Name: 齧歯気道上皮における繊毛の運動性の高分解能イメージングのためのex vivo法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 学ぶマウス気管上皮の繊毛運動と流動の高分解能イメージング法。高速ビデオ顕微鏡と蛍光ビーズ追跡により、繊毛拍動頻度と波形を定量的に解析し、粘液繊毛クリアランス機構を研究する。

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プロジェクトは、国立心臓、肺、血液研究所NIH助成U01HL098180によってサポートされていました。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立心臓、肺、血液研究所や国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません

1。試薬のセットアップ 1.1解剖とイメージング媒体リーボビッツのL-15培地（L15）は、FBS（10％）およびペニシリン - ストレプトマイシン（100単位/ mlのペニシリンGナトリウムと硫酸ストレプトマイシン100μgの/ ml）を補足される気管試料の収穫と撮像時の両方で使用されている。 2。浅い城壁文化チャンバアセンブリ気管組織を保持するために使用される室は、 図1に示されている。室の床は35ミリ培養皿の底ガラスである。チャンバーの上面と側面をガラス皿の上に厚さ0.3mmのシリコーンシートの小片を配置することによって生成される。シートの縁部を丸底ディッシュに合わせてカットされ、中心がさらに（ステップ2.1〜2.3を参照）浅い中央チャンバを形成するようにトリミングされる。このアセンブリの上に18mmの円形のガラスカバースリップを撮像するのに適した密閉チャンバを生成するように配置されている。 <ol><li>完全に0.3ミリメートルの厚さのシリコーンシートの二乗は18ミリメートルラウンドガラスカバースリップをカバーしています。 </li><li>標準鋭い解剖ハサミでカバースリップ（シリコーンシートの円形の層になる）のエッジの周りから余分なシリコーンシートを切り落とす。 </li><li>鋭いメスを切り出し、覆われたカバースリップ（したがってイメージングチャンバーの上部と側面を形成する）の中間からシリコーンシート（約10mm角）の中央広場を取り除くと。 </li></ol> 3。気管ハーベストと準備<ol><li>ローカル機関動物のケアと使用委員会および/または政府のガイドラインに従ってマウスを安楽死させるとまで十分L15メディア水没組織（著者は妊娠の日16.5でちょうど出産前にマウスを使用している、へと標準的なプラスチック35ミリ培養皿に気管を削除、生まれたばかりの新生児、および成体動物2）。 </li><li>の外側に取り付け、非気管関連組織を除去鈍的切開を用いた気管。 </li><li>ただミクロ解剖ハサミ（ 図2A、1行目）を使用して、輪状軟骨下横カットで喉頭を削除します。 </li><li>ミクロ解剖はさみ（ 図2A、2行目）を使用して、ただカリーナ上記横カットで左右の主気管支の分岐を削除します。 </li><li>優しく細かい鉗子で気管を保持し、任意の粘液や血液をクリアするためにP1000とP1000ピペットマンチップ付き入浴L15培地〜1mlでルーメン2〜3回洗い流す。 </li><li>ミクロ解剖はさみ（ 図2B、1行目）と横方向のカットを使用した気管の3-4リングセグメントを切り取る。 </li><li>ミクロ解剖はさみ（ 図2B、2行目）を使用して、この短い気管セグメントの気管筋の中央を縦にカットします。 </li><li>ミクロ解剖はさみ（ 図2Cを使用して気管軟骨輪の中央を縦にカット</stroイメージングに適した気管組織の2つのセクション（つのセクションは、 図2（d）に示すように）残しNG&gt;、線）。 </li></ol> 4。繊毛イメージング<ol><li>転送気管組織セグメント、L-15培地100-200μLで35ミリのガラス底培養皿の真ん中の上にダウンルーメン側、。 </li><li>繊毛生成されたフローを定量化するには、気管の組織試料（〜1×10 11個/ ml以下Fluoresbrite 2.5％水溶液の微小球懸濁液を20μL/ ml）を入浴L-15培地に蛍光0.20μmの微小球の少量を追加します。 </li><li>シリコーンシートにカットウィンドウによって形成された壁に囲まれた浅い室の真ん中に位置気管サンプルと、イメージングチャンバーダウン気管サンプルシリコーンシート側の上部に（上記1〜3の手順を参照してください）先に調製を置きます（ 図1 ）。 </li><li>ゆっくりと所定の位置に固定するためにカバースリップを押し下げとエッジのボイジャーから余分なL-15メディアを取り出すGA P1000チップとピペットマンP1000。 </li><li> 100X客観的かつDIC光学系と倒立顕微鏡で35ミリのガラス底培養皿と気管サンプルをマウントします。 </li><li>気管筋の丸まっエッジ（：記録された映画の例では、静止画図2Dアウトラインボックス、E）の繊毛気管上皮に沿って毎秒+フレームは200で繊毛運動の映画を集め高速度カメラやムービー取得ソフトウェアを使用（ 補足ムービー1）。 </li><li> FITC落射蛍光イメージングと低照度CCDカメラ（上記の機器リストを参照）を使用して、繊毛生成フロー（ 補足作品2）の後の定量化を可能にするために気管繊毛上皮の表面を横切って蛍光ミクロス運動の映画を収集します。 </li></ol> 5。繊毛の運動の定量<ol><li> ImageJのソフトウェアパッケージにDIC画像化された映画をロードし、Iで説明する手法を以下AINドラモンド13鼓動繊毛を横断ラスタラインを描画するラインツールを使用します。このラインの &quot;再スライスは&quot;行に亘る繊毛運動が波形パターンを生成カイモグラフ型画像を生成する。分あたりのビート（ すなわちヘルツ）の数は、次に計算することができ、そこから、各波のピークの間のピクセル数、彼らが測定されます（1ピクセル= 1つのムービーフレーム）。 </li><li> ImageJのソフトウェアパッケージに繊毛、生成されたフロー負荷蛍光ビーズ映画を測定し、手動で気管上皮の表面を横切って蛍光ビーズを追跡し、ソフトウェアを追跡各ビーズのためのビーズの速度と方向性を生成させるMTrackJプラグ14を使用します。 </li></ol>破っ繊毛からの距離として流れを定量化するために強く測定流量振幅に影響を与えることができる蛍光ビーズを使用している場合は注意が必要です。補足ムービー2でビーズの動きはこの良い例です。この例では、ビーズ動きが鼓動繊毛の表面に高速で、かなり遠く入浴メディアでビーズのためにオフに低下します。これを制御するには、ビーズトレーシングは、唯一の正しい比較を行うことができるように、すべてのサンプルで繊毛上皮上の固定された距離で収集されるべきである。最終的に、流体の流れに代表的なデータを得るために、ビーズをできるだけ長く追跡されるべきであり、我々は、流体の流れを算出するビード10を覆うトラック+繊毛細胞を使用することを好む。

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

繊毛のビート周波数（CBF）の測定は、高電力顕微鏡対物レンズと高速画像集録ハードウェア13,15を使用して比較的容易であり、かつCBF測定は健康と病気の間に粘液線毛クリアランスを調査するほとんどの研究の基礎を形成する理由を説明します。しかし、測定するのがより困難であり、どちらも毛様体、生成されたフローと繊毛ビート波形の両方の基礎と重要性を、無視CBF測定だけでは、粘液線毛クリアランスを理解するためのCBFの測定が不可欠であるが、しばしば無視され、CBFと相関しないことがあります。 CBFが増加繊毛生成流れに対応していない可能性が増加した方法の例は、DNAH11変異を有する患者の一部に見られる。 DNAH11は軸糸ダイニン重鎖タンパク質、粘膜毛様体クリアランス16との問題を引き起こすことが予想される多動（速い）繊毛ビート異常繊毛ビート波形の両方を引き起こすことが報告されているの変異である。 significa我々のプロトコルのNTの利点は、それが表面全体に繊毛ビート形状と繊毛生成流体の流れの高分解能イメージングに最適である繊毛のプロファイルビューを可能にし、繊毛ビート方向に対して直角に繊毛を簡単...

気道上皮における運動性繊毛機能の分析は、粘液線毛クリアランスと肺の健康1に影響を与えることができる遺伝的要因と環境要因を解明するための実験が重要である。イメージングのために開発されたシンプルなプロトコルマウス気道上皮は、変異とノックアウトマウスモデルで気道繊毛運動を尋問するために効率的な方法を提供し、マウス気管組織切開と高解像度ビデオ顕微鏡による気道繊毛運動のex vivoでのイメージングだけで基本的なスキルを必要とする。このプロトコルはheterotaxy 2-5関連付けられた先天性心疾患を持つ変異体では運動性繊毛機能の迅速な評価（繊毛ビート周波数、繊毛ビート形状、繊毛生成されたフロー）を可能にするために大規模マウス突然変異誘発画面中に確立され、洗練された。 気道繊毛運動性を研究するために使用される現在の技術は、急性エクスビボ型またはイオンのいずれかに分類することができ試験管内実験的アプローチでゲル用語。急性実験は人間の鼻/気道ブラシ生検6,7とシンプルな横気道セクション8の分析のex vivoでの可視化が含まれています。 インビトロのアプローチは、空気液界面培養物または気道の懸濁培養物9-11と同様に分化繊毛上皮のシートを生成するために、様々な細胞培養技術を利用する。任意の使用可能な繊毛上皮細胞が実験（4-6週9,10）のために制作される前に、しかし、これらの気道上皮reciliation技術は時間と訓練に非常に多額の投資を必要とする。気道上皮ブラシ生検の急性ex vivoでの分析は、一般的にヒト臨床試験に使用されているが、この方法は、機械的な悪化組織傷害12によるマウスの研究において使用できない。 覚書の分析のために、このプロトコルで概説技術電子気管気道上皮は、実行するだけで簡単ではありませんが、それは特別な解剖のスキルも、ビデオ顕微鏡による撮影のためにそれらの標準以外の任意の特殊な機器を必要としません。この単純なプロトコルには多くの利点がある。マウス気管組織の収穫は、実行するために迅速かつ簡単であるように、まず、それはマウスの大規模な数の気道繊毛機能の迅速な評価が可能になります。これは、in vitroでの治療で別の短期的な影響の急性分析を含めることができます。第二に、ex vivoでの技術であること、繊毛気道上皮は、それがサポートしている組織を根底に接続されたまま、したがって、関連する細胞シグナル伝達経路を保持します。従って、 インビトロ reciliated気道上皮内と比較して、この製剤は、 生体組織環境における自然のより良い表現である。第三に、このプロトコルは繊毛運動fの客観的な評価を与えることができる種々の定量的なパラメータの数の取得を可能にする慰め。最終的に、気道繊毛の可視化のための他の現行の方法とは対照的に、このプロトコルは、繊毛ビートと異時波発生の高分解能イメージングのための最適な繊毛のプロファイルビューを可能にする、繊毛ビート方向に対して直角繊毛の可視化を可能にする。 このプロトコルは、例えば、薬剤、遺伝的要因、環境曝露、および/または気道繊毛機能と生成/維持にかかる粘液負荷等の機械的要因の役割などの実験、幅広いニーズに対処するための多くの方法で変更することができる気道繊毛ビートと異時波動伝播。

<table><tbody><tr><td>リーボヴィッツ's L-15 Medium </td><td>Invitrogen</td><td>21083-027</td><td>フェノールレッドなし </td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 </td><td>Hyclone</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン </td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2x 細かい鉗子 </td><td>Roboz</td><td>RS-4976</td><td></td></tr><tr><td>解剖ハサミ </td><td>Roboz</td><td>RS-5676</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ解剖ハサミ </td><td>Roboz</td><td>RS-5620</td><td></td></tr><tr><td>メス</td><td>Roboz</td><td>RS-9801-15</td><td></td></tr><tr><td>P1000ピペットマン </td><td>ギルソン社</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>P1000のヒント </td><td>Molecular BioProducts</td><td>2079E</td><td></td></tr><tr><td>18 mm丸型ガラスカバースリップ </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック35 mm培養皿 </td><td>コーニング</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>ガラス底35 mm培養皿</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>W3 64-0758</td><td></td></tr><tr><td>シリコーンシート0.012インチ(0.3 mm)厚い</td><td>AAAアクメラバー株式会社</td><td>CASS-.012X36-63908</td><td></td></tr><tr><td>0.20 &mu;mの直径 Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres </td><td>Polysciences</td><td>09834-10</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡、100倍のオイル対物レンズとDICフィルター </td><td>Lecia</td><td>DMIRE2</td><td>ブランドは重要ではありません。 </td></tr><tr><td>100ワットの水銀ランプ、落射蛍光FITC励起/発光</td><td>フィルターLecia</td><td></td><td>ブランドは重要ではありません。</td></tr><tr><td>顕微鏡ステージ インキュベーター</td><td>レシア</td><td>11521749</td><td>室温で繊毛をイメージングする場合は必要ありません</td></tr><tr><td>高速度カメラ 明視野 </td><td>Vision Research</td><td>Phantom v4.2</td><td>ブランドは重要ではありません。125fps以上の速度でなければならない</td></tr><tr><td>高速蛍光カメラ </td><td>浜松</td><td>C9100-12</td><td>ブランドは重要ではありません。10 fps以上の速度である必要があります</td></tr><tr><td>映画解析ソフトウェア</td><td>国立衛生研究所</td><td>ImageJ と MtrackJ プラグイン</td><td></td></tr></tbody></table>

齧歯気道上皮における繊毛の運動性の高分解能イメージングのためのex vivo法

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

粘膜毛様体クリアランス機能にとって重要な洞察繊毛運動機能を定量的に分析するための撮像マウス気道上皮ためのex vivoでの技術が確立されている。収穫されたばかりのマウス気管気管の筋肉を長手方向にカットしたガラス底皿に浅い薄肉チャンバー内に装着されている。気管サンプルは長手方向にカールする気管筋を活用するために、その長軸に沿って配置されている。これは全体の気管の長さに沿ってプロファイルビューで繊毛運動のイメージングを可能にします。 200フレーム/秒のビデオは繊毛ビート周波数と波形毛様体の定量分析を可能にするために微分干渉顕微鏡と高速デジタルカメラを用いて得られる。撮影時の蛍光ビーズを添加しても、流体の流れを生成繊毛を決定することができる。プロトコル時間は室の準備のために5分で約30分、サンプルの5〜10分間に及ぶ取り付け、およびビデオ顕微鏡のための10-15分。

コントロール気道繊毛がはっきり見えるようにして調整された方法（ 補足ムービー1、ムービーの再生が15％をリアルタイムに減速されています）でビートに見えるはず繊毛ビート（ 補足作品2の方向に顕著な流れに、、ムービーの再生は100％ですリアルタイム）。繊毛映画の定量は、 図3に見られるものと同様の結果が得られるはず。蛍光ビーズの追跡は繊毛生成流速の測定（ 図3D）を可能にしつつ、高速DIC映画のコレクションは、可能な繊毛のビート周波数（ 図3C）の定量化を行い、繊毛ビート形状の定性的な評価のために良好な画像を提供しますと方向（ 図3E）。 私たちは、直線流のインデックスを与える方向性を使用しています。方向性は、蛍光ビーズ（ つまり最短で旅合計変位を割ることによって計算されます距離によってトレースの開始点と終了点）トレース全体にわたって蛍光ビーズが移動の間の距離。ストレ...

気道繊毛運動と繊毛生成されたフローをマウス気管を使用して可視化し、定量化するための簡単​​で信頼性の高い技術が記載されている。この技術は様々な要因が薬理学的薬剤、遺伝的要因、環境曝露、及び/又は粘液負荷などの機械的要因を含む、繊毛運動性にどのように影響するかを決定するために変更することができる。

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

本手順の目的は、新鮮に分離したマウス気管を用いて、呼吸器CLIAの運動性とCLIAによって生成される流れを可視化および定量化することです。まず、浅いイメージングチャンバーを調製します。続く手順では、気管組織を採取し、イメージングのために固定します。次に、100倍XDIC対物レンズを備えた倒立顕微鏡と高速ビデオ撮影を用いて、Cの運動性とCLIAによって生成される流れを視覚化および記録する方法を示します。最終ステップでは、Image Jソフトウェアを使用してCLIAの拍動周波数とCLIAによって生成される流れを定量化し、ビデオを解析します。最終的に、高速ビデオ顕微鏡法を通じて、呼吸器CLIAの運動性とCLIAによって生成される流れの変化を示すことができます。この手法の既存の方法に対する主な利点は、げっ歯類の気道上皮の再現性のあるイメージングが可能となり、繊毛運動の一貫した定量的評価が行える点にあります。これは、最小限のトレーニングで20分から30分以内に達成可能です。本手法は、特にさまざまな遺伝子組換えマウスや変異マウスモデルと併用することで、上気道における粘液クリアランスを制御する細胞および分子メカニズムに関する重要な課題の解決に寄与します。まず、気管サンプルの保持に使用するチャンバーの底部またはチャンバー床を構築します。上部には底面ガラス製の35 millimeter培養皿を使用してください。0.3 millimeter厚のシリコンシートを使用します。シートを18 mmの円形ガラスカバースリップの上に敷き、縁を切り揃えます。次に、メスを用いてシリコンの中央から10 mm四方を切り出します。このガラスカバースリップとシリコンが、培養チャンバーの上面と側面となります。これらは、培養皿に配置したサンプルの上に置かれます。施設ガイドラインに従ってマウスを安楽死させた後、外科的に気管を単離します。気管を、完全に浸漬させるのに十分な量のL 15培地が入ったプラスチック製の35 mm培養皿に回収します。鈍的剥離を用いて、気管周囲の気管以外の組織をすべて除去します。次に、マイクロディセクションハサミを使用し、環状軟骨の直下を横方向に切断して喉頭を除去します。続いて、精細ピンセットを用いて、気管分岐部の直上を横方向に切断し、左右の主気管支を除去します。気管を優しく保持します。次に、1 mL ピペットを使用して、L 15 培地で管腔内を2〜3回洗浄し、粘液や血液を取り除きます。続いて、マイクロ解剖用ハサミを用いて横方向に切断し、気管の3〜4環分のセグメントを切り出します。次に、短い気管セグメントの気管筋の中央に沿って縦方向に切開します。最後に、マイクロディセクション剪刀を用いて気管軟骨環の中央を縦方向に切断し、イメージングに適した2つの気管組織セクションを作成します。解剖後、気管組織セグメントを管腔側を下にして、約100 µLのL 15が入ったガラスボトムディッシュの中央に転移させます。L 15培地1mLあたり2.5%の蛍光マイクロスフィア懸濁液20µLを用いて、CLIAによって生成される流れを定量します。次に、気管の上にシリコンとガラスのカバーを置き、軽く押して固定します。その後、1µLピペットを使用して、端にある余分な培地を除去します。次に、チャンバーを100倍の対物レンズとDIC光学系を備えた倒立顕微鏡に移します。高速カメラと動画取得ソフトウェアを用いて、巻いた気管筋の縁にある線毛気管上皮に沿ったCLIAの運動性を毎秒200フレーム以上で撮影します。また、FSE蛍光イメージングと低照度CCDカメラを用いて、線毛気管上皮の表面を移動する蛍光マイクロスフィアの動画を撮影します。これらの動画を用いて、CLIAにより生成された拍動の定量化を行います。CLIAの拍動機能に顕著な変化はなく、最大1時間までイメージングが可能です。まず、CLIAの1分間あたりの拍動数を算出します。DICイメージングした動画をImage Jソフトウェアパッケージに読み込んでください。Aian Drummondによって説明された手法に従ってください。ラインツールを使用してラスタラインを描画します。拍動している繊毛を横切らせてください。このラインの解像度スライスを作成し、CAがラインを横切ることで波形パターンを生成するグラフ形式の画像を生成します。次に、このラインに沿った各波のピーク間のピクセル数をカウントします。このカウントから。各映画フレームがライン上の1ピクセルで表されていることを踏まえ、1分あたりの拍動数（bpm）を算出します。次に、C Cateによって生成されたフローを測定します。蛍光ビーズの動画をImage Jソフトウェアパッケージに読み込ませます。MT track Jプラグインを使用して、気管上皮表面上の蛍光ビーズを手動でトラッキングします。ソフトウェアによって、トラッキングされた各ビーズの速度と方向性が算出されます。ビーズが位置する繊毛からの距離が、測定される流速の大きさに強く影響することに注意してください。この例では、ビーズの移動速度は線毛の表面で速く、周囲の媒体にある離れたビーズほど遅くなります。これを制御するため、すべてのサンプルにおいて、線毛上皮から固定された距離にあるビーズの追跡データのみを収集し、正確な比較ができるようにする必要があります。最後に、流体フローについては、可能な限り長くビーズを追跡してください。これらの計算を行うには、10個以上の線毛細胞を通過するビーズを使用することが好ましいです。記載したプロトコルを用いて、対照群の気道繊毛が明確に視認でき、協調的に動いていることが確認されるはずです。同様に、拍動方向に顕著な流れが見られるはずです。通常、高速DIC動画を撮影することで、繊毛の拍動頻度の定量化が可能となり、良好な画像が得られます。CLIAのビーズ形状を定性的に評価するため、蛍光ビーズのトラッキングによりCLIAによって生成された流速を測定します。方向性は、蛍光ビーズの総変位を蛍光ビーズのトレースの長さで割ることで算出されます。したがって、直線的な軌跡線は1点となります。一方、蛇行した経路はそれよりも大幅に低い値となります。この手順を行う際は、切断する前に、気管筋から周囲の結合組織および脂肪組織を適切に取り除いておくことが重要です。気管筋をカットした後にそれが丸まることは、呼吸CLIAを理想的な可視化位置に配置するために不可欠です。この手順の後、薬理学的薬剤がどのように、あるいはなぜ呼吸C活性を調節するのかといった追加の疑問に答えるために、薬理学的研究などの他の手法を実施することができます。

ex-vivo-method-for-high-resolution-imaging-cilia-motility-rodent

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

出典:アルオムラン、A.J.、他.マウス脳の側脳室における上衣繊毛のライブイメージング. J. Vis. Exp. (2015).

マウス脳切片における上衣細胞繊毛活性のライブイメージング

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脈絡叢上皮細胞の繊毛運動の観測<em&gt;エクスビボ</em

本稿では、二相様式放射性核種イメージングを利用したマウスの生体内における気道粘膜クリアランス(MCC)を評価するためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、デュアルSPECT/CTシステムでマウス全身(MWB)コリメータを使用した単一光子放射コンピュータ断層撮影(SPECT)およびコンピュータ断層撮影プロトコル用に設計されています。...

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高速ビデオ顕微鏡分析は、比較的実行しやすく、高速で、費用対効果が高く、経験豊富な手で、原発性毛様体ジスキネジアの第一選択診断のためのかなり信頼性の高いツールであり、重度の肺疾患の診断および治療に関与するすべてのセンターで利用可能であるべきです。...

原発性毛様体ジスキネジアの第一選択診断のための高速ビデオ顕微鏡分析

このプロトコルは、マウスおよびラットの連続経口喉頭鏡検査アプローチについて説明しており、最適化された麻酔レジメンと微調整された内視鏡操作技術を使用して、呼吸および嚥下中の喉頭のクローズアップ、遮るもののないビデオイメージングを可能にします。...

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偽層状肺気道上皮の毛様体機能と膜不透過性の決定

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ARL13B-CENTRIN-2マウスモデルを用いた筋骨格組織における原発性繊毛の体積イメージングと解析

学ぶマウス気管上皮の繊毛運動と流動の高分解能イメージング法。高速ビデオ顕微鏡と蛍光ビーズ追跡により、繊毛拍動頻度と波形を定量的に解析し、粘液繊毛クリアランス機構を研究する。

齧歯気道上皮における繊毛の運動性の高分解能イメージングのためのex vivo法

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