Name: 神経変性表現型を評価するショウジョウバエクライミングアッセイによりドーパミン作動性ニューロンと脳全体の免疫染色 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 学ぶ ショウジョウバエのクライミングアッセイとチロシンヒドロキシラーゼ免疫染色を用いたドーパミン作動性ニューロンの神経変性評価法。加齢に伴う運動機能とニューロン数の変化を定量的に解析し、神経変性疾患のメカニズム解明に貢献します。

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我々は有用な議論のための技術支援とGerasimos P. Sykiotisためクリスティンソマーズ、フライ銘柄に対してレオPallanckに感謝します。この作品は、MCBにNIH訓練助成T32CA009363によって賄われていた

1。驚愕誘発される負の走地性アッセイ<ol><li>希望の遺伝子型のハエを選択し、それらは、20〜30の動物のコホート内のグループにランダムに、性によって、それらを分離し、2〜3日ごとに新しい食品バイアルにそれらを反転;テストハエの各セット（ つまり、年齢をマッチさせたコホート、1コホート/遺伝子型）は、少なくとも週に一回。 </li><li>負の走地性試験前の30分には、CO 2でハエを麻酔し、2つの空の食品バイアル（ 材料表を参照）（チャンバー寸法明確なテープとの開口部で結合で作られた前標識透明なプラスチックチューブにそれらを配置さ：19センチメートル×2.85センチメートル）。我々のアッセイでは、一般的に25ハエ/真空管を使用しています。 注意してください。回復時間を麻酔からは、数分から数時間まで変えることができる（ 例えば、O / N）および試験特定の遺伝子のために最適化されるべきである。 </li><li>垂直surfacの上に吸い取り紙やテープ紙に高さが異なる。（1 - 20件目をCMから）マーク電子、ベンチに垂直。 </li><li>紙の前にチューブを置きますチューブはすべて整列さと限り正確高さ測定を可能にするために紙にできるだけ近くにする必要があります。 </li><li>チューブの前に（ &quot;特別装備&quot;の表を参照）は、デジタルカメラを置き、紙20〜30センチメートルの距離で、スタンド（ピペットチップボックスなど ）に、 &quot;映画&quot;オプションを選択して開始録音が、この時点で、あなたはまた、連続した試験の間の時間を追跡するためにタイマーを開始する必要があります。 </li><li>ハエは数秒（ 例えば 10秒）のためにチューブをタップしてチューブの底に集めることができます。このステップは、実験全体を通して（ つまり 、同じ時間、同じ強さ、同じ演算子）一貫して実行する必要があります。 </li><li> 10秒のためのデジタルカメラでハエの動きを記録します。 </li><li> 1分間隔で、ステップ1.5から1.7まで14回繰り返します。 </li><li>データを分析する： <ol type="a"><li>を超えているハエの数を数える撮影した動画の目視検査により、10秒後、2センチマーク。 注：私達のアッセイ条件でハエ&#39;負の走地性の動作は驚くべき後の最初の10秒を超えて続かなかった（ つまり、ハエは、それらの後に驚くべきすべての方向に10秒を動かし始めた）。最小距離2 cmであったこの時間ウィンドウ内の制御ハエ（THGal4ドライバを表現すなわち 1週齢のハエ、 図1の凡例を参照）となりました。したがって、私たちは行動を開始した後、異なる年齢や遺伝子型10秒のハエの登山活動を分析するための基準として2センチメートルマークを使用していました。これらのパラメータは、（異なる遺伝的背景や実験条件に例えばのため）テストハエの動作の違いを説明するために調整が必要な場合があります。我々のアッセイ条件では、すべての遺伝子型が悪く行ったり、同様に制御遺伝子型のハエにテストされていることに注意してください。 </li><li> 15からの結果の平均を取る試験。 </li><li>チューブ内のハエの総数（=％が活動を登る）の割合としてエクスプレス平均、繰り返し数（N）は、各遺伝子型についてテスト独立コホートの数で与えられる</li><li>時間の経過とともに異なる遺伝子型間の統計的有意性を評価する。これは、スチューデントのt検定 （2遺伝子型を比較する場合）、またはそのようなグラフパッド（グラフパッドソフトウェア、Inc.Laホヤなどの商用ソフトを使ってボンフェローニ事後検定（多重比較を行うとき）に続いて2ウェイANOVA分析を行うことができますCA、USA）。 </li></ol></li></ol> 注意 私たちは、室温で、同じ光条件下で、一日の同じ時刻にすべての私たちのアッセイを行う。 12時間の明/暗サイクル環境でハエを保つことはハエ &#39;歩行行動に概日リズムの影響を制御することをお勧めします。 2。チロシン水酸化酵素の免疫全脳マウントの検定ソリューションおよびバッファ固定液：リン酸4％パラホルムアルデヒド（PFA）は、緩衝生理食塩水（PBS） 洗浄バッファー：0.1％トリトンX-100 PBS中ブロッキング緩衝液：0.1 Mトリス-HCl、pH7.5で、0.15MのNaCl、0.1％トリトンX-100、0.5％BSA マウントメディア：MOWIOL-ダブコ（ハーロウE、レーンD.、抗体 - 実験室マニュアル、コールド·スプリング·ハーバー研究所プレス、コールド·スプリング·ハーバー、NY、アメリカ、10:418（1988で説明されたプロトコルを参照）） 手順<ol><li>キューティクルワックスを除去するため、約1分間、70％EtOHでいっぱい解剖皿にハエを入れて。 </li><li>転送は氷冷PBSでいっぱい別の解剖皿に飛ぶ。 </li><li>脳を解剖： <ol type="a"><li> （：削除翼と脚オプション）腹側を上にしてフライを置きます。 </li><li>離れて身体から頭を引っ張っ：鉗子への1セットを使用身体と脳の損傷を防ぐために、目の下キューティクルを保持するために別のものにしがみつく</li><li>口先を取り外します。 </li><li>スリットの反対側に頭のキューティクルにしがみつく口吻を除去した後、開いたままにし、脳が頭部カプセルから削除されるまで反対方向に引っ張る。 </li><li>脳からすべてのキューティクルを削除します。 </li><li>すべての空気で満たされた気管組織を除去するが、これは次のインキュベーションステップ中に浮遊するから脳を防ぐことができます。 </li></ol></li><li> P-200ピペットチップの先端から数ミリをカットし、0.1％トリトンX-100/PBSソリューションとそれを平衡</li><li>準備されたP-200ピペットチップを使用して、4％PFA / PBSを0.5mlで満たさ0.5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに脳を転送し、解剖が完了するまで氷上に保つ。 </li><li> 20分間室温で頭脳を修正：ラックにエッペンドルフチュー​​ブを入れてnutatorにラックを配置することによって、穏やかに回転を適用します。 </li><li>固定液を削除P-1000マイクロピペットを用いて、0.1％トリトンX-100/PBS 0.5 mlを加える反転によってミックスと1分間インキュベートさせ、一度この洗浄工程を繰り返します。 </li><li>第二の洗浄からバッファを削除し、0.1％トリトンX-100/PBSを0.5mlを加え、20分間室温でインキュベートしてみましょう、このステップを二回繰り返す。 </li><li>洗浄緩衝液を取り出し、脳はRTで1時間（0.1Mトリス-HCl、pH7.5で、0.15MのNaCl、0.1％トリトンX-100、0.5％BSA）ブロッキングバッファーでインキュベートすることができます。 </li><li> 4で、二日間、ブロッキング溶液に抗TH抗体の1:100希釈（ &quot;特定の試薬の表&quot;を参照）で脳をインキュベート穏やかに回転し（ステップ2.6を参照してください。）とC、。 </li><li>洗浄手順2.7を繰り返します。と2.8 .. </li><li>穏やかな回転と、4℃で、二日間、二次antibodyinブロッキング溶液の1:200希釈で脳を平衡化します。 </li><li>洗浄手順2.7を繰り返します。と2.8 .. </li><li> 図2Aに示すように、マウントスライドを準備します。 <ol type="a"><li> ADD 2カバーガラス（24×60ミリメートル、ない。1.5）への取り付け、メディアのX25μlの滴。 </li><li>スライドの真ん中に隙間を残して取り付けメディアの上に置いて2つのカバーガラス（サイズ18×18ミリメートル、ない。2）、乾燥させます。 </li></ol> 注意してください。あなたの共焦点顕微鏡のステージ上にサンプルホルダーを確認してください。あなたは、カバーガラスの端部の一方（マニキュアやテープを使用）に22×22ミリメートル1.5カバーガラスを取り付けることにより25×75ミリメートルスライドの同じ大きさにすることができます。 </li><li>洗浄バッファーを外し、マウントメディアを50μlを加え、脳が上下にピペッティングすることにより、それに平衡化することができます。 </li><li>カットP-200ピペットチップ（ステップ2.4​​を参照）2カバーガラスの間の空間にスライドに脳を転送しないカバースリップでそれらをカバーを使用した。 1.5（ 図2Aを参照してください。向きにスライド上の脳は7を参照）。 注：サンプルは、前方および局留め両方の視覚化を可能にする2つのカバーガラスとの間に取り付けられている脳のrior側。 </li><li>マウントメディアとカバーガラスの間に空間全体を埋め、すべての空気を除去するための一つの角からピペット;マニキュアを乾燥したシールができます。 </li><li>共焦点顕微鏡を用いて1.0μmのステップサイズ（ ショウジョウバエ成体脳内のドーパミン作動性クラスターの解剖識別のための7を参照）、z軸に沿って光のセクションのシリーズを取得し、特定のクラスタ内のドーパミン作動性ニューロンの数を評価する。 </li></ol>

<ol><li>Bayersdorfer, F., Voigt, A., Schneuwly,, Botella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine-dependent+neurodegeneration+in+Drosophila+models+of+familial+and+sporadic+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Dopamine-dependent neurodegeneration in Drosophila models of familial and sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiol. Dis. 40, 113-119 (2010).</li>
<li>Feany, M. B., Bender, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Nature. 404, 394-398 (2000).</li>
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<li>Whitworth, A. J., Wes, P. D., Pallanck, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+pioneer+a+new+approach+to+drug+discovery+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Drosophila models pioneer a new approach to drug discovery for Parkinson's disease.</a> Drug Discov. Today. 11, 119-126 (2006).</li>
<li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat. Protoc. 1, 2110-2115 (2006).</li>
<li>Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+activation+of+Nrf2+signaling+is+sufficient+to+ameliorate+neurodegenerative+phenotypes+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Dis. Model Mech. 4 (5), 701-707 (2011).</li>
</ol>

我々は我々は競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

アッセイは、経路または異なる疾患連動型遺伝的背景（5件）で同様に高齢化でDAニューロンの維持に小さな化合シグナリング、特定の遺伝子の役割を研究するための有用なアプローチを提供し、ここで説明。 ショウジョウバエの驚愕誘発される負の走地性の動作が広く、特にPD連動型変異の存在下で異なる遺伝的背景におけるDAニューロンの機能のための読み出し機能として使用されてきた。異なる研究間でいくつかの不一致は（より詳細な議論のために12を参照）が観察されている。これらは、各チューブでテストハエ数（ハエ&#39;コホート対シングルフライ）を含むさまざまなアッセイセットアップ条件、に少なくとも部分的にCO 2媒介麻酔と連続した数の後の回復の時間が起因している臨床試験（ジの例として4と11を参照fferentアッセイセットアップ）。したがって、このようなパラメータをコントロールすることをお勧めし、必要であれば特定のアッセイの要件のためにそれらを最適化することが...

ここに記載されるアッセイの特異性は、ドーパミン作動性ニューロン3における特異的発現を達成するために、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子の調節配列を利用したGal4フライラインの使用に依存している。チロシンヒドロキシラーゼは、ドーパミン合成の最初と律速段階を触媒する。ドーパミンのそれと成人のハエの脳の重なりでTH免疫反応性は、（実施例6を参照）、in vivoで DAニューロンを同定するために良い候補TH作る。また、THGal4の発現パターンは、ドーパ脱炭酸酵素遺伝子から調節配列が含まれており、DAニューロンだけでなく、トランスジェニック発現を駆動するようDdcGal4など他Gal4のラインのそれよりもより具体的であるだけでなく、3グリア細胞のセロトニン作動性ニューロンのサブセットで。 Feanyとベンダー（2000）最初のPD-リンクヒトα-シヌクレイン遺伝子の汎神経表現は、STAの漸進的損失を加速することが観察さショウジョウバエのRTLE誘発性陰性走地性の動作が。我々はexpressionofα-シヌクレイン導入遺伝子10を駆動するためにDA-ニューロン特異THGal4ラインを使用して同様の結果を観察し、この中でNrf2の経路の神経保護の役割を研究するために、この機能の読み出しに使用されているPD 14のショウジョウバエモデル。ここで説明する特定のアッセイは、2および3から適合される。 ショウジョウバエの脳は、共焦点顕微鏡で脳全体のマウントに可視化することができる、少なくとも5つの異なるクラスタ（PPL1、PPL2、PAL、PPM1 / 2、PPM3）（実施例11と7を参照）に配置された100以上のDAニューロンが含まれています。それは11、9歳とショウジョウバエ脳の下落でDAニューロンの数かどうかはまだ議論の余地があるが、年齢依存性神経変性は、PD-リンクされた遺伝子がヒトの疾患をモデル化するために変異/過剰発現されたハエで観察される5。 DAのニューロンにおけるヒトα-シヌクレインの発現は、そのような効果を有し、したがって、PDのモデルとして用いられている。ここでは、DAニューロンが細胞マーカーとしてTHを使用してマウントし、脳全体でカウントするためのアッセイを記述します。このアッセイは、13と10から適応されています。

<table><tbody><tr><td>Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody</td><td>Millipore</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-026-152</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma</td><td>D2522</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">機器</td></tr><tr><td>ポリスチレンバイアル</td><td>VWR</td><td>89092-734</td><td>28.5 x 95 mm</td></tr><tr><td>デジタルカメラ</td><td>Canon</td><td>PowerShot A3100IS (モデル)</td><td>12.1メガピクセル 4Xオプティカルズーム</td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ no. 1.5</td><td>VWR</td><td>48366 205 48393 252</td><td>サイズ: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm</td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ no. 2</td><td>VWR</td><td>48368-040</td><td>サイズ: 18 x 18 mm</td></tr><tr><td>解剖用皿</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70543-01</td><td>サイズ: 30 mm O.D.</td></tr><tr><td>Dumostar No. 5 ピンセット</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72705-01</td><td></td></tr><tr><td>ステレオ顕微鏡</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000 (モデル)</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Leica</td><td>SP2 または SP5 (モデル)</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">材料表.</td></tr></tbody></table>

神経変性表現型を評価する<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;クライミングアッセイによりドーパミン作動性ニューロンと脳全体の免疫染色

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

キイロショウジョウバエは、神経系の老化と病的変性過程を研究するための貴重なモデル生物である。実験系としてのハエの利点はその遺伝扱いやす、短寿命と複雑な行動を観察し、定量的に分析するための可能性を含む。 ショウジョウバエの脳の特定の神経集団における疾患にリンクされた遺伝子の発現は、例えば、パーキンソン病およびアルツハイマー5、ヒト神経変性疾患をモデル化するために使用することができる。 ドーパミン作動性（DA）ニューロンは、高齢化、人間の脳の中で最も脆弱な神経細胞集団の一つである。パーキンソン病では（PD）、最も一般的な神経変性運動障害は、DAニューロンの加速された損失は運動機能が徐々にかつ不可逆的な衰退につながる。年齢および環境毒素への曝露に加えて、DAニューロンの損失を符号化における特定の突然変異によって悪化するいくつかの遺伝子のまたはプロモーター領域。そのようなPD関連対立遺伝子の同定は、in vivoでの DAニューロンの神経変性を研究するためのモデルとしてのショウジョウバエの使用のための実験的な基礎を提供しています。例えば、 ショウジョウバエ DAニューロンの反復するヒトの疾患のいくつかの機能、DAニューロンの例えば進行性消失と減少し運動機能2におけるPD-リンクヒトα-シヌクレイン遺伝子の発現。したがって、このモデルは正常PD 20.32潜在的な治療標的を同定するために使用されている。 ここでは、一般的にショウジョウバエのDAニューロンの年齢依存性神経変性を研究するために使用されている2つのアッセイを説明：大人になって脳の驚愕誘発される負の走地性応答およびチロシン水酸化酵素の免疫染色に基づいて登山 ​​アッセイは、DAニューロンの数を監視するためにマウント異なる年齢で。どちらの場合も、UAS、tのインビボ発現具体的にはDAのニューロンにおけるransgenesは、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）プロモーター-Gal4のドライバ線3、10を使用することによって達成することができる。

我々は、PD 14のショウジョウバエモデルにおけるストレス保護Nrf2の経路の役割を研究するためにここに記載のアッセイを使用している。このモデルは、TH Gal4のドライバ2,10を用いてDAのニューロンにおけるヒトα-シヌクレイン遺伝子の発現に依存する。 図1は TH Gal4のドライバの制御下に別の導入遺伝子を発現しているオスのハエに驚愕誘発性の負の走地性（クライミング）アッセイの代表的な結果を示している。すべての遺伝子型は、時間の経過とともに自発運動の低下を示すテストしたが、PD-リンク表現、ヒトα-シヌクレイン導入遺伝子は、年齢をマッチさせた対照ハエ（単独のTH Gal4のドライバ）に対して加速衰退を示すか、または共発現飛ぶ飛ぶNrf2のDNA結合パートナーMafを-S。同様の結果は、雌ハエで観察された。 図2は TH免疫蛍光ベースのDAのための代表的結果を示しニューロン数。図の凡例に記...

ここでは、ドーパミン作動性に（DA）ニューロンの年齢依存性神経変性を研究するために設立されている2つのアッセイを記述する<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;：登山/ DAニューロンの変性と脳全体のマウントのDAニューロンを特定し、カウントするために使用されているチロシン水酸化酵素の免疫の機能的効果を研究することができます驚愕誘発性の負の走地性アッセイ。

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

この手順の全体的な目的は、トランスジェニックショウジョウバエのドーパミン作動性ニューロンの神経変性を評価することです。これは、まずGAL four UASシステムを介してチロシンヒドロキシラーゼプロモーター制御下で目的のトランスジェーンを発現させることで達成されます。手順の2番目のステップは、目的の遺伝子型のショウジョウバエを収集し、性別によって分離し、年齢を重ねることです。3番目のステップは、年齢とともにネガティブジオ軸による飛翔活動をテストすることです。最終ステップは、異なる年齢で収集した解剖された脳からドーパミン作動性ニューロンの数を数えることです。最終的には、動物の運動行動とドーパミン作動性ニューロン集団のサイズの変化が示されます。このアプローチの意味は、パーキンソン病などの神経変性疾患の治療にまで及びます。このアプローチは、神経保護遺伝子と薬理学的介入を特定するのに役立ちます。アッセイをセットアップするには、目的の遺伝子型の年齢が一致したショウジョウバエを選択します。性別によって分離し、ランダムに20から30匹の群れにグループ化します。各群れは統計サンプルを表します。運動行動における概日リズムの効果を制御するために、12時間の光暗サイクルで群れを維持し、テスト室で再現可能な温度で保持します。2から3日ごとに群れの容器を交換し、一貫した時間で毎週テストします。テストの30分前に、各群れを二酸化炭素で麻酔し、テープで接続された空の食品容器で作られたラベル付きのプラスチックチューブに移します。5から10分後にショウジョウバエは目覚めるはずですが、麻酔からの完全な回復は年齢と遺伝子型によって異なり、最適化する必要あります。今、テスト容器の後ろに見えるように高さのスケールを作成します。白い紙に1から20センチメートルの距離をマークします。次に、スケールを位置に固定します。今、約20から30センチメートル離れた位置で、テストするチューブをスケールに対してアライメントします。デジタルカメラを、バイアルの正方形ビューで位置決めします。チューブのラベルとスケールがはっきりと見えるようにします。位置決めしたら、録画を開始し、デジタルタイマーを開始します。今、数秒間チューブをタップします。すべてのショウジョウバエがチューブの底に集まるはずです。この手順を全体の実験を通して同じ時間と力で一貫して行うことを確認してください。1分後、15の連続した試行の2番目の試行のために再びノックダウンを繰り返します。15回の試行がすべて完了したら、映画を視覚的に検査して、新しい容器にショウジョウバエを返します。各群れで実行される15回の試行ごとに、2センチメートルマークの上にいるショウジョウバエの数を数えます。10秒経過した後、2センチメートルマークは経験的に決定されます。これは、テストされている多くの年齢で、10秒後にすべての制御が渡った距離です。15回の試行からの平均スコアを取り、群れメンバーがマークを渡した割合として表現します。統計的反復の数は、各グループでテストされた群れの数に等しく、15回の試行ではありません。異なる遺伝子型間の統計的有意性を、学生のT検定、anova、またはその他の適切な分析方法を使用して評価します。ショウジョウバエを70％エタノールの解剖皿に約1分間入れます。表皮ワックスを除去します。次に、氷冷PBSで満たされた別の解剖皿にショウジョウバエを移動し、脳の解剖に進みます。腹面を上に向け、必要に応じて翼と脚を取り除きます。1組のはさみで体を持ち、もう1組のはさみで目の下の表皮を持ちます。次に、頭を体から引き離します。次に、頭から口器を取り除きます。次に、新しい穴の反対側の表皮をつかみ、反対方向に引っ張って頭の殻から脳を取り除きます。今、脳表面から残りの表皮を慎重に取り除きます。次に、すべての気体で満たされた気管組織を取り除きます。これにより、次のインキュベーションステップ中に脳が浮かぶのを防ぎます。P 200ピペットチップから脳処理ピペットを準備します。数ミリメートルを切り取り、PBS中の0.1％トリトンX 100で平衡させます。脳をPBS中の4％PFAで完全に満たされた0.5ミリリットルチューブに移します。室温で20分間、ゆっくりと回転させながら脳を固定します。20分後、P 1000ピペットを使用して、固定液を0.1％トリトンX 100を含むPBSの洗浄バッファーの0.5ミリリットルに置き換えます。混合して、洗浄バッファーを交換する前に1分間脳をインキュベートさせます。1分後、洗浄バッファーを2回目に入れ替え、室温で20分間脳をインキュベートします。次に、洗浄バッファーを3回目に入れ替え、脳をさらに20分間インキュベートします。今、洗浄バッファーを取り除き、室温で1時間、0.5ミリリットルのブロッキングバッファーで脳をインキュベートさせます。1時間後、ブロッキング溶液に抗体を1から100の希釈で加えます。4度セルシウスで2日間、ゆっくりと回転させながらインキュベートさせます。ブロックを取り除くには、固定を取り除くために使用した洗浄を繰り返します。次に、4度セルシウスで2日間、ゆっくりと回転させながら、ブロッキング溶液の1から200の希釈の二次抗体で脳を平衡させます。数日後、同じ洗浄手順を使用して二次抗体を取り除きます。マウンティングスライドを準備するには、カバーガラスにマウンティングメディアの2から25マイクロリットルのドロップを2つ加えます。マウンティングメディアの上に2つのカバーガラスを置き、中央に隙間を残します。スライドを乾燥させます。マウンティングスライドの幅が共焦点顕微鏡のステージに適合しない場合は、ネイルポリッシュを使用して、適切に適合する22x22ミリメートルのカバースリップをスライドに接着します。今、脳が入っている溶液をマウンティングメディアの50マイクロリットルで置き換えます。切ったP 200チップを用いて、マウンティングメディアで脳を平衡させます。次に、切ったP 200チップを使用して、脳をトレンチに移動させます。マウンティングスライドでは、脳を前面または後面側を向くように配置します。次に、1.5の番号のカバースリップで覆い、1つの角から、カバーガラス間のスペースをマウンティングメディアで満たして、すべての空気を除去します。スライドを乾燥させ、検査前にネイルポリッシュでシールします。ヒトアルファシヌクレインは、クライミングアッセイのTH GAL fourドライバーを使用してDAニューロンで発現しました。このトランスジェーンを発現するオスは、年齢が一致した対照群と比較して、NRF 2D NA結合パートナーを共発現するショウジョウバエとして加速

assessing-neurodegenerative-phenotypes-drosophila-dopaminergic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

測定運動機能、学習、およびメモリ能力のための行動アッセイ...

でアッセイする運動、学習、記憶障害ショウジョウバエ</em神経変性の>モデル

このビデオでは、ハエの移動を定量化する簡単な方法と、実施されたクライミングアッセイを示しています。フライクライミングアッセイは、ジオタクシスの負の反応に依存する運動機能の一般的なテストです。...

フライクライミングアッセイ:Drosophila melanogasterの一般的な移動をテストする方法

私たちは、神経変性疾患のモデルとして、Drosophila...

神経変性疾患のショウジョウバエモデルにおけるクライミング欠陥の定量分析

ショウジョウバエは広く神経変性を研究するためのモデル系として使用されます。このプロトコルは、脳内の空胞の形成によって決定されるように、定量化可能な変性方法を記載しています。それはまた、一つのサンプルとして処理し、切片化対照および実験ハエによる実験手順に影響を最小限に抑えることができます。...

に神経変性を定量化するために、マス組織学<em&gt;ショウジョウバエ</em

このプロトコルは、郭清と大人のショウジョウバエの染色について説明します脳の組織。具体的には、このプロトコルでは、神経の開発の多くの側面の基礎となる原則を明らかに正確に使用することができます例の神経細胞サブセットとしてショウジョウバエのきのこ体と光受容ニューロンの使用を強調表示します。...

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

このステップ バイ ステップのプロトコルは、ハエの数百をホストし、電気モーターで彼らの行動を同期自動マルチ シリンダー システムを用いたショウジョウバエ負の走動作を分析します。試金飛ぶ負走動作同期、デジタル記録および自己設計されていた RflyDetection...

神経変性のショウジョウバエモデル アダルト登山行動を分析するための自動化された迅速な反復負走アッセイ

蛋白質の集合とのショウジョウバエモデルの中枢神経系におけるオートファジーのフラックスの蛍光イメージングによる細胞生物学的研究から定量的なデータを抽出する単純なと適応のワークフローを開発しました。神経変性疾患。...

ImageJ を用いた蛍光タグ付きタンパク質の公平な分析によるショウジョウバエの神経変性の定量細胞生物学

我々は、ショウジョウバエメラノガスターで神経変性を示す変異体のスクリーニングに前方遺伝的アプローチを用いてプロトコルを提示する。登山アッセイ、血管解析、遺伝子マッピング、DNAシーケンシングを組み込み、最終的に神経保護のプロセスに関連する新しい遺伝子を同定します。...

ショウジョウバエメラノガスターの新しい神経保護遺伝子を同定する生体内前方遺伝スクリーン

この研究では、斬首、固定、凍結切片、蛍光染色、免疫染色、およびイメージングを含む組織処理の簡略化されたプロトコルを提示します。これらは共焦点および多光子イメージングに拡張できます。この方法は、複雑な解剖に匹敵する有効性を維持し、高度な運動能力の必要性を回避します。定量的な画像分析は、広範な調査の可能性を提供します。...

脳蛍光染色および免疫染色を強化するための ショウジョウバエ 頭部の直接凍結切片

このプロトコルは、従来の哺乳類モデルに代わるものとして、自発運動機能障害の定量化を通じてショウジョウバエの神経毒性を評価するためのハイスループットで費用対効果の高い方法を提供します。これは、高感度で再現性があり、倫理的に有利なモデルを使用して、医薬品化合物、環境剤、または遺伝子組み換えの神経毒性効果を評価することを目的としています。...

神経毒性のリードアウトとしての Drosophila melanogaster の自発運動機能障害の行動解析

学ぶ ショウジョウバエのクライミングアッセイとチロシンヒドロキシラーゼ免疫染色を用いたドーパミン作動性ニューロンの神経変性評価法。加齢に伴う運動機能とニューロン数の変化を定量的に解析し、神経変性疾患のメカニズム解明に貢献します。

神経変性表現型を評価する

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