小説エクスビボ文化法
May 24th, 2013
マウスの発達研究は妊娠中に胚の到達不能によって妨げられている。妊娠の後期段階で胚の心臓の長期培養を促進するために、我々は摘出心臓が半固体、希釈マトリゲルで培養されているプロトコルを開発しました。
この手順の全体的な目標は、ex vivo培養のために胚の心臓を切除することです。これは、最初に妊娠中の雌マウスから子宮角を回収することによって達成されます。次に、胚を回収し、解剖の準備をします。
次に、胚の胸壁を開いて心臓を視覚化します。最後に、心臓を切除し、希薄なマトリゲルを含む培養ウェルに入れます。最終的には、明るい視野顕微鏡で観察することで、健康な生きた心臓を示す結果を得ることができます。
この手法がロッキングカルチャーなどの他の方法よりも優れている主な利点は、心臓をビーズに結合したタンパク質のような局所的な薬剤、またはマトリゲルに低分子を添加するなどのグローバルな薬剤で心臓を治療できることです。この技術の意味するところは、心臓の特殊な部分内の事象を無傷の臓器全体の文脈で調べることができるため、心血管疾患の治療にまで及びます。所望の胚の日に時限妊娠マウスを安楽死させた後、あなたの研究所によって承認された技術を使用して、腹腔を開き、子宮角を回収して切除する前に、女性に70%エタノールをたっぷりとスプレーします。
子宮角を冷たいXPBSの入ったシャーレに入れ、すすぎます。解剖する準備ができるまで、皿を氷の上に置きます。次に、正中線を介して子宮角を切り開き、付着した胚嚢を露出させます。
胚の袋を切り開き、冷たいPBSを入れた2番目のシャーレに胚を入れます。子宮の角のある皿を氷の上に置きます。胚の首を切った後、胚を背中に乗せて切ります。
胸壁を開いて、心臓と肺を視覚化します。ステージによっては、胸壁が透明になっている場合があります。ジェノタイピングを行う場合は、胚の尾を保存します。
鉗子を使用して慎重に心臓を持ち上げ、下の血管を切断します。次に、心を解放するために大きな血管の上を切り取ります。必要に応じて、無関係な組織を取り除きます。
冷たいPBSで満たされ、氷の上に座っている24ウェル皿の1つのウェルに心臓を置きます。解剖を繰り返して、すべての胚の心臓を分離します。層流フードで、冷たかったマトリゲルと目的の培地を1対1の比率で組み合わせ、希薄なマトリゲルを氷上に保持します。
溶液の500〜1000マイクロリットルを24ウェル培養のウェルにピペットで移します。それを氷の上で皿に盛ります。切除した心臓を慎重に選び、培養皿を含むマトリゲルの個々のウェルに入れます。
埋め込まれた心臓の向きが重要な場合は、70%エタノールを使用して、倒立顕微鏡とその周囲の空間にたっぷりとスプレーします。次に、フードで作業した後、氷上のマットジェルのウェルに心臓を置きます。プレートを顕微鏡ステージに置き、マットゲルが固まり始めると、心臓の向きをすばやく合わせます。
培養皿を加湿した摂氏37度のインキュベーターに入れ、マトリゲルを約30分間固化させます。1ミリリットルの温めた培養物を、心臓を含む各ウェルに中程度に加えます。心臓は少なくとも4日間は培養にとどまることができます。
必要に応じて、cyto 16などの蛍光生細胞ダイを添加します。ライブハートを視覚化するために、写真は、埋め込まれた位置に基づいて見えるハートの側面に限定されます。ホールマウントイメージングまたはセクショニングを行う場合は、培地を取り出します。
冷たい4%ホルムアルデヒドと交換し、皿を氷の上に30分間置きます。マトリゲルが溶解した後、固定剤とマトリゲルを新鮮なホルムアルデヒドに交換し、心臓を摂氏4度で一晩固定します。PBSまたはTrissで心臓を洗い、さらなる分析まで摂氏4度で保管します。
生体外で24時間培養すると、冠状血管系は、ここに示すように、子宮内で維持された同等の老化胚から切除された心臓に似ています。E 16.5で切除し、ex vivoで4日間培養した心臓のHemat、toin、およびeoin分析は、循環が不足しているにもかかわらず、大動脈の壁と心臓の心室および心室間中隔心筋を含む全体的な形態が無傷のままであることを示しています。冠状動脈骨は、矢印で示されているように明らかです。
しかし、DNAの断片化は矢印で示され、hとdの両方で観察され、DAPIはコンパクトな心筋と大血管の周囲に明らかです。さらに、心筋は、ex vivo培養された心臓がまだ鼓動しているにもかかわらず、子宮内で発生したE 18.5胚の心臓と比較して密度が低くなっています。したがって、これらの心が維持される時間の長さや段階には制限があります。
この培養技術は、内皮特異的蛍光色素を用いた培養後の培養中に、心臓を48時間培養しながら、心臓を蛍光標識するためにも使用できます。この場合、視覚化は心臓の向きと組織の不透明度に基づいて制限されます。心室心筋を通るその後の組織学的切片は、細胞16が心室内の心外膜下血管を標識するために外側の細胞層を貫通し、ここで示されるようにISセレクチンと共局在することが確認されています30時間のex vivo培養後、E 14.5胚から切除された心臓は、心房と心室の間で一貫した収縮性とペーシングを示します。
このテクニックを実行するときは、心臓を切除するときに優しく注意することが重要です。このビデオを見た後、マウスの胚の心臓を切除して培養する方法をよく理解しているはずです。
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概要
この記事では、後期マウス胚から胚性心臓を切除し培養するためのプロトコルを紹介します。心臓は長期の観察と研究を容易にするために、半固形の希薄マトリゲルで培養されます。
主要な研究要素
科学分野
- 発生生物学
- 心血管研究
- マウスモデル
背景
- 妊娠中の胚性構造へのアクセスは困難です。
- エクスビボ培養技術は胚性発達の研究を強化できます。
- マトリゲルは培養組織のための支持環境を提供します。
- 心臓の発達の理解は先天性心疾患への洞察に不可欠です。
研究の目的
- 胚性心臓を培養するための信頼できる方法を開発すること。
- 心臓の発達の長期観察を可能にすること。
- 心臓機能と発達に関する研究を促進すること。
使用された方法
- 妊娠マウスから子宮角の取り出し。
- 胚性心臓へのアクセスのための解剖。
- 心臓の切除と希薄マトリゲルへの配置。
- 明視野顕微鏡下での培養心臓の観察。
主な結果
- このプロトコルは胚性心臓の切除を成功裏に可能にします。
- 心臓は生存可能で培養下で観察できます。
- 結果は培養環境下で健康な心臓機能を示しています。
- この方法はさらなる発生研究に使用できます。
結論
- 開発されたプロトコルは胚性心臓の長期培養に効果的です。
- このアプローチは心臓の発達研究を強化できます。
- 将来の研究では、この方法を使用して心臓関連の現象を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This ex vivo culture method enables sustained observation of embryonic mouse heart development, supporting target validation in cardiovascular research by maintaining organ-level physiology outside the uterus. The approach provides a disease-relevant system for mechanistic de-risking of therapeutic candidates affecting cardiac morphogenesis and function. It bridges early discovery with preclinical assessment by preserving three-dimensional structure and contractility for up to four days post-dissection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in an intact organ context without confounding maternal circulation.
- Operational Value: Supports functional target validation by preserving coronary plexus development and myocardial structure.
- Predictive Value: Facilitates assessment of compound effects on heart morphology and contractility over multiple days.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Provides a standardized platform for quantitative imaging of vascular and myocardial parameters.
- Reproducibility: Dilute Matrigel matrix supports consistent tissue embedding and orientation across replicates.
- Scalability: Compatible with 24-well format for parallel compound testing and dose-response analysis.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models late-gestation heart development (E14.5-E16.5) for studying congenital defect mechanisms.
- Translational Continuity: Allows progression from organ culture to histological analysis (e.g., cyto16 labeling, fixation) for target engagement verification.
- Mechanistic De-risking: Enables evaluation of vascular and myocardial integrity under experimental perturbations.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, supporting iterative design-make-test-analyze cycles in cardiovascular drug discovery.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by enabling live imaging of heart development and response to pharmacological agents.
- Screening: Delivers quantitative outputs via bright-field and fluorescence microscopy for assessing structural and functional endpoints.
- Analytics: Generates measurable data on coronary plexus formation, myocardial density, and contraction patterns for comparative analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical work through fixation, sectioning, and biomarker co-localization (e.g., cyto16 with selectin).
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable organ culture platform applicable across multiple study designs and compound classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in cardiac development studies by maintaining intact organ architecture.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized Matrigel preparation and culture conditions.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early functional readouts on heart viability and structure.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on developmental toxicity and target engagement profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic dissection and sterile tissue handling.
- Dependent on access to laminar flow hoods, incubators, and microscopy systems.
- Necessitates standardization of Matrigel dilution and temperature control for consistent gelation.
- Limited to embryonic stages up to E16.5 for viable four-day culture, per source data.
- Orientation sensitivity requires careful embedding when regional analysis is critical.
