Name: における相同組換えコンストラクトを遺伝子改変ショウジョウバエ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: 学ぶ、相同組換えベクターの作製法。Drosophilaにおける遺伝子改変とタンパク質標識のためのrecombineering技術を用いた効率的な手法です。

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私たちは、ヒューゴBellenと試薬用ブルーミントンストックセンターに感謝したいと思います。我々はさらに有用な議論のために公園Venken、ヒューゴBellenとBuszczakとHiesingerラボのすべてのメンバーに感謝します。この作品は、ACRの国立衛生研究所（T32GM083831）、PRH（RO1EY018884）からの補助金によってとMB（RO1GM086647）、MBとPRH（RP100516）にテキサス州のがん予防研究所によって助成金、およびウェルチにサポートされていましたPRHへ財団（I-1657）。 MBは、生物医学研究におけるEEとグリア·ガーソンFogelson大学者で、PRHは、UTの南西医療センターの生物医学研究におけるユージンマクダーモット学者です。

<ol><li>Rong, Y. S., Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+targeted+gene+knockout+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A targeted gene knockout in Drosophila.</a> Genetics. 157, 1307-1312 (2001).</li>
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<li>Gong, W. J., Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ends-out%2C+or+replacement%2C+gene+targeting+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ends-out, or replacement, gene targeting in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2556-2561 (1073).</li>
<li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Res. 33, e36(2005).</li>
<li>Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Court, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombineering%3A+a+powerful+new+tool+for+mouse+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics.</a> Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).</li>
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<li>Venken, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+P%5Bacman%5D+BAC+libraries+for+transgenesis+studies+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Versatile P[acman] BAC libraries for transgenesis studies in Drosophila melanogaster.</a> Nat. Methods. 6, 431-434 (2009).</li>
<li>Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+transgenic+Drosophila+by+using+the+site-specific+integrase+from+phage+phiC31%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31.</a> Genetics. 166, 1775-1782 (2004).</li>
<li>Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+transgenesis+system+for+Drosophila+using+germ-line-specific+phiC31+integrases%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3312-3317 (2007).</li>
<li>Chan, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+of+Rab+GTPases+with+synaptic+functions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila.</a> Current Biology: CB. 21, 1704-1715 (2011).</li>
<li>Chan, C. C., Scoggin, S., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+recombineering+and+ends-out+homologous+recombination+to+systematically+characterize+Drosophila+gene+families%3A+Rab+GTPases+as+a+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Commun.+Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study.</a> Commun. Integr. Biol. 5, 179-183 (2012).</li>
<li>Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+DNA+electrotransformation+efficiency+in+Escherichia+coli+DH10B+electrocompetent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Electronic+Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells.</a> Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).</li>
<li>Wang, S., Zhao, Y., Leiby, M., Zhu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+positive%2Fnegative+selection+scheme+for+precise+BAC+recombineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering.</a> Mol. Biotechnol. 42, 110-116 (2009).</li>
<li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+upgrades+for+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster.</a> Development. 134, 3571-3584 (2007).</li>
<li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448, 151-156 (2007).</li>
</ol>

著者は、ここで概説技術に関しての任意の競合する利益を持っていません。

生物医学研究における遺伝的モデル生物の力は、主に遺伝子操作のために利用可能なツールに基づいています。小さ ​​なモデルC.特に虫とショウジョウバエは、多細胞発達や機能に関与して、完全な経路および遺伝子ファミリーの、安価で高速な分子遺伝学的解析が可能になります。近年は、 ショウジョウバエ 14,15の遺伝子を操作するためのツールの開発に大きな進歩を見てきました。例えば、広くバクのDNA構築物を操作するためにマウス遺伝学で使用されるコンビは、最近、P [acman]ベクトルとΦC31-媒介形質転換6を使用することにより、 ショウジョウバエのために適合させた。異なる選択カセットはどこにも換え有能な細菌を4,13を使用して構造内の特定の配列の挿入または削除が可能になります。それは構築するために使用することができるように、我々は、元のP [acman]ベクトルを変更した<em&gt; ショウジョウバエにおける内因性遺伝子座を標的生体相同組換えベクターである。この新しいベクター...

彼らの内因性遺伝子座にある単一の遺伝子の分子的に定義された操作をきれいにすることは、真核生物に関連する質問の無数を研究するための貴重なツールを提供しています。 ショウジョウバエは、機能喪失対立遺伝子を生成するための遺伝学的手法を逆Golicと同僚に導入するまで挑戦することが証明されていた生体内遺伝子はショウジョウバエ 1-3に相同組換えを利用したターゲット。彼らは、その特定のゲノム遺伝子座が統合トランスジェニック構築物からのDNAの線状断片を用いて標的を実証することができる。この線形&quot;ドナー&quot; DNAはメガヌクレアーゼI-SceIを持つ線形続いFRT媒介組換え（物品税に環状分子として染色体からDNA）を通して生体内で生成されます。この方法は正常に定義された病変の様々を生成するために使用されているが、この技術は、並列で多数の遺伝子を操作するために容易に拡張されていないため、各INDIVIデュアルノックアウトコンストラクトははっきりとカスタム設計を必要とします。シームレスクラシカル制限酵素/ライゲーションクローニングやPCRならびに生体形質転換ベクターの伝統のサイズ制限はしばしば標的相同組換えの迅速な作成に干渉を用いたin vitroでの DNAの大断片（&gt; 5 KB）を操作することで例えば、困難ベクトル。これらの制限を克服するために、我々はそれを効率的かつ比較的急速なプラットフォームを確立するための方法論をターゲット両端アウト遺伝子とDNAの100キロバイトまでのサブ·クローニングと遺伝子導入を可能にしますコンビニアリング/トランスジェネシスP [acman]システムを、組み合わせショウジョウバエの遺伝子ターゲティングが容易になります。 組み換え媒介遺伝子工学（コンビニアリング）は4,5パワフル相同組換えベースのクローン技術です。従来の制限酵素/リガーゼクローニングとは対照的に、コンビは、シーケンスまたはSIZに限定されるものではない操作したDNAの電子。コンビニアリングは、特別なE.を使用しています不良λプロファージ4で提供される組換え機構を宿す大腸菌株 。この技術は、最近ショウジョウバエ 6,7に採用されている。 ショウジョウバエのコンビニアリングはP [acman] 6,7と呼ばれる修正された条件に応じて増幅細菌人工染色体（BAC）ベクターに依存しています。 ORIV、シーケンシングおよび胚の注入および基底条件下で低コピー数を維持オリスに必要なDNAの大量の精製のための化学誘導時に高コピー数を生成します。このベクターは、複製の二起源を運ぶ。さらに、P [acman]ベクターは細菌の付着（のattB）サイトが装備されています。のattBサイトは、 ショウジョウバエのゲノム8,9内の所定の着陸地点に大きなDNA断片の取り込みを可能にΦC31インテグ媒介形質転換のための基質として機能します。 我々は、両端アウト相同組換え10,11のためのターゲティングベクターとして使用することができるP [acman]ベクトル（P [acman]-KO 1.0と呼ぶ）が生成されている。システムに技術をターゲット両端アウト遺伝子組み込むには、我々は2つ​​のFRTと2 I-SceI制限酵素サイトを追加しました。また、P [acman]-KO 1.0にホモロジーアームを組み込むプロセスを合理化するために、この修正されたベクター内のゲートウェイカセットが含まれている。これは、ターゲティングベクターに関心の事実上すべてのゲノム領域を導入するための迅速かつ簡単な方法を提供します。このプロトコルでは、P [acman]-KO 1.0、そしてどのように内因性遺伝子座を標的とするin vivoでこのベクトルを動員するを使用してターゲティングベクターを設計する方法について説明します。このプロトコルの目的のために、我々は、目的の遺伝子を置換するRFP /菅カセットを使用するが、抗生物質選択マーカーを含有するカセットの様々なこのプロトコルで使用することができる。私たちは、カセットのセットのために設計されており、正常に使用している遺伝子置換およびタギング10,11。

<table><tbody><tr><td>SW102 組換えコンピテントバクテリア</td><td>NCI-Frederick</td><td>Recombination Bacteria (SW102, SW105 and SW106)</td><td><a href="http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx" target="_blank">http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx</a></td></tr><tr><td>TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli</td><td>Epicentre</td><td>EC300110</td><td>CopyControl を含む導入ソリューション</td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS DNAポリメラーゼ</td><td>Aligent Technology Inc.</td><td>600670</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean Gel DNA Recovery Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4001</td><td></td></tr><tr><td>Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit</td><td>Invitrogen</td><td>11789-020</td><td></td></tr><tr><td>P[acman]KO1.010</td><td>Buszczak and Hiesinger Labs</td><td>ご要望</td><td></td>に応じて</tr><tr><td>pENTR RFP-Kan11</td><td>Buszczak and Hiesinger Labs</td><td>Uponリクエスト</td><td></td></tr><tr><td>Flystocks</td><td>Bloomingtonストックセンター</td><td>品番:25680、25679</td><td>y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y;P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y;P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1</td></tr><tr><td>エレクトロポレーションマシン</td><td>Biorad GenePulser Xcell with PC module</td><td>165-2662</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes</td><td>Fisher Brand</td> <td>#FB101</td><td></td></tr></tbody></table>

における相同組換えコンストラクトを遺伝子改変<em&gt;ショウジョウバエ</em

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

内因性遺伝子座の高速、大規模な操作のための技術の継続的な開発は、ヒトの疾患関連の研究のための遺伝モデル生物としてキイロショウジョウバエの使用を広げるする。近年では、相同組換えとコンビニアリングなどの技術的な進歩を見てきました。しかし、明確なヌル突然変異またはタギング内因性タンパク質を生成することはほとんどの遺伝子のために相当な努力のまま。ここでは、 インビボで内因性遺伝子座を標的とし、操作するために使用することができるベクターを生成するためにコンビベースのクローニング方法を使用するための技術を記述し、実証具体的には、3つの技術の組み合わせを確立している：（1）BACの形質転換/コンビ、（ 2）端部アウト相同組換えおよび（3）ゲートウェイ技術は、内因性遺伝子座を操作するための堅牢な、効率的で柔軟な方法を提供することにある。このプロトコルでは、我々はどのように（1）設計individuaの約ステップバイステップの詳細を提供Lベクトルは、（2）ギャップの修復を使用して相同組換えベクターにゲノムDNAの大断片のクローンを作成する方法、および（3）コンビニアリングの第二ラウンドを使用して、これらのベクター内に目的の遺伝子を交換するか、タグにどのように。最後に、我々はまた、ノックアウト、またはノックイン経由タグ付けされた遺伝子を生成するために、生体内でこれらのカセットを動員する方法のためのプロトコルを提供する。これらの方法は、簡単に並列に複数のターゲットを採用し、タイムリーかつ効率的にショウジョウバエのゲノムを操作するための手段を提供することができます。

LAやRAのホモロジーアームの増幅は500 bpの製品を生産する必要がありますし、PCR-SOE反応が1.0キロバイト製品（セクション2.1から2.4、 図2）を得る必要があります。セクション2.5で実行BP反応は、通常、製品の歩留まり平均で5-100コロニーの非常に効率的で、細菌の変換です。ほぼPCR検査で試験したすべてのコロニーは、予想されるPCR産物を示す。 コンビニアリングの最初のラウンド（第3節）の間、SW102細胞にLAやRA武器を含む消化P [acman]-KO-1.0の変換後の20〜40個のコロニーを得ることを期待しています。これらのクローンの40〜60％は、目的の組換え産物を運ぶでしょう。熱ショックを与えた細胞と比較して、非熱ショックコントロールはコロニー場合ごく少数含まれている必要があります。試料とコントロールプレート上のコロニーの両方に同じ数の外観は、通常、未切断プラスミドの存在下または他の汚染物質を示す。この場合、実験寿LDは破棄され、繰り返され、今回はP [acman]は-KO-1.0は、ステップ3.2で説明した命令の次...

相同組換え技術は大きく前進<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;分子正確な突然変異の作成を可能にすることによって、遺伝学。コンビニアリングの最近の採用は1つがDNAの大部分を操作し、にそれらを変換することができます<em&gt;ショウジョウバエ</em<sup&gt; 6</sup&gt;。方法は、急速に大規模な相同組換えベクターを生成するためにこれらの技術を組み合わせて、ここで提示した。

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...

本手法の全体的な目的は、内因性のoph遺伝子座を標的として操作するために使用できる、サイズの大きな相同組み換えベクターを迅速に作製することである。これは、まず目的のゲノム領域をカバーするバッククローンを選択し、次に、相同組み換えベクターにホモロジーアームをクローニングすることによって達成される。第3のステップは、ギャップリペアを用いてゲノムDNAを相同組み換えベクターにクローニングすることです。最終ステップでは、ゲノム領域をターゲティングカセットで置換します。最終的に、これらの手順によって相同組み換え用のターゲティングベクターを構築し、組み換えベースの技術を用いることで、ショウジョウバエにおける明確なヌル変異の導入や内因性タンパク質のタグ付けを実現します。さらに、本論文には、これらのカセットをin vivoで動員し、ノックアウトまたはノックインによるタグ付き遺伝子を作製するためのプロトコルも含まれています。既存の手法に対するこの技術の主な利点は、複数のターゲットに対して並行して容易に適用でき、ophゲノムを適時かつ効率的に操作する手段を提供することです。この目的を達成するため、我々の手法では、相同組換えベクターを作製するために、組換え技術とGateway技術を組み合わせています。従来の制限酵素およびリガーゼを用いたクローニングとは対照的に、これらの技術はDNAのサイズや配列による制限がないため、クローニングプロセスが容易になります。本プロトコルでは遺伝子ノックアウト用のターゲティングカセットを作製する方法について説明しますが、この手法は、実質的にあらゆる望ましい方法で、任意の内在性遺伝子座を操作するために利用可能です。これには、目的遺伝子へのタグ付け、目的遺伝子のGAL4への置換、あるいはタンパク質の切断型やレポーターラインの作製が含まれます。ここでは、目的遺伝子であるCG 3 2 0 9 5を含むベクターを入手します。この例では、gene@flybased.org で遺伝子の検索を行います。バックのリストを取得するには、「stocks and reagent（ストックおよび試薬）」セクションを確認し、「genomic clones（ゲノムクローン）」というタイトルのセクションをチェックしてください。利用可能なオプションの中から、目的遺伝子の5'側（上流）に少なくとも10 kb、3'側（下流）に5 kbを含むクローンを選定します。これらの領域をホモロジーアームとして使用します。これは、バックボーンの5'末端および3'末端の配列をショウジョウバエのゲノムにアライメントさせることで行うことができます。あるいは、Pac-Manベクターのクローンをpacmanfly.orgで入手することも可能です。次に、各ホモロジーアームの末端にある500 base pairsを増

recombineering-homologous-recombination-constructs-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

のために導入遺伝子を産生する能力...

の生産 C.エレガンス</emとRecombineering経由>トランスジーン galK選択可能なマーカー

このビデオでは、放射性標識プローブを使用してマウス胚性幹細胞のゲノム内の相同組換えイベントを同定するサザンブロッティング技術について説明します。相同組換えイベントを含むDNA領域は、プローブ結合DNAを含む膜がX線に曝露されると、明確なバンドとして現れます。...

マウス胚性幹細胞ゲノムにおける相同組換えを検出するためのサザンブロッティング

遺伝子ターゲティング方法論は、ノックアウト、ノックイン、タグ付き対立遺伝子を持つトランスジェニックマウスを生成するために使用することができます。...

サブクローニングプラス挿入（SPI） - ジーンターゲティングベクターの迅速な構築のための新しい遺伝子改変方法

このプロトコルは、 ショウジョウバエの眼/触角成虫（EAD）に蛍光マークされ、遺伝的に定義されたクローンの腫瘍を生成する方法を示します。なお、第3齢幼虫とどのように遺伝子発現の変化と腫瘍侵襲性を可視化し、定量化するためにそれらを処理するからEADと脳を分析する方法について説明します。...

ザ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;成虫盤腫瘍モデル：遺伝的モザイクを用いた遺伝子発現と腫瘍侵襲性の可視化と定量化

タンパク質は、多くの場合、異なる細胞機能を発揮することができ、複数のドメインを含みます。遺伝子ノックアウト（KO）は、この機能的多様性を考慮していません。ここでは、様々な機能ドメインまたはタンパク質の変異体の分子解剖を可能KO胚性幹細胞における組み換え媒介カセット交換（RMCE）ベースの構造と機能のアプローチを報告しています。...

リコンビナーゼ媒介カセット交換を用いて、マウス胚性幹細胞における構造と機能の研究

ショウジョウバエの遺伝子の最初のコーディングのエクソンを転写ドライバーと置き換えることにより組織特異的転写、バイナリ システムを生成する方法を紹介します。CRISPR/Cas9 ベースのメソッド交換遺伝子の内因性の規制の下での転写活性化シーケンスを配置、その結果遺伝子特定の時空間パターンを排他的に transctivator...

ショウジョウバエのゲノム編集による組織固有のバイナリ転写システムを生成するための効率的な戦略

南しみが付くことおよび/または PCR を用いたマウス胚性幹細胞に発生した相同組換えイベントを識別するための詳しいプロトコルを紹介します。このメソッドは、伝統的な胚性幹細胞を用いた相同組換えを介したターゲット技術を使用して非ミオシン II 遺伝子交換マウス...

南しみが付くことおよびポリメラーゼの連鎖反応を使用してマウス胚性幹細胞での相同組換えイベントの識別

このプロトコルの目的は、ショウジョウバエメラノガスターにおける生体内実験の設計と性能を概説し、ヒト疾患に関連する希少遺伝子変異体の機能的影響を評価することです。...

ショウジョウバエを用した疾患関連希少ヒト変異体の生体内機能的研究

この記事では、ショウジョウバエのphiC31インテグラーゼ媒介トランスジェネシスを例に、トランスジェニックフライを作成するための重要なステップである胚マイクロインジェクションの最適化されたプロトコルを紹介します。...

ショウジョウバエにおけるトランスジェネシスのための胚マイクロインジェクション

ショウジョウバエにおけるボルバキア細菌感染

学ぶ、相同組換えベクターの作製法。Drosophilaにおける遺伝子改変とタンパク質標識のためのrecombineering技術を用いた効率的な手法です。

における相同組換えコンストラクトを遺伝子改変

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