカルシウムの直接イメージング

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

本実験の全体的な目的は、生細胞の小胞体内腔におけるカルシウムダイナミクスを直接可視化することです。これは、標的エステラーゼ誘導染料（TED）ベクター構築物を細胞に導入し、小胞体においてカルボキシルエステラーゼCS2を過剰発現させることで達成されます。次に、細胞をアセトメチルエステルカルシウム指示薬であるFluo-5 NAcとインキュベートします。この指示薬は、細胞膜および小胞体膜を拡散して内部に浸透します。その後、カルボキシルエステラーゼによって切断されます。エステル基がER腔内でカルシウム感受性指示薬を遊離させ、蛍光性カルシウム複合体が形成されます。ライブセルイメージングに基づいた、ER内の遊離カルシウム濃度の変化を示す結果が得られます。この手法は、細胞内カルシウム恒常性の調節に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。カルシウムシグナルは通常、細胞質でモニタリングされるため、カルシウムが細胞外空間から細胞質に流入しているのか、あるいは細胞内のERカルシウム貯蔵庫から流入しているのかを容易に区別することはできません。この制限を克服するため、私たちは標的エステラーゼ誘導ダウンローディング法を開発しました。この手法により、小胞体（ER）から放出されるカルシウムを直接モニタリングすることが可能です。このアプローチは非破壊的です。細胞膜は完全な状態で維持され、細胞内シグナル伝達カスケードも保存されます。一般的に、本手法は経験を要するため、慣れていない方が行う場合は困難が予想されます。TED Vector発現において、我々はCES2カルボキシラーゼに融合させたcentタンパク質を発現するベクター構築物を開発しました。これにより、実験中にARカルシウムイメージングに適した細胞を容易に特定することができます。適した細胞とは、強い赤色蛍光を示し、カルシウムインジケーターの蛍光が中程度から強いものである細胞を指します。これらの蛍光ラベルは小胞体全体に均一に分布し、核領域には存在していなければなりません。開始する前に。テキストのプロトコルに従って、人工脳脊髄液（A CSF）およびFluoro-5 NAMを調製します。A CSFを室温まで予熱し、ブドウ糖を加えます。その後、カーボゲンを用いてA CSFを5分間エアレーションします。次に、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムの1 Mストック溶液を、それぞれ最終濃度が2 mMとなるように添加します。ライブイメージング顕微鏡とコンピュータープログラムを起動した後、ダミーイメージングチャンバーで灌流を開始し、チューブシステムを平衡化させます。インライン溶液ヒーターと顕微鏡ステージ上のイメージングチャンバーを予熱し、システムを32～37 °Cに平衡化します。細胞に色素をロードするためのダウンローディング手順を開始する前に、予熱したA CSF 100 µLを5 mM Fluo-5 NAMの0.5 µL分注液に加え、ウォーターバスで溶液を溶解させます。90秒間ソニケーションを行い、予熱したイメージング溶液 400 µLを4ウェルまたは24ウェルプレートの1ウェルに移します。同じウェルにD溶液を加え、5 µM溶液 500 µLを調製します。次に、細胞を載せたカバーガラスをウェルに慎重に配置し、37 °Cの細胞培養インキュベーター内で適切な時間インキュベートします。ローディング時間とDの濃度は、細胞種、細胞密度、および実験の特定のニーズによって異なります。長時間のインキュベーションは細胞、特に初代ニューロンやグリア細胞に悪影響を及ぼす可能性があり、これは生理学的刺激に対する反応性に決定的な影響を与えます。30分以上のインキュベーションは、例えばスパインのMUEsのような小さなマイクロドメインにおけるERカルシウムの分布を調査するERカルシウム局在化実験においてのみ有用です。インキュベーション後、直ちにカバーガラスをイメージング溶液を含む別の細胞培養ウェルに移動させます。細胞をイメージングチャンバーにマウントする準備として、ペイントブラシを用いてイメージングチャンバーに高真空グリースを塗布します。本研究では、10〜12 mmのカバーガラスに対応した自作の低容量イメージングチャンバーを使用しており、これにより1分間に最大15回のバッファー交換という高速な灌流速度を実現しています。Fluo-5でラベル化し細胞をロードしたカバーガラスをピックアップし、乾燥を防ぐためにイメージング溶液を少量滴下します。次に、カバーガラスを裏返しにして、細胞をイメージングチャンバーにマウントします。綿棒を使用してカバーガラスをシリコーン接着剤に押し付け、ガラスカバーガラスの底面から残留バッファーを拭き取ります。続いて、ダミーのイメージングチャンバーを実験用イメージングチャンバーに交換します。細胞選択のため、連続灌流により5〜10分間細胞を洗浄します。flu oh fiveおよびER内のcalcium twoの急速な光退色を防ぐため、顕微鏡ではレーザー照射量を最小限に抑え、2〜4 Hzの高スキャンレート、小さな画像サイズ、および高ゲインの設定を使用してください。植物実験に従って行います。実験の開始時に、fluo-4およびカルシウムラベルの細胞内分布と、red carbox esterase構築物の赤色蛍光ラベルを確認し、記録します。ここでは、関心のある細胞、すなわち高解像度XYZイメージスタックによる代表的なニューロンを用いて、特定の実験条件下での小胞体（ER）カルシウムダイナミクスをモニターするためのXYTイメージングを行います。当システムにおける標準的な設定は、テキストプロトコルの表2に記載されています。イメージング溶液による連続灌流下でERカルシウムの変化をモニターします。バッファー交換速度は、細胞洗浄およびサルコ・小胞体カルシウムATPase（SERCA）を阻害することによるストア枯渇時には1.5 mL/minとし、ATPおよび代謝型グルタミン酸受容体アゴニストであるDHPGによる刺激時には3 mL/minとします。ここでは、グリア細胞を 200 µM の ATP で 10 秒間刺激します。画像を処理するには、多色イメージング用の ImageJ プログラムで画像スタックを開きます。ソフトウェアの指示に従って RGB チャンネルを分割してください。関心領域（ROI）を指定します。目的に応じて、小胞体（ER）全体、またはERの狭い範囲にROIを設定してください。Time Series Analyzerプラグインを使用して、ROI内の平均ピクセル強度を読み取ります。この公式を用いて、ΔF/F₀による背景補正後の蛍光相対変化量を算出します。蛍光相対変化量は、Y軸にΔF/F₀、X軸に時間をとったトレースとして提示します。この図では、A細胞（皮質アストロサイトおよび海馬ニューロン）が赤色蛍光TEDベクターを発現しており、低親和性カルシウムインジケーターで標識されています。Fluo-5N。この蛍光カルシウムインジケーター複合体は、すべての細胞型の小胞体へと局在します。この図は、Fluo-5Nで標識されたグリア細胞を示しています。CIN処理中、CIN処理の前後に細胞の形質膜が損傷している場合、細胞質に明るい標識が見られます。これにより、Fluo-5Nもまた内因性エステラーゼによって細胞質に放出されることが明らかになります。この実験では、培養海馬ニューロンをFluo-5Nでラベル化した後、SERCAブロッカーであるサイクロニ酸を用いてERカルシウム枯渇を誘導しています。ここで示されているタイムラプスシリーズは、ATPで刺激したマウス皮質グリア細胞における、関心領域（ROI）あたりの平均蛍光密度の極めて大きな変化に注目してください。蛍光が急激に低下し、その後回復しており、これはERカルシウムの放出と再充填を表しています。同時に、赤色蛍光タンパク質の蛍光は、光退色の結果としてわずかに減少しています。図は、すべての実験ではありませんが、一部の実験における蛍光強度の経時変化を示しています。刺激中に一部のFluo-5N錯体が失われるため、蛍光値は初期の蛍光強度レベルまで戻りません。この動画では、Fluo-5Nカルシウム錯体で標識し、ATPで刺激したカルボキラーゼ2感染BHK 21細胞を高解像度で示しています。ATPによるカルシウム放出およびERカルシウムストアの再充填が、ER小管の微細構造において可視化されていることに注目してください。この手順を行う際は、完全に健康な細胞のみが生理的なカルシウム応答を示すことを念頭に置くことが重要です。したがって、同一バッチの細胞を用いて、相互に関連する一連のカルシウム恒常性実験を1日で実施することを推奨します。当研究室の経験では、Fluo-5Nが最適ですが、このカルシウムインジケーターは光退色にあまり強くありません。そのため、本手法は、より光退色耐性の高い低親和性カルシウムインジケーターの開発によってさらに改善されると考えられます。このビデオを視聴することで、合成低親和性カルシウムインジケーターを用いて細胞外カルシウム一過性変化をイメージングする方法について深く理解することができます。これらのインジケーターを使用することで、高い時間分解能で細胞外カルシウムダイナミクスをモニタリングすることが可能になります。そのため、本手法はシナプス可塑性に関与するカルシウムシグナリングカスケードの研究や、神経変性疾患の細胞モデルにおけるカルシウム恒常性の変化をモニタリングする際に有用であると考えられます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

小胞体は、タンパク質の生合成とカルシウムの恒常性において重要な役割を果たしている。私たちは、私たちはCa2 +のリークチャネルの役割に対処し、それらの推定調節機構を特徴づけることを可能にする実験系を確立しています。このシステムは、siRNAを介した遺伝子サイレンシングと生細胞のCa2...

siRNAを介した遺伝子サイレンシングと組み合わせることで生細胞のカルシウムイメージングでは、CAを識別 2 + ER膜のリークチャネルとその調節機序

この記事の目的は、デジタル免疫蛍光顕微鏡を用いたラットの軟膜動脈のスライスにエストロゲン受容体α（ERα）​​の免疫蛍光検出を最適化する方法を示すことです。...

デジタル免疫蛍光顕微鏡を用いたラット軟膜細動脈におけるエストロゲン受容体-αのイメージング

神経回路網の開発の自発的な活動は、カルシウム感受性インジケータ染料のAM...

皮質ネットワークの開発で機能的カルシウムイメージング

私たちは、生きた細胞の共焦点イメージングにより、小胞体（ER）に常駐トランスフェクションし、蛍光タンパク質の分布や移動性を調査するために使用して画像化のアプローチについて説明します。また、超微細構造、この細胞内区画のアーキテクチャにその発現の効果を分析する。...

培養細胞における小胞体サブドメインの可視化

ここでは、Ca2+インジケーターをロードした無傷の哺乳類細胞で蛍光顕微鏡を使用して、局所的なIP3媒介Ca2+イベントをイメージングする技術と、これらのイベントの識別と分析を自動化するアルゴリズムを紹介します。...

イメージングローカルCA<sup&gt; 2+</sup&gt;培養哺乳動物細胞内シグナル

小胞体カルシウムの恒常性は、さまざまな病状で破壊されます。 分泌型小胞体カルシウムモニタリングタンパク質(SERCaMP)レポーターを使用して、小胞体カルシウム貯蔵の混乱を検出できます。  このプロトコルは、小胞体カルシウムの恒常性をin vitroおよびin vivoで調べるためのGaussia luciferase...

使用して小胞体カルシウムの恒常性の監視<em&gt;ガウ</em&gt;ルシフェラーゼSERCaMP

我々は、リアルタイム蛍光顕微鏡法を用いて、HEK293および骨格筋C2C12細胞の小胞/筋小胞体（ER / SR）における急速なカルシウム過渡状態をモニタリングするための、標的遺伝子操作されたカルシウムインジケータ（GECI）CatchER + in situ K d測定および較正のためのプロトコルについても議論する。...

目標とするCaを用いたER / SRカルシウム放出のモニタリング<sup&gt; 2+</sup&gt;センサーキャッチャー<sup&gt; +</sup

マウスの神経筋接合部で個々 のセル型の集団のイメージ...

Ex Vivoセル固有カルシウム マウス ダイヤフラムの三者のシナプスでシグナル伝達のイメージング

ここで Ca2 +イメージング ニューロンとグリア細胞内 Ca2 +シグナル細胞レベル下の解像度での解剖を可能にするためのプロトコルを提案する.このプロセスは、遺伝子にエンコードされた Ca2...

膜をターゲットとした Ca2 +インジケーターによる培養細胞のローカル Ca2 +シグナルの解剖

このプロトコルは、麻酔薬を使用したマウスの近くの血管から脳を包み込む周囲細胞からの蛍光カルシウム画像と血流データを取得して分析するステップを提示する。これらの技術は、壁画細胞生理学の研究に有用であり、任意の細胞型のカルシウム過渡症を調査するために適応することができる。...

生体内のトランスジェニックマウスにおける脳ペリサイトカルシウムと血行力学イメージング

本プロトコルは、ハイスループット薬物スクリーニングおよび毒性試験のためのiPS細胞由来心筋細胞(iPSC-CM)におけるトリガーされた細胞活性の全光学制御および観察を記載しています。時間および空間における表現型パターンのマルチパラメトリック定量化が示されている。数時間にわたる薬物の長期的な影響、または数日間にわたる連続測定が実証されています。...

毒性試験および表現型薬物スクリーニングのためのiPS細胞由来心筋細胞におけるカルシウムシグナルのハイスループット光学制御および記録(英語)

学ぶTED法による生細胞の小胞体カルシウムダイナミクス可視化。標的エステラーゼを用いて低親和性カルシウムインジケーターを活性化し、蛍光イメージングで細胞内カルシウム動態をリアルタイムに解析する革新的アプローチです。

ターゲット-エステラーゼ誘起染料の読み込み（TED）とERカルシウムの直接イメージング

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