生きたマウスにおける血管炎症及び血栓形成の間に活性化内皮上に異型血小板、好中球の相互作用のリアルタイムイメージング

ここでは、血管の炎症や生きたマウスにおける血栓形成の間に活性化内皮上の異血小板、好中球の相互作用を可視化する蛍光生体顕微鏡の実験手法を報告する。この顕微鏡技術は、血管疾患の分子メカニズムを研究することが、病態生理学的な条件下での薬理学的薬剤をテストするためにも役立ちます。

次の実験の全体的な目標は、血管疾患中の活性化内皮上の血小板と好中球の間の典型的な相互作用を視覚化することです。これは、生きたマウスのリアルタイム蛍光生体内顕微鏡法により、火葬筋内の微小血管系を視覚化することで達成されます。第 2 のステップとして、蛍光標識抗体を注入し、尿性炎症または損傷を開始して、結果として生じる典型的な血小板好中球相互作用の直接的な視覚化を促進します。

次に、保存されたデータを解析し、細胞の数とその動態を定量化します。最終的には、活性化された内皮上の血小板と好中球との間の直接的な典型的な相互作用は、リアルタイムの生体内顕微鏡で注入された抗体の蛍光シグナルに基づいて評価できます。私たちの生体内顕微鏡技術は、血管の炎症と血栓形成中に活性化された内皮上の血小板と好中球の間のリアルタイムの相互作用についての洞察を提供することができます。

この技術は、がん細胞と血液細胞の相互作用の評価など、他のシステムにも適用できます。実験を開始する前に、血管炎症モデルの顕微鏡システムの電源を入れてください。麻酔薬のIP注射の3時間前にTNFアルファをミラーリングして、うなり

つま先をつま先でつま先でつま先をつまんで鎮静を確認したら、マウスの気管にPE90チューブをカニューレ挿入して、呼吸困難を解消します。次に、PE 10 チューブを左頸静脈にカニューレ挿入して、蛍光標識抗体と追加の麻酔薬を注入します。次に、陰嚢の皮膚をそっと引き出して水平に切開し、術野に温まっている緩衝液を使用します。

次に、片方の鉗子で下腹部を圧迫し、もう一方の鉗子のサイズで睾丸を慎重に引き出し、車は筋肉を垂直にマスターし、末梢組織をトレイに固定することにより、バイアル内顕微鏡トレイのガラスカバースリップで筋肉を平らにします。このステップは、まず、事前に設定した頸静脈カニューレを介して、DITE 4 88標識ラット、抗マウスCD 42 C、およびAlexa floor 6-47標識抗マウスGR one抗体を注入することから始めます。次に、顕微鏡のフィルターセットで、露光するチャンネルのチェックボックスをマークし、選択した各タイムラプスキャプチャの露光時間を設定します。

タイム ポイントの数を 1000 から 1500 に設定し、間隔を 200 ミリ秒にして、合計経過時間を 5 分にします。画像キャプチャですべてのパラメーターを設定したら、[開始] を選択して、157 マイクロメートル x 118 マイクロメートルのウィンドウで 60 倍の倍率でキャプチャ キャプチャを開始します。炎症を起こした火葬場の上半分で、好中球への支配血小板と付着血小板を5分間監視します。

血小板血栓形成を解析するには、マスクに移動し、作成を選択します。次に、メインビューのマーキーツールの下で、大きな鉛筆アイコンをクリックします。鉛筆を使用して、メイン ビューの容器の外側の領域に色を付けます。

背景マスクを設定するには、マスクに移動し、[この平面をコピー]をクリックし、[マスクをコピー]をクリックします。現在の時点において、すべての時点を選択し、OKをクリックします。バックグラウンド信号を計算するには、統計に移動して [統計のマスク] をクリックします。

次に、画像スコープで現在の2Dタイムラプスをクリックするか、マスクスコープの4つのD画像をクリックして、特徴でマスク全体を選択します。[キャプチャの日付] で [経過時間] を選択します。morph geometryの下で、面積をピクセル単位で選択し、intensityの下でmaximum intensityを選択します。

次に、[エクスポート]をクリックします。スプレッドシートプログラムでテキストファイルを開き、記録期間全体のバックグラウンド信号の平均値を計算します。バックグラウンド蛍光強度を決定するため。

ちょうど尿神経炎症モデルで示されたように、血小板血栓中のバックグラウンド蛍光強度を計算した後、マスクに移動し、セグメントをクリックし、フィットeを選択し、チャネルを選択し、バックグラウンド信号の平均値を挿入します。次に、統計に移動し、[統計のマスク]をクリックします。画像スコープで、マスクスコープで現在の2Dタイムラプスまたは4つのD画像をクリックし、キャプチャの日付の下にある特徴でマスク全体を選択し、モーフジオメトリの下で経過時間を選択し、ピクセルで領域を選択し、強度の下で、強度を選択します。

次に、[エクスポート]をクリックします。スプレッドシートプログラムでテキストファイルを開き、血小板血栓の蛍光強度を計算します。細動脈血栓症の分析には、先ほど示したように、DITE 4 88、標識抗マウスCD、42 C、ANDOR 6、47 標識抗マウスGR One抗体を注入することから始めます。

[開始]をクリックして画像キャプチャプロセスを開始した後、容器壁から内部2〜3マイクロメートルのスポットをダブルクリックしてレーザーを発射します。細動脈内皮細胞の損傷は、明るい視野画像とそれに続く血小板の蓄積で明らかになるはずの視覚的な形状変化を引き起こします。レーザー損傷の5分後、一時停止してキャプチャをキャンセルします。

その後、500ミリ秒の間隔で2, 400の時点からキャプチャを開始し、付着した血小板とローリングおよび付着した好中球を20分間記録します。血小板血栓中のバックグラウンド蛍光強度を尿状炎症モデルと同様の方法で計算した後、マスクに移動し、セグメントをクリックし、fiteとチャネルを選択し、バックグラウンド信号の平均値を挿入して低クリックで適用し、問題ありません。画像スコープで、マスクスコープで現在の2Dタイムラプスまたは40D画像をクリックし、キャプチャの日付で機能でマスク全体を選択し、モルフォで経過時間を選択し、ピクセル単位で領域を選択し、強度で強度を選択します。

次に、[エクスポート]をクリックします。スプレッドシートプログラムでテキストファイルを開き、血小板血栓の蛍光強度を計算します。ローリング好中球と付着好中球を定量化するには、タイムラプスを再生し、目に見えるロールオーバーする細胞の数を数えます。

20 分間の血小板血栓の転がりは、血小板血栓と少なくとも 2 秒間相互作用しながら好中球速度が低下することと定義されます。付着性好中球は、血小板血栓に少なくとも2分間付着したままの好中球と定義されます。ここでは、好中球に関連する蛍光シグナルの出現を赤で、血小板を緑で表した画像を示します。

尿性炎症が示されている間、矢印は血管内の血流の方向を示しています。炎症を起こした内皮細胞上の転がる好中球と付着性の好中球の数は、それぞれ毎分0.25細胞と5分あたり18.5細胞であると決定されました。データは、4つの野生型マウスにおける30の異なるEの平均の標準誤差の平均プラスマイナスを表しています。

ここでは、血小板の積分蛍光シグナルの中央値を時間の関数としてプロットします。赤色のほとんどの血小板は、炎症を起こした血管壁ではなく、緑色の付着性好中球と這う好中球に付着することがわかりました。次に、レーザー誘発細動脈損傷後の好中球血小板相互作用に移行します。

これらの画像は、赤で単一の好中球を示し、黄色の矢印が緑の血小板血栓の上を転がり、赤で2番目の好中球が示され、白い矢印が細動脈内皮細胞を急速に転がる白の矢印で示されています。どちらも5秒の捕捉間隔で、赤の1つの好中球が再び赤で転がり、緑の血小板血栓に付着していることが示されています。矢印はローリングと付着性の好中球を識別し、太い灰色の矢印は血流の方向を示します。ここでは、血小板の積分蛍光シグナルの中央値を時間の関数としてプロットします。

ローリング好中球と付着好中球の数は、20分間でそれぞれ21.5細胞と1.6細胞であると決定されました。好中球の最初の急速な転がりは、内皮細胞上で起こりました。好中球が血小板血栓に接触すると、血小板血栓上の好中球の転がり速度は毎秒8.2マイクロメートルの範囲で変化し、ペクチンとpsgl L oneの相互作用によって媒介されます。

データは、レーザー損傷の5分後に7つの野生型マウスにおける14の異なる血栓の平均の標準誤差である平均プラスまたはマイナスを表しています。イメージング中、血小板血栓のサイズは比較的一定に保たれ、好中球は血栓に転がり、血栓に付着します。循環血小板からの蛍光シグナルはごくわずかです。

血小板血栓と比較すると、このビデオを見た後、生きたマウスで生体内顕微鏡システムを設定する方法を十分に理解でき、微小血管系内の活性化内皮上の血小板と好中球との間のヘテロ典型的な相互作用をリアルタイムで視覚化できるようになります。