Name: 小説エクスビボ文化法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 学ぶ マウス胎児心臓のエクスビボ培養法。子宮角からの採取、Matrigel中での長期培養、明視野顕微鏡による観察を通じて、心臓発生と機能を詳細に研究できます。心血管疾患治療への応用も期待されます。

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我々は、重要な原稿の読み取りと資金支援のためのNIH（助成金＃R01HL061656）用アンドレアPortburyのに感謝したいと思います。

1。胚ハーツを切除<ol><li>承認された安楽死法を用いて、所望の胎生で時限妊娠マウスを安楽死させる。全ての実験は、ノースカロライナ大学チャペルヒル校で制度動物実験委員会によって承認された。 </li><li>自由に解剖する前に70％エタノールで女性をスプレー。子宮角を取得し、消費税に女性の腹腔を開きます。 </li><li>コー​​ルド1Xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）表示し、必要に応じてすすぎを含むペトリ皿に子宮角に置きます。添付された胚嚢を露出する正中線を経由して子宮角を切り開く。 </li><li>胚嚢を開いてカットし、胚を取り出す。冷PBSで二ペトリ皿に胚を置きます。氷に子宮角とペトリ皿を返します。 </li><li>胸壁へのアクセスを改善するために胚の首。ジェノタイピングが必要な場合は、削除し、氷上に置いたエッペンドルフチュー​​ブ内の尾を保存する。 </li><li>ととも​​にその背中に胚、心臓や肺を可視化するために胸壁を開いてカット。段階に応じて、胸壁は、透明であってもよい。 </li><li>慎重にピンセットを用いて心臓を持ち上げ、下に血管を切った。その後、心を解放するために大血管の上にカット。必要であれば、余分な組織を除去する。 </li><li>冷PBSで満たされた24ウェルディッシュの1つのウェルに心を置き、氷の上にお皿を置きます。 </li><li>心はすべての胚から摘出されるまで、上記の手順を繰り返します。 </li></ol> 2。文化セットアップ<ol><li>層流フードでは、1:1の割合で風邪マトリゲル希望培地（ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で例えば 、10％ウシ胎児血清（FBS））配合しています。プレ暖かい培地ない。 </li><li>氷も、氷の上で維持されている24ウェル培養皿のウェルに希釈液のピペット500〜1,000μlの上希薄マトリゲルを保つ。 </li><li>フードでは、慎重にピックアップし、切除を配置マトリゲル含有培養皿のウェルにおける心臓氷の上で培養皿を保ちながら。 </li><li>埋め込まれた心臓の向きが重要である場合：たっぷり70％エタノールで倒立顕微鏡と周囲の空間をスプレー。フードでは、まだ氷の上ながら、マトリゲル含有培養プレートのウェル中に摘出心臓を配置。その後、顕微鏡でプレートを配置し、素早く向きを摘出心臓をマトリゲルが固化し始めると。 </li><li>加湿37℃インキュベーター（5％CO 2）で培養皿を置き、マトリゲルは、約30分間固化することができます。 </li><li>よく心臓を含む各1ミリリットル予め温めておいた培地を追加します。 </li><li>ハーツは、少なくとも4日間培養中に残ることができます。 2日ごとに培地を変更することをお勧めします。 </li></ol> 3。固定と可視化<ol><li>必要であれば、生きて心を可視化する蛍光生細胞色素（ 例えば SYTO-16）を追加します。写真は次のようになりますそれが埋め込まれた位置に基づいて表示される心臓の側に限定。 </li><li>培養後の解析（ 例えば全体のマウントイメージングまたはセクショニング）が行われる場合には、培養培地を除去し、冷4％ホルムアルデヒドで置き換える。 30分間氷上で皿を置きます。 </li><li>冷たいホルムアルデヒドや氷がマトリゲルの溶解を促進した後、新鮮なホルムアルデヒド（およびマトリゲル）固定液を交換して、一晩4℃の心を修正</li><li> 4°Cまで、さらなる分析にバッファ（ 例えば PBSまたはトリス）とストアと心を洗う。 </li></ol>

<ol><li>Tu, S., Chi, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+in+cardiac+development+and+congenital+heart+birth+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects.</a> Differentiation. 84, 4-16 (2012).</li>
<li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+signals+regulate+a+wave+of+Hedgehog+activation+that+is+essential+for+coronary+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development.</a> Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).</li>
<li>Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464, 549-553 (2010).</li>
<li>Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietin+and+retinoic+acid%2C+secreted+from+the+epicardium%2C+are+required+for+cardiac+myocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation.</a> Dev. Biol. 255, 334-349 (2003).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FGF-BMP+signaling+axis+regulates+outflow+tract+valve+primordium+formation+by+promoting+cushion+neural+crest+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">The FGF-BMP signaling axis regulates outflow tract valve primordium formation by promoting cushion neural crest cell differentiation.</a> Circ. Res. 107, 1209-1219 (2010).</li>
<li>Pillekamp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+mouse+embryonic+heart+slice+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%3A+international+journal+of+experimental+cellular+physiology%2C+biochemistry%2C+and+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 16, 127-132 (2005).</li>
<li>Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+heart+slices+for+cell+transplantation+and+physiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies.</a> Organogenesis. 5, 62-66 (2009).</li>
<li>Janssen, P. M., Lehnart, S. E., Prestle, J., Hasenfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+contractile+characteristics+of+human+myocardium+in+multi-day+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Preservation of contractile characteristics of human myocardium in multi-day cell culture.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 31, 1419-1427 (1999).</li>
<li>Brandenburger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+culture+from+human+adult+ventricular+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium.</a> Cardiovasc. Res. 93, 50-59 (2012).</li>
<li>Weaver, M., Dunn, N. R., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmp4+and+Fgf10+play+opposing+roles+during+lung+bud+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bmp4 and Fgf10 play opposing roles during lung bud morphogenesis.</a> Development. , 127-2695 (2000).</li>
<li>Viragh, S., Challice, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+the+epicardium+and+the+embryonic+myocardial+circulation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse.</a> Anat. Rec. 201, 157-168 (1981).</li>
<li>Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKirby%2C+ML+%22Cardiac+Development%22">Cardiac Development</a>. , Oxford University Press. (2007).</li>
<li>Arima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+morphogenesis+driven+by+dynamic+and+heterogeneous+collective+endothelial+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement.</a> Development. 138, 4763-4776 (2011).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

現在の培養系は、胚マウス心臓研究のための重要な利点をもたらす。この培養系でも文化の中で4日後、壊死の限られた兆しで、心筋収縮と冠動脈叢を維持します。さらに、半固体マトリックスは、培養中の場所にコーティングされたビーズを保持するためにも契約に柔軟性を可能にしながら、発展途上心臓の三次元形態を維持するのに十分なサポートを提供。このサポートにもかかわらず、この行列は、ライブ心臓の蛍光分析を可能にする、などSYTO 16などの蛍光色素に対して透過性である。 スライス培養法は毛細管現象7を介して酸素を維持するために、気液界面における多孔質膜上に、冠状静脈叢のその部分を含む、心臓部を配置。これとは対照的に、以前の心臓全体の培養方法は、機能的冠動脈vasculat前胚の年齢にロッキングと制限された研究に頼るUREは2,3,5が必要である。冠状叢が気液界面のさらなる複雑させずに形成した後、現在の技術を使用して、しかし、心臓を容易に培養することができる。 後期胚の心（ 例えば E16...

近年、トランスジェニックマウスは、開発心臓欠陥を研究するための支配的なモデルシステムとなっています。しかしながら、このようなゼブラフィッシュなどの他のモデル生物では、マウスに比べて大きな利点を有することが証明されている。心臓の開発を容易に可視化することができます胚の光透過性、、、ゼブラフィッシュの3つの主要な利点は、胚へのアクセスを容易にするために、卵の外部敷設され、に小分子治療法を適用することの容易さは、胚の発達を調節する1。したがって、胚器官の元の子宮内成長を許容培養技術の開発は、少なくとも部分的に制限が現在のトランスジェニックマウスの発達プロセスを研究者が経験する、バイパスだろう。 ex vivoで心臓の培養系がどのように差の小分子と分析による治療を可能ニワトリ、マウス胚の両方で開発されている心臓のferent領域は2-6を伝える。全体のマウス心臓の文化のために、心が胚に胚から取り上げ（E）年齢12.5ロッキング2,3,5の有無にかかわらず培地に配置することができます。この技術を用いて、胚の心臓が正常E13.5の均等にインキュベートされており、ロッキングと共に培養し心臓は限り三日（E10.5から始まる）3として維持されている。しかし、研究では、年上の胚から心臓の正常な文化を報告しなかった。同様に、レスキュー実験培地2にグローバルに治療剤を塗布に限定されている。 心が、摘出埋め込まれており、ビブラトームを使用して区分されているスライス培養システムは、また、E12.5マウスの心とハンバーガー·ハミルトンステージ36（約E16マウスで）ひよこの心のように両方の若い心、のために利用されている2,4,6、およびそのような産後および成体マウスhと年上の心、eartsと成人の心7,8。胚の分析が一般的に150μmの厚さのセクション2,4を活用しているが、セクションの厚さは酸素欠乏8の証拠なしで偉大な500μmとすることができます。これらのスライス培養物は、ほとんどのスライスが、この期間9を通じて収縮性を維持することで、文化の中で二ヶ月限り、維持されている。隔離された心筋細胞の研究に比べて、これらのスライス培養は、その隣接セル型と心筋細胞の共培養を可能にし、ex vivoでの解析のための有用な方法を提供します。しかし、これらの文化は単に培地中の心を（ 例えばビブラトームで切片のライブの心臓を埋め込 ​​む）を置くよりも精巧なセットアップが必要であり、任意の分析が明らかにセクション内で心臓の一部に限定されています。 制限は培養マウス胎児心とトランスジェニックマウスAVAの富のために、上記を考える研究のためilable、我々はウィーバーらによって開発されたex vivoでの肺培養系に似たex vivoでのマウス心臓培養システムを開発しました10私たちの培養系全体マウス胎児心内改造冠循環の長期培養と可視化を可能にします。また、マトリゲルの使用は、従って、治療剤と局所治療を提供し、ビーズを心臓周辺の所定の位置に保持することができる。これらの実験は、冠動脈形成などの工程上の所与の治療効果を比較するために異なる発生時点で行うことができる。小分子はマトリゲルを通って拡散することができるので、この培養系はまた、特異的な細胞 - 細胞接触が特定の発達プロセスのために、または1つの領域から他方の傍分泌シグナル伝達があるかどうかが必要であるかどうかを決定するために互いに近くに心臓の培養解剖した領域に使用することができる必要。 この培養系比較的単純であり、スライス培養系とは異なり、基本的な培養試薬は、ほとんど研究室で容易に入手可能であるセットアップを使用する。要するに、胚心臓を摘出した半固体支持体を提供する希釈マトリゲルで培養される。このサポートは、契約に心を可能にしながら、心臓の三次元形態を維持するのに十分である。このシステムを使用して、古いマウス胚（E14.5-E16.5）から、全体の心は、最大4日間の培養で維持することができます。全体冠状動脈神経叢が維持され、スライス培養とは異なり、心臓のさまざまな地域から発生したすべてのシグナリングキューが存在したままそう。また、生細胞の蛍光色素は、ライブ心臓の可視化を可能にするマトリゲルに浸透することができ、タンパク質 - 結合ビーズ、ローカライズされたシグナリング·ソースを提供するために、心臓の近くに配置することができる。一緒に、これらの利点は、この手法をembryonの発達過程を研究するための理想的な方法を作るICのマウス心臓。

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>時限妊娠マウス</td><td></td><td></td><td>目的の胚期で解剖する</td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>成長因子減少マトリゲル</td><td>BD Bioscience</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Syto-16</td><td>Invitrogen</td><td>S7578</td><td>指示通りに 13 </td></tr><tr><td>24 ウェル培養プレート</td>で使用 <td>Fisher Scientific</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Stereoscopic microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養インキュベーター</td><td>Thermo</td><td>3110</td><td></td></tr></tbody></table>

小説<em&gt;エクスビボ</emマウス胎児ハート&gt;文化法

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

マウスの発達研究は妊娠中に胚の到達不能によって妨げられている。したがって、プロトコルを分離し、関心のある個々の器官培養物は、両方の発展の変化を可視化することができると新規な治療戦略の方法を提供することが不可欠である。妊娠の後期段階で胚の心臓の長期培養を促進するために、我々は摘出心臓が半固体、希釈マトリゲルで培養されているプロトコルを開発しました。この基板は、三次元構造を維持するのに十分なサポートを提供するが、継続的な縮小を可能にするのに十分に柔軟である。簡単に言うと、心臓を胚から切除され、増殖培地で1:1に希釈したマトリゲル冷の混合物中に置いた。希釈したマトリゲルが固化した後、増殖培地を培養皿に添加される。胎生16.5限り遅く摘出ハーツは4日後に解剖のために生存していた。冠状動脈神経叢の分析は、このメソッドがないことを示してい冠状血管の開発を妨害。したがって、私たちは、胚の心の長期培養のための新たな方法を提示する。

この技術を用いて、心臓の三次元形態を維持し、継続的な収縮（ 映画1）で示されるように、実行可能なままである。これらの収縮は心室に比べ心房で一貫してより顕著である。文化に続いて、ハートは固定されており、処理された特定のマーカー発現や構造を調べるために免疫組織または組織学のどちらかのために、図1（a）は固定され、24時間培養したマウス胎児の心臓の心室や大血管のベースを示しており、ために処理することができます内皮細胞を標識する免疫組織化学。これらの共焦点顕微鏡写真は、冠状血管系は子宮 （ 図1B） に維持された比較的高齢胚から摘出した心臓のように表示されますことを実証している。しかし、心臓の培養のex vivoで冠状血管は、子宮内で維持された中心部に比べて小さく見えない。両方の心の中で、目心室の電子頂点は、組織に対する抗体の良好なアクセスを可能にするために除去した。 4日間E16.5、培養生体外での摘出心のヘマトキ...

マウスの発達研究は妊娠中に胚の到達不能によって妨げられている。妊娠の後期段階で胚の心臓の長期培養を促進するために、我々は摘出心臓が半固体、希釈マトリゲルで培養されているプロトコルを開発しました。

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

この手順の目的は、ex vivo 培養のために胚心臓を摘出することです。まず、妊娠した雌マウスから子宮角を回収します。次に、胚を回収し、解剖の準備を行います。次に、心臓を可視化するために胚の胸壁を開きます。最後に、心臓を摘出し、希釈matrigelを含む培養ウェルに入れます。最終的に、明視野顕微鏡で観察することで、健全な生存心臓が確認できる結果が得られます。ロッキング培養などの他の手法と比較して本手法の主な利点は、ビーズに結合させたタンパク質のような局所的な薬剤、またはMatrigelに低分子化合物を添加するような全体的な薬剤のいずれでも心臓を処理できる点にあります。本手法の意義は、心臓の特化した部位における事象を、完全な臓器全体の文脈の中で検証できるため、心血管疾患の治療へと応用できる点にあります。希望する胚日に至った妊娠マウスを、所属機関で承認された手法を用いて安楽死させた後、腹腔を開いて子宮角を回収および切除する前に、雌マウスに70% ethanolを十分にスプレーしてください。子宮角を冷たい1x PBSが入ったペトリ皿に入れ、洗浄します。解剖の準備が整うまで、皿を氷上に置きます。次に、子宮角を正中線に沿って切り開き、付着している胚嚢を露出させます。胚嚢を切開し、胚を冷PBSを入れた2つ目のペトリ皿に移します。子宮角が入った皿を氷上に置きます。胚を脱頭させた後、胚を仰向けにして切断します。胸壁を開き、心臓と肺を視認します。ステージによっては、胸壁が透明な場合があります。ジェノタイピングを行う場合は、胚の尾を保存してください。ピンセットを用いて慎重に心臓を持ち上げ、下部の血管を切断します。次に、大血管の上部を切断して心臓を切り離します。必要に応じて、不要な組織を除去します。冷PBSを満たし、氷上に置いた24ウェルプレートの1ウェルに心臓を入れます。同様の解剖操作を繰り返し、すべての胚心臓を単離します。ラミナーフローフード内で、希釈したMatrigelを氷上で保持しながら、冷Matrigelと目的の培養液を1対1の比率で混合します。溶液を500～1000 µL、24ウェル培養プレートの各ウェルに分注します。プレートを氷上に置きます。摘出した心臓を慎重に採取し、matrigelを含む培養プレートの各ウェルに配置します。埋め込んだ心臓の向きが重要な場合は、倒立顕微鏡とその周辺空間に70% ethanolを十分にスプレーしてください。その後、フード内で作業し、氷上のMatrigelのウェルに心臓を配置します。プレートを顕微鏡ステージに置き、Matrigelが凝固し始める間に迅速に心臓の向きを調整してください。培養皿を37°Cの加湿インキュベーターに入れ、Matrigelを約30分間凝固させます。心臓が入った各ウェルに、あらかじめ温めておいた培養液を1 mLずつ加

a-novel-ex-vivo-culture-method-for-the-embryonic-mouse-heart

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、マウス胚の皮膚の切開およびex vivoでの文化について説明します。培養系は、組織表面を横切って気液界面を維持し、倒立顕微鏡でイメージングを可能にする。メラノブラスト、現像皮膚の成分は、それらの蛍光挙動は、共焦点顕微鏡を用いて観察することを可能に標識される。...

ex vivoで培養マウス胚の皮膚およびメラノブラストの移行のライブイメージング

我々は、（E）9.5およびそれ以降の段階の胚日でのマウス胚内に胚または多能性細胞に由来する内因性および移植細胞の細胞運命および表現型の両方を監視するために、染料を注入するためにDNAベクター、ウイルス、および細胞を一連の方法を記載開発。...

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