新規高分解能

本手順の全体的な目的は、正常な脳および脳腫瘍に関連する血管への動員パターンを経時的に追跡し、骨髄由来前駆細胞の高解像度単一細胞画像を取得することである。これは、ドナーマウスから脛骨および大腿骨を取り出して蛍光標識された骨髄前駆細胞を回収し、それらの細胞を放射線照射したレシピエントマウスに注入することで達成される。次のステップでは、頭蓋窓チャンバー内において、これらのキメラマウスに頭蓋内GBM異種移植腫瘍を形成させる。

次に、マウスに対して定位放射線照射を含むさまざまな治療レジメンを行います。最終ステップとして、2光子共焦点顕微鏡を用いてマウスのイメージングを行います。最終的に、この手法を用いることで、さまざまなモデルにおいて頭蓋内の血管新生メカニズムを動的に研究することが可能になります。

ex vivo組織の組織病理学的検査などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、脳内における血管形成に関する重要な動的情報を研究できることです。これにより、頭蓋内新生血管形成のメカニズムに関する主要な疑問を明らかにすることができます。本手法は頭蓋内新生血管形成への知見を得るために利用できるだけでなく、頭蓋内虚血や脳卒中、神経変性疾患、また脳への腫瘍細胞転移のメカニズムなど、脳内の他のシステムや疾患プロセスにも適用可能です。

本ビデオの制作にあたり、厳格な無菌操作に従うことが困難でした。そのため、バイオセーフティキャビネットの開口部を12インチ以上に広げ、動物へのドレーピングも行っていません。これは、視聴者が実験手順をより明確に視認し、操作内容を把握しやすくするためです。実際の実験では、無菌操作を厳格に遵守してください。

GFPドナーマウスの蛍光発現を確認してから本手順を開始し、施設動物ケア委員会のガイドラインに従って安楽死させます。次に、無菌条件下で両後肢を洗浄し、脛骨と大腿骨を採取します。骨から余分な組織をすべて取り除きます。

次に、抽出した4本の骨の両端からエンドプレートを取り除きます。22ゲージの針と1 mLの滅菌PBSを用いて洗浄します。骨髄がすべて洗い流されると、骨は透明になります。

その後、抽出した骨髄懸濁液を混合します。この懸濁液には約2,000万個の細胞が含まれているはずであり、これは3匹のレシピエントマウスの再構成に十分な量です。次に、27ゲージのツベルクリン注射針を3本用意し、それぞれの針に骨髄懸濁液を300 µLずつ吸引します。

マウスを拘束器に固定した状態で、方向を確認するために尾部の背側表面に印を付けます。その後、以前に照射を行った3匹のマウスの尾側静脈に懸濁液を注入します。

無菌条件下で本手順に従い、NSGマウスを処置します。キメラ骨髄移植NSGマウスに麻酔をかけ、IACUCで承認された予防的鎮痛剤を投与します。角膜の脱水を防ぐため、ティアジェルを塗布します。

まずベタジン溶液で頭部を洗浄し、次にアルコールで洗浄して余分な毛を除去します。その後、さらにアルコールで下層の頭皮を洗浄します。耳の中点から目のすぐ上まで切開します。

最初の切開線の両側から頭皮を取り除き、下にある頭蓋骨を約5 mm露出させます。次に、頭蓋骨表面の解剖学的指標を確認します。続いて、2%リドカイン・エピネフリン溶液を注入して、骨膜を特定し、剥離させます。

その後、鋭利な器具を用いて骨膜を頭蓋骨表面から剥離させます。次に、2.7 millimeterのTR refine drillを使用し、頭蓋骨の右半球でLambdaとbgmaの中間に位置する直径2.7 millimeterの円形骨片を薄く削ります。この際、下層の硬膜および組織を保護するため、ドリルで骨を貫通させないように注意してください。

次に、解剖セット、ピンセット、および歯科用フックを使用し、慎重かつ制御された力で、弱化した骨片を除去します。続いて、30ゲージのHamiltonシリンジに10 µLの細胞懸濁液を充填し、針を脳定位固定装置に装着します。その後、マウスを脳定位固定装置に固定します。

その後、生成されたウィンドウの中心点に針を合わせ、皮質表面に触れるまで針を下げます。次に、デジタル座標をリセットします。そして、皮質組織内に針を3.2 millimeters下げます。

次に0.2 millimeters後退させ、3 millimetersの深さで注入します。深部注入は10 µL/minの速度で行ってください。注入が完了したら、針をゆっくりと引き抜く前に、1分間そのまま保持します。

次に、マウスを固定具から取り出します。その後、滅菌したPBSを滴下し、脳表面の湿潤状態を維持します。

2.7 mmのウィンドウを密閉するため、脳表面に3 mmのカバーガラスを配置します。次に、周囲の頭蓋骨を乾燥させます。続いて、Vetbondを塗布して、頭皮組織を頭蓋骨に接着し、カバーガラスを固定します。

ガラスの下に漏れ出し、イメージング能が低下するため、塗布しすぎないようにしてください。次に、フード内で新しい歯科用アクリル粉末と溶液を混合し、22ゲージの針を使用して、vet bondの上に混合物を塗布します。密閉性を確保するため、アクリルはガラスカバースリップの端にわずかに重なるように塗布しますが、ガラスカバースリップ自体を覆わないようにしてください。

このステップでは、麻酔をかけたマウスを、設計済みのXAD 2 25ステレオタクティック照射装置内のカスタムヘッドリストレイナーに設置します。X線管をピーク電圧40 kV、電流0.05 mAに設定し、2 mmのアルミニウムフィルターを用いて360度のコーンビームCTスキャンを行います。得られた画像を用いて、放射線のアイソセンターが右半球に向けられ、かつ背腹方向に中心となるようにステージの位置を調整します。

放射線を標的にするために利用可能なコリメータは多種多様であり、このモデルの適応性の高さを示しています。本手法では、半球状照射のために8 mm × 11 mmのコリメータを使用します。半球状コリメータをX RAD 2 25定位放射線照射装置に挿入します。

コリメータを介して上部と下部の両方から単一のCT直交画像を取得し、解剖学的な骨構造を特定してモニター上でステージ位置を微調整することで、頭部の位置決めが正しいことを確認します。XAD 2 25 IRRADIATORのアルミフィルターを0.93 millimeterの銅治療フィルターに変更します。次に、X線管プログラムをピーク電圧225 kV、13 milliampsで実行し、上部からAP方向に向かって放射線量の半分を照射します。

ガントリーを最下位に戻し、下側からPA方向に向けて放射線量の後半分を照射します。この手順では、あらかじめ作製した頭蓋内ウィンドウマウスを麻酔し、アルコールスプレーを用いてウィンドウを清浄にします。作製したキメラマウスに組み込まれたフルオロクロムに基づき、共焦点顕微鏡のチャンネルを設定します。

あるいは、イメージングセッション間の変動を抑えるため、以前の設定を再利用します。この場合、イメージングに必要なタグ（血管用にはデキストラン）を後肢の尾静脈に注射します。マウスを特製の頭部固定具の上に伏せさせ、可塑性プラスチリンで固定し、頭部がレーザーに対して垂直になるように調整してから、固定具を移動可能な顕微鏡ステージ上に水平に設置します。

第1チャネルのレーザーをオンにし、チャンバーのウィンドウ上のレーザービームの交点を直接確認しながら、頭蓋内ウィンドウの中心に配置します。5倍のレンズを用いてウィンドウ全体の各チャネルの画像を撮影し、それを10倍および20倍の長距離レンズによる他の高解像度画像のマップとして使用します。この概略図は、手術プロセスに関連する技術的エラーを強調し、それぞれが生成される画像にどのような影響を与えるかを示しています。

ウィンドウの下に閉じ込められた空気は、画像上に気泡として現れます。ガラス上のアクリルの蓄積は遠赤色チャネルで自家蛍光を発し、視野の一部を遮ります。同様に、イメージング中のウィンドウ上の汚れは、画像内で自家蛍光のフレアとして現れます。

完璧な頭蓋内ウィンドウを作成できたとしても、顕微鏡下では問題が発生することがあります。呼吸によるアーティファクトは画像に線状の乱れをもたらし、フレーム上でのマウスの固定位置が不適切な場合は、画像が断片化されます。レーザーが組織の一部のみを走査するため、後処理によってCFPタグ付き細胞用の追加チャンネルを加えることができ、CFP画像からGFP画像を差し引くことで、真のCFP信号を抽出することが可能です。

さらに、IV型コラーゲン線維の第2高調波発生自発蛍光特性を利用することで、血管基底膜をイメージングすることが可能です。5つの蛍光チャンネルを利用できるため、本論文で述べている新しいミラーリングモデルにおいて、ユーザーは極めて高い柔軟性と適応性を持たせることができます。この手順を実施する際は、外科的手技に使用される有害物質に留意することが重要です。

また、長期的なイメージングの間、脳組織に損傷を与えないようにするためには、細心の注意を払い、詳細まで徹底的に配慮することが不可欠です。このビデオを視聴することで、蛍光標識された前駆細胞を持つキメラマウスの作製方法を十分に理解し、腫瘍細胞の移植後、治療介入の有無にかかわらず、頭蓋内血管の高解像度リアルタイム画像を撮影できるようになるはずです。