新規高分解能イメージング技術

この手順の全体的な目標は、骨髄由来の前駆細胞の高解像度の単一細胞画像を取得することです 正常な脳および脳腫瘍に関連する血管系への動員パターンを経時的に追跡します。これは、ドナーマウスから脛骨と大腿骨を切除して蛍光性骨髄前駆細胞を取得し、それらの細胞を放射線を受けたレシピエントマウスに注入することによって達成されます。第2のステップは、頭蓋窓チャンバー内のキメラマウスで頭蓋内GB M異種移植片を生成することです。

次に、マウスは定位誘導放射線を含むさまざまな治療計画を受けます。最後のステップは、2光子共焦点顕微鏡でマウスをイメージングすることです。最終的に、この方法論を使用して、さまざまなモデルで頭蓋内血管新生のメカニズムを動的に研究できます。

この手法は、ex vivo組織の組織病理学のような既存の方法よりも優れている点として、脳内の血管形成に関連する重要な動的情報を研究できることが挙げられます。そのため、頭蓋間血管新生のメカニズムを取り巻く重要な質問に答えることができます。この方法は、頭蓋内血管新生に関する洞察を提供するために使用できますが、頭蓋内虚血や脳卒中神経変性疾患、脳への腫瘍細胞転移のメカニズムなど、脳内の他のシステムや疾患プロセスにも適用できます。

このビデオの目的上、厳格な無菌技術に従うことができませんでした。そのため、バイオセーフティフードは12インチを超える開口部であり、動物はドレープされていないため、視聴者はより鮮明な画像を取得し、実験作業の手順を方向付けることができます。無菌技術は厳密に従うべきです。

この手順は、GFPドナーマウスの蛍光発現を確認することから開始し、施設動物管理委員会のガイドラインに従って安楽死させます。次に、無菌状態で作業しながら、両方の後肢を清掃し、脛骨と大腿骨を切除します。骨から余分な組織をすべて取り除きます。

次に、抽出した4つの骨の両端からエンドプレートを取り外します。22ゲージの針と1ミリリットルの滅菌PBSでそれらを洗い流します。骨髄がすべて洗い流されると、それらは透明になります。

その後、抽出した骨髄懸濁液を混合します。まあ、それは約2000万個の細胞を含んでいるはずで、これは3つの宿主マウスが再構成するのに十分です。次に、3つの27ゲージのツベルクリン針を準備し、それぞれに300マイクロリットルの骨髄懸濁液を引き込みます。

マウスが拘束具に配置されている間。背側の尾面に印を付けて、自分の向きを確認します。次に、以前に照射した3つの外側尾静脈に懸濁液を注入します。

この手順では、無菌条件下で作業するスキッドマウスをうなずかせます。キメラ骨髄うなずきマウスに麻酔をかけ、iacuc 承認の先制鎮痛剤を投与します。角膜の脱水を防ぐために涙液ジェルを塗布します。

最初にベタジン溶液で頭をきれいにし、次にアルコールで頭をきれいにし、余分な髪を取り除きます。次に、アルコールで下にある頭皮をさらにきれいにします。耳の中点から目のすぐ上まで切開します。

最初の切開部の両側にある頭皮を取り外して、下にある頭蓋骨の約5ミリメートルを露出させます。次に、頭蓋骨表面の解剖学的ランドマークを特定します。次に、2%リドカインにエピネフリン溶液を注入することにより、骨膜を同定して持ち上げます。

その後、鋭利な器具で頭蓋骨表面から骨膜を解剖します。次に、2.7ミリメートルのTRリファインドリルを使用して、ラムダとbgmaの両方から等距離にある頭蓋骨の右半球にある2.7ミリメートルの円形の骨フラップを弱めます。下にある硬膜と組織を保護するために、ドリルで骨を貫通しないでください。

次に、解剖、ピンセット、歯科用フックを使用して、弱った骨フラップを意図的でありながら制御された力で取り外します。次に、30ゲージのハミルトンシリンジに10マイクロリットルの細胞懸濁液を装填し、針を定位フレームに置きます。次に、マウスを定位フレームに置きます。

その後に生成されたウィンドウの中心点に針を合わせ、皮質表面に触れるまで針を下げます。次に、デジタル座標をリセットします。次に、針を皮質組織に3.2ミリメートル下げます。

その後、0.2mm後退させ、3mmで注入します。深度注入は、毎分10マイクロリットルの速度で実行する必要があります。注射が完了したら、針を1分間そのままにしてから、ゆっくりと引っ込めます。

次に、マウスをフレームから取り外します。その後、脳の表面を水分補給します。滅菌PBSの滴を使用。

脳の表面に3mmのカバースリップを置き、2.7mmの窓を密閉します。次に、周囲の頭蓋骨を乾かします。次に、獣医用ボンドを貼って頭皮組織を頭蓋骨に接着し、カバースリップを所定の位置に保ちます。

塗りすぎはガラスの下に漏れて撮像能力が低下するため、使用しないでください。次に、フード内で新鮮な歯科用アクリルパウダーと溶液を混合し、22ゲージの針を使用して獣医用ボンドに混合物を塗布します。しっかりと密閉するために、アクリルをガラスカバースリップの端とわずかに重ねるように塗布しますが、ガラスカバースリップを覆うようにはしません。

このステップでは、麻酔をかけたマウスを家の中で設計されたXAD 2 25定位照射器内のカスタムヘッドレストレインに入れます。X線管を40ピークキロ電圧と0.05ミリアンペアで駆動し、2ミリメートルのアルミニウムフィルターを介して360度のコーンビームCTスキャンを取得します。この画像を使用して、放射線ISOの中心が右半球を向け、背側の腹側方向の中心になるようにステージを配置します。

放射線を対象とするために使用できるコリメータは多種多様であり、モデルの適応性を示しています。この場合、半球の照射には8ミリメートル×11ミリメートルを使用します。半球コリメータをX RAD 2 25定位照射器に挿入します。

コリメータを介して上部と下部の両方から単一のCT直交画像を取得し、解剖学的骨構造を特定し、モニター上のステージ位置を手動で微調整することにより、頭部の正しい位置を確保します。XAD 2 25 IRRADIATORアルミフィルターを0.93mm銅処理フィルターに交換します。次に、X線管プログラムを225ピークのilla電圧と13ミリアンペアで実行し、放射線量の半分を上からAP方向に投与します。

ガントリーを下部の位置に戻し、下からPA方向に放射線量の後半を投与します。この手順では、以前に生成された頭蓋内ウィンドウマウスを麻酔し、アルコールスプレーを使用してウィンドウを清掃します。共焦点顕微鏡のチャンネルを、生成されたキメラマウスに組み込まれた蛍光色素によって決定されるように設定します。

または、以前の設定を再利用して、イメージングセッション間のばらつきを減らします。イメージングに必要なタグを外側尾静脈(この場合は血管系用のデキストラン)に注入します。マウスをカスタムメイドのヘッド拘束具に反転させ、成形可能な粘土で支持し、ヘッドがレーザーに対して垂直であることを確認し、拘束具を可動顕微鏡ステージに平らに負荷します。

最初のチャネルレーザーをオンにし、チャンバーの窓のレーザービームの交点を直接見て、頭蓋内窓の中心に配置します。5 x レンズでウィンドウ全体の各チャンネルの画像を撮影し、10 x および 20 x の長距離レンズで他の高解像度画像のマップとして使用します。この回路図は、外科的プロセスに関連する技術的なエラーを強調し、それぞれが生成される画像に与える影響を示しています。

窓の下に閉じ込められた空気は、画像上に泡として見えます。ガラスに蓄積したアクリルは、遠赤チャネルで自家蛍光を発し、視野の一部を遮ります。同様に、イメージング中の窓の汚れは、画像に自己蛍光フレックスとして表示されます。

完璧な頭蓋内窓でさえ、顕微鏡下に置くと問題が発生する可能性があります。呼吸アーティファクトは画像に線を引く結果になり、フレーム上のマウスの位置が悪いと画像がセグメント化されます。レーザーはポスト画像処理で組織の一部のみを横切るため、CFPタグ付き細胞用のチャネルを追加して、CFP画像からGFP画像を差し引いて真のCFPシグナルを明らかにすることができます。

また、コラーゲン4本繊維の第2高調波発生自家蛍光特性を利用して、血管系の基底膜をイメージングすることができます。5つの蛍光チャンネルが利用できるため、この論文で説明する新しいミラーリングモデルの柔軟性と適応性が大幅に向上します。この手順を試みるときは、外科的処置中に使用される危険な製品を覚えておくことが重要です。

また、長期のイメージングを通じて脳組織が損傷を受けないように、細心の注意を払い、細部に特に注意を払うことも不可欠です。このビデオを見た後、蛍光前駆細胞を持つキメラマウスを作成する方法を十分に理解し、治療的介入の有無にかかわらず、腫瘍細胞移植後の頭蓋内血管系の高解像度リアルタイム画像をキャプチャできるようになるはずです。