Name: 生きたマウスにおける血管炎症及び血栓形成の間に活性化内皮上に異型血小板、好中球の相互作用のリアルタイムイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: 学ぶ血管炎症における血小板と好中球の相互作用を、蛍光生体顕微鏡法を用いて生きたマウスでリアルタイムに可視化する方法。この技術は血管疾患の動態解明と薬理学的介入の評価に有用です。

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この作品は、国立衛生研究所からの助成金（JC〜P30のHL101302とRO1 HL109439）とアメリカ心臓協会（JCへSDG 5270005）によって部分的にサポートされていました。 A. BaraziaはT32HL007829 NIHの訓練助成金によって支えられている。

1。生体内顕微鏡の調製（図1A） <ol><li>灌流バッファー（125 mMのNaCl、4.5 mMのKClを、2.5 mMのCaCl 2、1mMのMgCl 2、17 mMの飽和NaHCO 3、pH7.4）を準備します。 </li><li> 37℃バッファおよび熱制御毛布の温度を維持するために、循環水浴℃にオンにします窒素ガス（5％CO 2が窒素とのバランス）でバッファを通気する。 </li><li>顕微鏡システム（サッターラムダDG-4高速波長チェンジャー、ワークステーションコンピュータ、オリンパスBX61W顕微鏡は、MPC-200マルチマニピュレータ、ROE-200ステージコントローラ、高速カメラ、インテンシファイア）をオンにします。 </li><li>血管炎症モデルでは、100パーセントダイクロイックミラーを使用しています。レーザー損傷による血栓形成を誘導するために、50/50％のミラーと100％のミラーを交換し、micropointレーザーアブレーションシステムの電源をオンにします。 </li></ol> 2。生体顕微鏡用の精巣挙筋の調製（図1B） <ol><li>麻酔をかけるケタミン（125 mg / kg体重（BW））およびキシラジン（12.5 mg / kg体重）の腹腔内注射により雄マウス（6-8週齢のC57BL / 6）。イリノイ州インスティテュー動物実験委員会の大学はすべての動物のケアと実験手順を承認した。血管炎症モデルでは、（手術前に2から2.5時間）前の画像へintrascrotallyマウス3時間にマウスTNF-α（250μlの生理食塩水で0.5μg）を注入します。 </li><li>生体顕微鏡トレイに37℃の熱制御の毛布の上にマウスを置きます。 </li><li>鉗子を使用して首の表面に皮を上に引いて、ハサミで1cmに水平に首の皮膚の正中線を切開。 </li><li>優しく鈍はさみを使用して子宮頸部の筋肉を開き、気管を取り巻く筋肉を削除します。 </li><li>呼吸困難を排除するための気管内チューブPE90カニューレを挿入。 </li><li>優しく頸部筋肉の左側を削除し、周囲の組織から頚静脈を隔離する。 </li><li> Cアンヌ抗体および追加の麻酔薬の注入のための左頸静脈に遅くPE10チューブ。 </li><li>優しく引き出し、水平に陰嚢の皮膚を切開する。実験を通して組織の完全性を維持するためには、あらかじめ温めておいたバッファは手術野の上に灌流した。 </li><li> 1鉗子と下腹部を押して、慎重に他の鉗子と睾丸を引き出します。 </li><li>精巣の周りに周囲の結合組織を削除します。 </li><li>垂直精巣挙筋を切開し、周囲を固定することによって、生体内顕微鏡トレイ上のカバーガラスの上に筋肉を平らにする。 </li><li>筋肉のために10〜20分は、データ収集の前に安定させることができます。 30から45μmの直径を有する精巣挙筋細動脈（血栓形成）と細静脈は（血管の炎症のために）我々の研究のために選択された。 </li><li>麻酔状態を維持するために、頸静cannulusを通して約30分毎に同じ麻酔薬の30-50 mlを吹き込む。 </li></ol> &lt;Pクラス= &quot;jove_title&quot;&gt; 3。 TNF-α誘導血管炎症のために生体顕微鏡<ol><li>生体顕微鏡、オープンSlideBook 5.0ソフトウェア上でマウスを配置した後にして、適切な光学系と対物レンズ（60X）を設定するには、メニューバー上の &quot;フォーカス·ウィンドウ&quot;をクリックしてください。 </li><li> Dylightを吹き込む488結合ラット抗マウスCD42c（100μlの生理食塩水で0.1μg/ gでBW）とAlexa Fluor 647-結合ラット抗マウスGR-1抗体（100μlの生理食塩水に0.05μg/ gでBW）の頸静脈を介しcannulus 。 </li><li>メニューバーに移動し、ツールバーの &quot;イメージキャプチャ&quot;をクリックしてください。 </li><li> &quot;イメージ&quot;は、1x1のように &quot;ビン·ファクター&quot;を選択し、高さの幅と &quot;460&quot;の &quot;640&quot;を選択し、新しいメニューがポップアップ表示されます。 </li><li> &quot;フィルタ設定&quot;で、それぞれの露光時間を公開して、設定したいチャンネルのチェックボックスをマークします。たとえば、オープンチャネル：10ミリ、FITCチャンネル：50ミリ秒、およびCy5チャンネル：50ミリ。 </li><li>時点と間隔の数を調整する &quot;タイムラプス撮影&quot;を選択します。フォーR炎症モデル、時間ポイントの数は、200ミリ秒（5分合計経過時間）の間隔で1,000〜1,500に設定されています。 </li><li>そのチャネルに指定された露光時間でシングルプレーンのイメージを表示するには &quot;Test&quot;をクリックします。ヒストグラムが適切な強度分布を（マルチチャンネル·キャプチャでは、各チャンネルごとに、このプロセスを繰り返します）が表示されるまでの露光時間および/または顕微鏡光を調整します。 </li><li>一度すべてのパラメータは、 &quot;イメージキャプチャ&quot;で（チャンネル、露光時間など）が設定されて、キャプチャを開始するには &quot;スタート&quot;を選択します。 </li><li>血管炎症モデルにおける炎症精巣挙小静脈の上半分に5分間圧延および付着血小板や好中球を監視します。八から十異なる細静脈は、1つのマウスに記録されます。 </li><li>画像は157×118μmのμmのウィンドウサイズを与える60Xの総合倍率（1.0 NAの水浸対物レンズ）を使用して撮影した。 </li><li>実験終了時には、マウスを頸椎dislocatio経由で安楽死させたnである。 </li></ol> 4。細静脈の炎症モデルのためのデータ解析<ol><li> SlideBook 5.0ソフトウェアを開き、ファイルを開くには、メニューバーの &quot;フォルダ&quot;をクリックしてください。 </li><li>ドロップダウンチャンネルメニューをクリックし、 &quot;オープン、FITC、Cy5で、等&quot;を選択してください</li><li> &quot;（赤と緑のバー）再正規化&quot;をクリックしてチャンネルを選択します。大体蛍光シグナルを最適化するために、左または右に赤と緑のバーをドラッグします。 </li><li> &quot;適用&quot;と &quot;OK&quot;画像を更新します。 </li><li>デフォルトとして、現在の表示を選択する &quot;サムネイルボタン&quot;をクリックします。 </li><li>キャプチャされたタイムラプス画像を再生し、5分間の間圧延および接着性好中球を数える。 </li><li> 血小板血栓形成を分析するには 、 &quot;マスク&quot;に行って、 &quot;作成&quot;を選択します。 </li><li> &quot;現在のイメージでは&quot;マスクとマークを付けます。 </li><li>メインビューで &quot;矩形選択ツール&quot;の &quot;大規模な鉛筆アイコン&quot;をクリックしてください。 </li><li>背景マスクを設定するには、メインビューに容器の外側の領域に色をつける。 </li><li> tを行く○ &quot;マスク&quot;、 &quot;この飛行機をコピー&quot;をクリックし、 &quot;現在の時点でコピーマスク&quot;をクリックし、 &quot;すべての時点&quot;を選択し、 &quot;OK&quot;をクリックします。 </li><li> 背景信号を計算するには 、 &quot;統計&quot;に移動し、 &quot;マスクの統計&quot;をクリックします。 </li><li>イメージスコープで &quot;現在の2D時間の経過または4D画像（s）&quot;をクリックして、マスクの範囲内の &quot;マスク全体&quot;を選択します。特集では、 &quot;経過時間（HH：MM：ミリ秒）&quot;を選択してキャプチャの日付の下に、選択した &quot;エリア（ピクセル）&quot;形態計測で、強度の下で &quot;最大輝度&quot;を選択し、 &quot;エクスポート&quot;をクリック（この統計方法は、私たちにでき自家蛍光強度（バックグラウンド信号））を計算します。 </li><li> MS OfficeのExcelでテキストフ​​ァイルを開き、記録期間を通じてバックグラウンド信号の平均値を計算します。これは、バックグラウンド蛍光強度である。 </li><li> 血栓強度を決定するには 、メインビューで&quot;矩形選択ツール&quot;で再び&quot;大鉛筆アイコン&quot;をクリックしてください。 </li><li>血小板信号を設定するためのメインビューで、容器内の色。 </li><li> &quot;マスク&quot;に進み、 &quot;この飛行機をコピー&quot;をクリックし、 &quot;現在の時点でのコピーマスク&quot;をクリックし、 &quot;すべての時点&quot;を選択し、 &quot;OK&quot;をクリックします。 </li><li> &quot;統計&quot;に移動し、 &quot;マスクの統計&quot;をクリックします。 </li><li>イメージスコープで &quot;現在の2D時間の経過または4D画像（s）&quot;をクリックして、マスクの範囲内の &quot;マスク全体&quot;を選択します。機能では、選択して &quot;経過時間（HH：MM：MS）の&quot;キャプチャーの日付の下に、私たちにできるという &quot;面積（画素）&quot;形態計測で、強度の下で &quot;合計強度&quot;を選択し、 &quot;エクスポート&quot;（この統計方法をクリックし選択）容器内の蛍光強度を計算します。 </li><li> MS OfficeのExcelでテキストフ​​ァイルを開きます。血小板の蛍光シグナルは、血管の内側の和の強度からバックグラウンド強度×面積（画素）の平均値を減算することによって計算されます。これは血小板血栓の蛍光強度である。 </li><li> 3〜5つの異なったマウスでは30種類の細静脈でこれを繰り返します。その後、血小板の蛍光強度の中央値を計算する。 </li><li> へ好中球のローリングとの接着性を分析し、好中球の転がり流入は各小静脈で5分間にわたって決定し、毎分の細胞数として発表された。 &gt; 30秒間静止していたゆっくりとクロール（&lt;10μmの30秒以上）がロールオーバーされませんでした付着性好中球数は、5分ごとの細胞数としてカウントされ、発表されました。 </li></ol> 5。レーザー誘起動脈血栓症に対する生体顕微鏡アブレーションレーザー5-1キャリブレーション<ol><li>顕微鏡ステージ上でミラーリングされたスライドを入れ、スライドの上部に蒸留水の小滴を適用し、強度を調整して、接眼レンズを使用して焦点を当てています。 </li><li> &quot;フォーカスウィンドウ&quot;を開き、SlideBook 5.0ソフトウェアでは &quot;FRAP&quot;タブを選択します。 </li><li> 40から50にレーザパワーを設定し、両方の &quot;ダブルクリックの繰り返し&quot;と &quot;ダブルクリックサイズ&quot; 8に設定します。クロスヘアのセットを起動するには、 &quot;ガイド&quot;ボックスをマークします。 </li><li>タスクバーoから &quot;矢印&quot;アイコンを選択nは画面の上部に。 </li><li> &quot;FRAPアライメント&quot;タブで、 &quot;次の火&quot;をクリックしてください。小さなスポットは、モニターの左下隅の近くに表示されるはずです。スポットが表示されたら、それの中心をダブルクリックします。一度クリックすると、別の場所は、上記に表示され、最初のスポットの右側にする必要があり、それをダブルクリックします。キャリブレーションパラメータを更新するために完了したら、 &quot;Save&quot;をクリックします（16 番目のスポットは、右下隅に表示されます。）16点に対してこの手順を繰り返します。 </li><li>キャリブレーションの精度をテストするには、画面の中央に表示されるはずです &quot;センター&quot;ボタン小さなスポットをクリックしてください。されていない場合は、所望の精度が達成されるまで、校正を繰り返す。 </li></ol> 5月2日レーザー誘起細動脈の血栓形成<ol><li>顕微鏡ステージ上でマウスを麻酔し（2-2〜2-12の手順を参照してください）​​を配置します。 </li><li> &quot;キャプチャ&quot;ウィンドウの下のプロトコルを選択するか、または新しいものを作成します。設定は次のとおりです。CY5（70ミリ秒露光）、オープン（10 MSEC露出）、およびFITC（50ミリ秒露光）。画像は20分（500ミリ秒のインターバル時間が約2400時間点）上に捕捉される。 </li><li> Dylight前述のように488結合抗マウスCD42cおよびAlexa Fluor 647標識抗マウスGR-1抗体を吹き込む。 </li><li> 3-7を3-3で説明されているように、蛍光強度と、明視野顕微鏡像を含むパラメータを最適化します。 </li><li>適切な明視野強度や抗体シグナル、動脈配置し、フォーカスを確保するための &quot;テスト&quot;ボタンをクリックします。 </li><li>イメージキャプチャプロセスを開始するために &quot;Start&quot;をクリックしてください。 </li><li>アブレーションレーザーを発射する前に、マウスポインターのアイコンが選択され、血管壁に明確な焦点になっていることをされていることを確認してください。 </li><li>レーザーを発射するには、二重容器壁2から3μmの内部でスポットをクリックしてください。細動脈内皮細胞の傷害が明視野像では明らかなはずである視覚的形状の変更が生じますが、血小板の蓄積が続く。モニター血栓レーザー損傷後の5分間形成。 </li><li>レーザー損傷5分後に一時停止（血栓サイズは、現在安定していなければならない）とキャプチャをキャンセルします。その後、20分間付着血小板やローリング/付着した好中球を記録するために500ミリ秒間隔で2400年時点でキャプチャを開始。 3〜5個の動脈は、1つのマウスに記録されます。 </li><li>実験終了時には、マウスを頸椎脱臼を経由して安楽死させた。 </li></ol> 6。動脈血栓モデルのためのデータ解析<ol><li> 4.5〜ステップ4.1を越える。 </li><li> 血小板血栓形成中にバックグラウンド蛍光強度を得るためには 、4.14〜ステップ4.7を越える。 </li><li> &quot;マスク&quot;に進み、 &quot;セグメント&quot;をクリックして、チャネル内のFITCを選択して、ローに背景信号の平均値を挿入します。 &quot;適用&quot;をクリックし、 &quot;OK&quot;をクリックします。 </li><li> 血小板血栓の蛍光強度（Dylight 488結合抗CD42c抗体）を分析するために、 </stチョロン&gt; 4.19〜ステップ4.18を越える。抗体シグナルを計算するには、 &quot;合計強度が&quot;バックグラウンド信号（ &quot;最大輝度&quot; x &quot;の面積（ピクセル）&quot;）から減算されます。これは血小板血栓の蛍光強度である。 </li><li> 圧延および好中球の接着を定量化するために 、微速度撮影を再生し、目に見えて20分かけて血小板血栓をロールオーバーしたセルの数をカウントします。少なくとも2秒間血小板血栓と対話しながらのローリングは、好中球の速度の低下として定義されています。付着した好中球は、少なくとも2分間血小板血栓に接続されたまま、任意の好中球のように定義されます。ローリングと接着好中球数は、20分あたりの細胞数として発表された。ローリング速度は、粒子追跡システムを用いて算出した。 </li></ol>

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</ol>

著者らは競合する経済的利害関係を宣言しない。

ここでは、血管の炎症や血栓症の間に活性化内皮上の異血小板、好中球の相互作用を可視化するためのリアルタイム蛍光生体顕微鏡検査のための詳細なプロトコルを記述します。以前、似たような蛍光顕微鏡のアプローチは血栓形成と血管炎症の分子メカニズムを研究することが報告された。8,12異型細胞間の相互作用は、損傷部位での血管閉塞のために重要であるかもしれないので、この技術はのための貴重なツールとなるでしょう血管疾患の細胞および分子メカニズムを研究。リアルタイムイメージング技術の利点は、炎症性および血栓条件下で活性化/損傷した血管内皮細胞上の細胞の即時および後続の相互作用をモニターすることです。さらに、私たちの顕微鏡システムはフルオを使用して循環腫瘍細胞と内皮や血液細胞間の相互作用を研究する異型で利用することができるそのようなヒト上皮細胞接着分子（EpCAM）などの腫瘍細胞マーカーに対する腫瘍細胞または抗体rescently標識。蛍光標識された抗体を用いての13,14代わりに、この顕微鏡はまた、特定の細胞型で蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスを用いて実施することができるCD41-EYFP +巨核球...

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>10035-04-8</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 6H2O</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック<td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>0.9% NaCl 生理食塩水</td><td>Hospira</td><td>0409-4888-10</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Hospira</td><td>0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>ロイド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イントラメディック チューブ (PE 90)</td><td>BD 診断</td><td>427421</td><td></td></tr><tr><td>イントラメディック チューブ (PE 10)</td><td>BD 診断</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>マウス TNF-&alpha;</td><td>R&D Systems</td><td>410-MT</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 488-標識ラット 抗マウス CD42b 抗体 </td><td>Emfret Analytics</td><td>X488</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-標識抗マウス Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) 抗体</td><td>BioLegend</td><td>108418</td><td></td></tr><tr><td>NESLAB EX ウォーターバス/サーキュレーター</td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX61W 顕微鏡</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TH4-100パワー</td><td>オリンパス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ラムダ DG-4</td><td>サッター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MPC-200 マルチマニピュレーター</td><td>Sutter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R&#8211;-200 ステージコントローラー</td><td>Sutter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C9300 ハイスピードカメラ</td><td>浜松</td><td></td><td></td></tr><tr><td>インテンシファイア</td><td>ビデオスコープ インターナショナル</td><td></td><td></td></tr>アブ<tr><td>レーションレーザー</td><td>フォトニック・インスツルメンツ(株)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SlideBook 5.0</td><td>インテリジェントイメージングのイノベーション</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

生きたマウスにおける血管炎症及び血栓形成の間に活性化内皮上に異型血小板、好中球の相互作用のリアルタイムイメージング

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

活性化された内皮細胞を媒介血栓症および血管炎症で活性化された血小板と白血球の相互作用（主に好中球）。1,2動脈損傷部位に血栓形成の間、活性化内皮に付着した血小板と内皮下マトリックスタンパク質は、好中球のローリングや接着をサポートしています3逆に、細静脈の炎症性条件の下で、活性化された内皮細胞に付着して好中球が循環する血小板の付着·蓄積をサポートすることができます。異血小板好中球凝集は細胞間の特異的受容体-カウンター受容体の相互作用によってシーケンシャルプロセスを必要とします。4それが活性化された内皮細胞は、それによって高剪断条件下で血小板の接着および蓄積を開始する、そのようなvon Willebrand因子として接着分子を放出することが知られている。5はまた、活性化された内皮細胞は、セレクチン発現させることにより、好中球のローリングとの接着性をサポートD細胞間接着分子-1（ICAM-1）は、それぞれ、低剪断条件下で4血小板P-セレクチンは通って好中球と相互作用するP-セレクチン糖タンパク質リガンド-1（PSGL-1）することにより、好中球β2インテグリンと企業の活性化を誘導する2種類の細胞間の接着。異型の血小板、好中球の相互作用は、全血または単離された細胞、6,7で決定されたin vitroの実験での進歩にもかかわらず、それらの研究では、血管疾患の間に酸化ストレス状態を操作することはできません。本報告では、蛍光標識を使用して、マウス血小板および好中球のマーカーに対する特異的抗体は、我々はTNF-α誘導炎症時に活性化された内皮細胞に血小板や好中球の異型相互作用をモニターするための詳細な生体顕微鏡プロトコルを記述したり、レーザー誘起に続く生きたマウスの精巣挙筋の微小血管の損傷。

詳細な生体顕微鏡分析を用いて、活性化された内皮細胞上の異型の血小板、好中球の相互作用は、生きたマウスへ血小板（CD42c）または好中球マーカー（GR-1）に対する蛍光標識抗体の注入による可視化した。 TNF-α誘導細静脈の炎症のモデルでは、最も転がり好中球は安定記録期間（TNF-αの注射後3から4.5時間、 図2Aの間に、ICAM-1の活性化β2インテグリンとの相互作用によっておそらくは内皮に付着させたビデオキャプチャはTNF-α誘導内皮細胞活性化のために開始される前に）。8ローリングや接着好中球は、すでに存在していた。炎症を起こした内皮細胞上圧延及び接着好中球数は0.25±0.05であった分当たりの細胞および18.5±それぞれ5分間当たり0.7細胞（ 図2B及び2C）。最も好中球は、tに付着させた彼はビデオキャプチャの継続時間（1〜1.5時間）の内皮細胞を活性化し、接着した細胞内の最小限の減少は、ローリング細胞（データは示さず）で最小限の増加に伴ってのみありました。我々は、ほとんどの血小板...

ここでは、血管の炎症や生きたマウスにおける血栓形成の間に活性化内皮上の異血小板、好中球の相互作用を可視化する蛍光生体顕微鏡の実験手法を報告する。この顕微鏡技術は、血管疾患の分子メカニズムを研究することが、病態生理学的な条件下での薬理学的薬剤をテストするためにも役立ちます。

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

本実験の目的は、血管疾患時における活性化内皮細胞上での血小板と好中球の典型的な相互作用を可視化することです。これは、生体マウスにおけるリアルタイム蛍光生存体内顕微鏡観察を用いて、クレマスター筋内の微小血管を可視化することで達成されます。次に、蛍光標識抗体を注入し、血管炎症または傷害を誘発することで、その結果生じる典型的な血小板と好中球の相互作用を直接的に可視化します。次に、細胞数とそのダイナミクスを定量化するために、保存されたデータを解析します。最終的に、リアルタイム生体内顕微鏡観察における注入抗体の蛍光シグナルに基づき、活性化内皮上の血小板と好中球の直接的な典型的相互作用を評価できます。本生体内顕微鏡技術により、血管炎症および血栓形成時における活性化内皮上の血小板と好中球のリアルタイムな相互作用に関する知見を得ることが可能です。この技術は、がん細胞と血液細胞の相互作用の評価など、他のシステムにも適用可能です。実験を開始する前に、血管炎症モデル用の顕微鏡システムを起動してください。麻酔薬を腹腔内（IP）投与する3時間前に、TNF alphaを腹腔内投与します。足指へのピンチ刺激で鎮静を確認した後、呼吸困難を解消するためにPE 90チューブをマウスの気管に挿管します。次に、蛍光標識抗体および追加の麻酔薬を注入するため、左頸静脈にPE 10チューブを挿管します。その後、陰嚢の皮膚を慎重に牽引して水平に切開し、術野に予熱した緩衝液を注いでください。次に、片方のピンセットで下腹部を圧迫しながら、もう一方のピンセットで精巣を慎重に引き出し、精管挙筋を垂直に切り出し、顕微鏡用トレイ上のカバーガラスの上に筋肉を広げ、周辺組織をトレイにピンで固定して平坦にします。このステップを開始する前に、あらかじめ留置した頸静脈カニューレから、DITE 4 88標識ラット抗マウスCD 42 C抗体およびAlexa fluor 6 47標識抗マウスGR one抗体を注入します。その後、顕微鏡のフィルター設定で、使用するチャネルのチェックボックスをオンにし、タイムラプス撮影用に各チャネルの露光時間を設定します。タイムポイント数を1000から1500に、間隔を200 millisecondsに設定し、総経過時間を5分にします。イメージキャプチャのすべてのパラメータを設定したら、「Start」を選択して、倍率60 x、ウィンドウサイズ157 µm × 118 µmでキャプチャを開始します。炎症を起こした精管静脈の上半分において、ローリングおよび好中球への血小板の接着を5分間観察します。血小板血栓の形成を解析するには、「mask」に移動して「create」を選択します。次に、メインビューの「marquee tool」にある大きな鉛筆アイコンをクリックします。鉛筆を使用して、メインビューの血管外の領域を塗りつぶします。背景マスクを設定するには、[mask]に移動し、[copy this plane]をクリックして、[copy mask]をクリックします。現在のタイムポイントにおいて、すべてのタイムポイントを選択し、[okay]をクリックします。背景信号を算出するには、[statistics]に移動し、[mask statistics]をクリックします。次にイメージスコープで、「current 2D time-lapse」またはマスクスコープの「four D images」をクリックし、「features」でマスク全体を選択します。「date of capture」で「elapse time」を選択し、「morph geometry」で「area in pixels」、「intensity」で「maximum intensity」を選択してください。次に、「export」をクリックします。テキストファイルをスプレッドシートプログラムで開き、記録期間全体のバックグラウンドシグナルの平均値を算出します。これにより、バックグラウンドの蛍光強度を決定します。血小板血栓形成中の背景蛍光強度を、先ほど示した血管炎症モデルと同様に算出した後、「mask」に移動し、「segment」をクリックして「fit e」と「channel」を選択し、低輝度領域における背景信号の平均値を入力して、「apply」および「okay」をクリックします。次に、「statistics」に移動し、「mask statistics」をクリックします。次に「image scope」で、「current 2D time-lapse」または「four D images」をクリックし、「mask scope」で「entire mask」を選択します。「features」の「date of capture」で「elapsed time」を、「morph geometry」で「area in pixels」を、そして「intensity」で「sum intensity」を選択します。次に、「export」をクリックします。表計算ソフトでテキストファイルを開き、血小板血栓の蛍光強度を算出します。細動脈血栓症の解析を行う場合は、先ほど示したように、DITE 4 88 標識抗マウスCD 42 CおよびANDOR 6 47 標識抗マウスGR one抗体を注入することから始めてください。画像キャプチャプロセスを開始するためにstartをクリックした後、血管壁から内部に2〜3 µm離れた地点をダブルクリックしてレーザーを照射します。細動脈内皮細胞が損傷すると、明視野画像で視認可能な形態変化が起こり、続いて血小板の集積が起こります。レーザー照射から5分後、キャプチャを一時停止し、キャンセルしてください。続いて、20分間にわたって接着血小板、ならびにローリングおよび接着好中球を記録するため、500ミリ秒の間隔で400タイムポイントのキャプチャを開始します。血小板血栓形成時の背景蛍光強度を、血管炎症モデルと同様の方法で算出した後、maskに移動し、segmentをクリックしてfiteおよびchannelを選択し、背景信号の平均値を入力してapplyおよびokayをクリックします。次にimage scopeで、current 2D time-lapseまたは40 D imagesをクリックし、mask scopeでentire maskを選択します。featuresのdate of captureでelapsed timeを、Morphoでarea in pixelsを、そしてintensityでsum intensityを選択します。次に、「export」をクリックします。スプレッドシートプログラムでテキストファイルを開き、血小板血栓の蛍光強度を算出します。ローリングおよび接着好中球を定量化するには、タイムラプス再生を行い、目に見えてローリングしている細胞数をカウントします。20分間のローリングにおける血小板血栓は、好中球が血小板血栓と相互作用し、その速度が2秒以上低下した状態と定義されます。接着好中球は、血小板血栓に2分以上付着し続けたすべての好中球と定義されます。ここでは、赤色で示される好中球および緑色で示される血小板に関連する蛍光信号の外観を示す、代表的な画像を示します。血管炎症時の様子が示されており、矢印は血管内の血流方向を示しています。炎症を起こした内皮細胞上のローリングおよび接着好中球の数は、それぞれ1分あたり0.25個、5分あたり18.5個と決定されました。データは、野生型マウス4匹の30個の異なる血管における平均値±標準誤差を表しています。ここでは、血小板の蛍光積分信号の中央値を時間の関数としてプロットしています。赤色で示されたほとんどの血小板が、炎症を起こした血管壁よりも、緑色で示された接着・遊走中の好中球に付着していることが分かりました。次に、レーザー誘発性細動脈損傷後の好中球と血小板の相互作用について見ていきましょう。これらの画像は、黄色い矢印で示された赤色の単一の好中球が、緑色の血小板血栓上でローリングしている様子を示しています。また、白い矢印で示された赤色の2番目の好中球が、細動脈内皮細胞上で急速にローリングしている様子が、いずれも5秒間のキャプチャ間隔で捉えられています。ここでは、単一の好中球（赤色）が15秒間の間隔で、血小板血栓（緑色）上でローリングし、接着する様子が再び示されています。矢印頭はローリングおよび接着した好中球を特定しており、太い灰色の矢印は血流の方向を示しています。ここでは、血小板の正準化された蛍光信号の中央値が、時間の関数としてプロットされています。ローリングおよび接着した好中球の数は、20分間でそれぞれ21.5個および1.6個であると決定されました。好中球の初期の急速なローリングは内皮細胞上で起こりました。好中球が血小板血栓に接触すると、血小板血栓上の好中球のローリング速度は8.2 micrometers per secondの範囲に変化し、これはpectinとpsgl L oneの相互作用によって媒介されます。データは、レーザー損傷から5分後の野生型マウス7匹における14個の異なる血栓の平均値 ± 標準誤差を示している。血小板血栓の大きさはイメージング中に比較的一定に保たれており、好中球が血栓上でローリングし、接着している。循環血小板からの蛍光信号は無視できる程度である。血小板血栓からの結果と比較して、このビデオを視聴することで、生体マウスを用いたバイタル顕微鏡システムのセットアップ方法を十分に理解し、微小血管内の活性化内皮細胞上における血小板と好中球の間の異種細胞間相互作用をリアルタイムで可視化できるようになります。

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Immunology and Infection

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