Name: 管細胞の収集培養初代ラットインナー髄 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: 学ぶラット内髄集合管細胞の初代培養法。アルギニン・バソプレシン介在性水再吸収の分子メカニズムを解明するため、酵素処理による細胞分離と培養手順を詳細に説明します。

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この作品は、ドイツ学術振興（; KL 1415/3-2とKL 1415/4-2 DFG）によってサポートされていました。

1。準備<ol><li>培養皿の準備<ol><li> 4で解凍コラーゲンタイプIV O / N°C、0.1％滅菌酢酸に溶かし。使用するボリュームは、細胞が播種されるようにされている料理の種類や数によって異なります。 2μgの個/ cm 2を使用します。 </li><li>室温で1時間、少なくとも料理をインキュベートし、蒸留水（A. tridest）で2回洗浄する。 </li><li>料理は適切に乾燥させます。 </li></ol></li><li>媒体の補充<ol><li> 、500mlの培地に1.75グラムのブドウ糖を追加することで、最大4.5グラム/ Lに血糖値を上げます。培地600ミリオスモルへを調整するには、それぞれ、200ミリオスモルと100ミリオスモルによって浸透圧を高めるために、100mMのNaClと100mMの尿素を加える。 </li><li> 600ミリオスモルDMEM培地に1％非必須アミノ酸、1％ultroser、500μMの非添加、20 U / mlのナイスタチン及び0.25μgの/ mlのゲンタマイシン（50μgの/ mlの濃度とストック溶液の1:200希釈）を追加新たに準備の日に。 </li></ol></李&gt; <li>酵素溶液<ol><li> DPBS含有0.25μgの/ mlのゲンタマイシンおよびナイスタチンに1 mg / mlのヒアルロニダーゼおよび2.2 mg / mlのコラゲナーゼを追加します。 2腎臓内部の髄質の消化のため、この酵素溶液1mlを準備します。溶液を濾過滅菌しなければならず、50ミリリットルファルコンチューブに格納されている。 </li></ol></li></ol> 2。ダクト（IMCD）細胞を回収初代ラットインナー髄の栽培すべての動物の取り扱い手順は、ローカルおよび連邦法に準拠して行わなければならない。 <ol><li> CO 2のラット（CO 2で飽和ボックスで）またはイソフルラン（; 2から2.5パーセントイソフルランとエアーフロー350〜400ミリリットル/分のU-400麻酔ユニット、Univentor株式会社、マルタ）Anaesthetize。白っぽい内側と外側の暗い髄質の境界の正確な検出を可能出血のために動物の首を刈る。また、出血が孤立し、赤血球の数を最小限に抑えることができます。腎臓を取り出し、氷の上で（上記参照）ゲンタマイシンおよびナイスタチンを補っ滅菌DPBSでそれらを洗ってください。すべてのさらなるステップは、滅菌クリーンベンチの条件下で実施されるべきである。 </li><li>過剰な液体を除去する滅菌湿布にDPBS溶液から腎臓を転送します。滅菌ピンセットとハサミで脂肪腎臓カプセルを取り外します。 </li><li>腎臓はまだ圧縮で固定された、外側（皮質）側の縦軸横に少しカット。完全にカットスルーするのが、腎盂に接続し、一枚でそれを残していないことを確認してください。 </li><li>湾曲したハサミで丁寧にロゼきらめくアウター髄質に囲まれている白っぽい内側の髄質を解剖。氷の上を60mm培養皿にゲンタマイシンおよびナイスタチンを含む、DPBSでそれらを収集します。 </li><li>すべて髄質たら氷の上に分離し、収集され、それらは単にバッファで覆われているレベルにDPBSの量を減らす。 5のキューブに髄質をカットする滅菌カミソリの刃を使用して、ミリメートル3。 </li><li>炎に簡単にそれを保持することによって溶融、滅菌パスツールピペットの鋭い端を丸める。ピペットは、続行する前に冷却されていることを確認します。 </li><li>丸みを帯びたパスツールピペットを用いて、ヒアルロニダーゼおよびコラゲナーゼ（1.3.1を参照）を用いて新たに調製滅菌酵素溶液を含有する50ミリリットルファルコンチューブに組織懸濁液を移す。しっかりと蓋を閉め、37℃で1.5のための定期的な卓上水浴中で連続攪拌（220回転）の下でインキュベート - 2時間。 </li><li>サスペンションを均一混濁になるまで、懸濁液の粉砕のために、ラウンドパスツールピペット（上記参照）と、上下に数回混合物をピペット。 </li><li> 300 xgで5分間16℃の懸濁液を遠心上清を捨て、再びゲンタマイシンおよびナイスタチンと遠心分離機を含む、DPBSで徹底的にペレットを再懸濁します。一度この洗浄工程を繰り返します。 </li><li>完全培地と種子、それらをCで細胞を再懸濁しulture料理および/またはマイクロタイターウェルプレート。 2髄質（1動物）の調製は、1を60mm培養皿に十分な細胞が得られます。 </li><li> 24時間後、600ミリオスモルDMEMで細胞を2回洗浄し、新鮮な培地を追加します。来週中に、細胞を2〜3回（ 図1）を洗浄する必要があります。 6-8日播種後、IMCD細胞を実験に使用することができる。実験を開始する前に、24時間非添加およびナイスタチンを含まない培地でそれらをインキュベートすることを忘れないでください。そうでなければAQP2は形質膜に排他的に配置される。 </li></ol>

<ol><li>Stoos, B. A., Naray-Fejes-Toth, A., Carretero, O. A., Ito, S., Fejes-Toth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+mouse+cortical+collecting+duct+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Characterization of a mouse cortical collecting duct cell line.</a> Kidney International. 39, 1168-1175 (1991).</li>
<li>Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+a+human+cell+line+transformed+by+DNA+from+human+adenovirus+type+5%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+general+virology%22%5BJournal%5D)">Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5.</a> The Journal of general virology. 36, 59-74 (1977).</li>
<li>Gluzman, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SV40-transformed+simian+cells+support+the+replication+of+early+SV40+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants.</a> Cell. 23, 175-182 (1981).</li>
<li>Ala, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+studies+of+twelve+mutant+V2+vasopressin+receptors+related+to+nephrogenic+diabetes+insipidus%3A+molecular+basis+of+a+mild+clinical+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Functional studies of twelve mutant V2 vasopressin receptors related to nephrogenic diabetes insipidus: molecular basis of a mild clinical phenotype.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 9, 1861-1872 (1998).</li>
<li>Richardson, J. C., Scalera, V., Simmons, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+strains+of+MDCK+cells+which+resemble+separate+nephron+tubule+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Identification of two strains of MDCK cells which resemble separate nephron tubule segments.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 673, 26-36 (1981).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin+2+Promotes+Cell+Migration+and+Epithelial+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Aquaporin 2 Promotes Cell Migration and Epithelial Morphogenesis.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. , (2012).</li>
<li>Perantoni, A., Berman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+Wilms%27+tumor+line+%28TuWi%29+and+pig+kidney+line+%28LLC-PK1%29+typical+of+normal+kidney+tubular+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro%22%5BJournal%5D)">Properties of Wilms' tumor line (TuWi) and pig kidney line (LLC-PK1) typical of normal kidney tubular epithelium.</a> In vitro. 15, 446-454 (1979).</li>
<li>Katsura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+and+regulated+membrane+expression+of+aquaporin+1+and+aquaporin+2+water+channels+in+stably+transfected+LLC-PK1+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7212-7216 (1995).</li>
<li>Hull, R. N., Cherry, W. R., Weaver, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+characteristics+of+a+pig+kidney+cell+strain%2C+LLC-PK%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro%22%5BJournal%5D)">The origin and characteristics of a pig kidney cell strain, LLC-PK.</a> In vitro. 12, 670-677 (1976).</li>
<li>Nedvetsky, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+regulation+of+aquaporin-2+abundance+and+degradation+by+protein+kinase+A+and+p38-MAP+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Reciprocal regulation of aquaporin-2 abundance and degradation by protein kinase A and p38-MAP kinase.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 21, 1645-1656 (2010).</li>
<li>Iolascon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Two+Novel+Missense+Mutations+in+the+AQP2+Gene+Causing+Nephrogenic+Diabetes+Insipidus%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Two Novel Missense Mutations in the AQP2 Gene Causing Nephrogenic Diabetes Insipidus.</a> Nephron Physiology. 105, p33-p41 (2007).</li>
<li>Deen, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-2+transfection+of+Madin-Darby+canine+kidney+cells+reconstitutes+vasopressin-regulated+transcellular+osmotic+water+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-2 transfection of Madin-Darby canine kidney cells reconstitutes vasopressin-regulated transcellular osmotic water transport.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 8, 1493-1501 (1997).</li>
<li>Valenti, G., Frigeri, A., Ronco, P. M., D'Ettorre, C., Svelto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+functional+analysis+of+water+channels+in+a+stably+AQP2-transfected+human+collecting+duct+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Expression and functional analysis of water channels in a stably AQP2-transfected human collecting duct cell line.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271, 24365-24370 (1996).</li>
<li>Steele, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+immortalization+of+principal+cells+from+mouse+collecting+duct%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Telomerase immortalization of principal cells from mouse collecting duct.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299, F1507-F1514 (2010).</li>
<li>Bens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticosteroid-dependent+sodium+transport+in+a+novel+immortalized+mouse+collecting+duct+principal+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Corticosteroid-dependent sodium transport in a novel immortalized mouse collecting duct principal cell line.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 10, 923-934 (1999).</li>
<li>Hasler, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+regulation+of+aquaporin-2+expression+in+vasopressin-responsive+renal+collecting+duct+principal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Long term regulation of aquaporin-2 expression in vasopressin-responsive renal collecting duct principal cells.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277, 10379-10386 (1074).</li>
<li>Miller, R. L., Sandoval, P. C., Pisitkun, T., Knepper, M. A., Hoffert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasopressin+inhibits+apoptosis+in+renal+collecting+duct+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Vasopressin inhibits apoptosis in renal collecting duct cells.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. , (2012).</li>
<li>Kleinman, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+complexes+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Basement membrane complexes with biological activity.</a> Biochemistry. 25, 312-318 (1986).</li>
<li>Storm, R., Klussmann, E., Geelhaar, A., Rosenthal, W., Maric, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmolality+and+solute+composition+are+strong+regulators+of+AQP2+expression+in+renal+principal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Osmolality and solute composition are strong regulators of AQP2 expression in renal principal cells.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 284, 189-198 (2003).</li>
<li>Maric, K., Oksche, A., Rosenthal, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-2+expression+in+primary+cultured+rat+inner+medullary+collecting+duct+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-2 expression in primary cultured rat inner medullary collecting duct cells.</a> Am. J. Physiol. 275, 796-801 (1998).</li>
<li>Liebenhoff, U., Rosenthal, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Rab3-%2C+Rab5a-+and+synaptobrevin+II-like+proteins+in+a+preparation+of+rat+kidney+vesicles+containing+the+vasopressin-regulated+water+channel%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of Rab3-, Rab5a- and synaptobrevin II-like proteins in a preparation of rat kidney vesicles containing the vasopressin-regulated water channel.</a> FEBS Lett. 365, 209-213 (1995).</li>
<li>Lorenz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+is+sufficient+for+triggering+the+exocytic+recruitment+of+aquaporin-2+in+renal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP is sufficient for triggering the exocytic recruitment of aquaporin-2 in renal epithelial cells.</a> EMBO Rep. 4, 88-93 (2003).</li>
<li>Tamma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prostaglandin+E2+analogue+sulprostone+antagonizes+vasopressin-induced+antidiuresis+through+activation+of+Rho%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The prostaglandin E2 analogue sulprostone antagonizes vasopressin-induced antidiuresis through activation of Rho.</a> J. Cell Sci. 116, 3285-3294 (2003).</li>
<li>Maric, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+volume+kinetics+of+adherent+epithelial+cells+measured+by+laser+scanning+reflection+microscopy%3A+determination+of+water+permeability+changes+of+renal+principal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Cell volume kinetics of adherent epithelial cells measured by laser scanning reflection microscopy: determination of water permeability changes of renal principal cells.</a> Biophys. J. 80, 1783-1790 (2001).</li>
<li>Gonzalez, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+stimulates+renin+in+inner+medullary+collecting+duct+cells+via+protein+kinase+C+and+independent+of+epithelial+sodium+channel+and+mineralocorticoid+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II stimulates renin in inner medullary collecting duct cells via protein kinase C and independent of epithelial sodium channel and mineralocorticoid receptor activity.</a> Hypertension. 57, 594-599 (2011).</li>
<li>Chou, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+aquaporin-2+trafficking+by+vasopressin+in+the+renal+collecting+duct.+Roles+of+ryanodine-sensitive+Ca2%2B+stores+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of aquaporin-2 trafficking by vasopressin in the renal collecting duct. Roles of ryanodine-sensitive Ca2+ stores and calmodulin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275, 36839-36846 (2000).</li>
<li>Uawithya, P., Pisitkun, T., Ruttenberg, B. E., Knepper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+native+inner+medullary+collecting+duct+cells+from+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of native inner medullary collecting duct cells from rat kidney.</a> Physiological Genomics. 32, 229-253 (2008).</li>
<li>Tchapyjnikov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+nuclei+from+native+renal+inner+medullary+collecting+duct+cells+using+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of nuclei from native renal inner medullary collecting duct cells using LC-MS/MS.</a> Physiological Genomics. 40, 167-183 (2010).</li>
<li>Stefan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+cAMP-dependent+signaling+by+phosphodiesterase-4D+is+involved+in+the+regulation+of+vasopressin-mediated+water+reabsorption+in+renal+principal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of cAMP-dependent signaling by phosphodiesterase-4D is involved in the regulation of vasopressin-mediated water reabsorption in renal principal cells.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 18, 199-212 (2007).</li>
<li>Klussmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibitory+role+of+Rho+in+the+vasopressin-mediated+translocation+of+aquaporin-2+into+cell+membranes+of+renal+principal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An inhibitory role of Rho in the vasopressin-mediated translocation of aquaporin-2 into cell membranes of renal principal cells.</a> J. Biol. Chem. 276, 20451-20457 (2001).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

私たちは、初代ラットIMCD細胞の調製と培養するための詳細なプロトコルを提示します。アプローチでは、1匹のラット20から細胞21 cm 2とまで得られます。実験は、標準的な細胞培養装置を必要とし、約6時間以内に一人で行うことができる。したがって、このアプローチは、標準的な実験方法として好適である。 初代ラットIMCD細胞を96ウェルプレートから60ミリメートルの料理に至るまで、サイズの異なる培養皿に播種することができます。しかし、384ウェルフォーマットでの成長のための手順は、最適化が必要。私たちは、成長が減速を60 mm以上の皿を使用しないでください。細胞は、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、DNA / RNA分離、免疫蛍光顕微鏡、のCa 2 +イメージングと電気生理学10,22,23などの様々な実験に適しています。 播種後約6〜8日には、主IMCD細胞がconflに栽培されているuent単分子層（ 図2）。</stro...

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腎集合管主な細胞では、アルギニン·バソプレシン（AVP）は、原形質膜への水チャネルアクアポリン2（AQP2）の挿入を刺激による水再吸収を制御します。 AVPは、アデニリルシクラーゼことにより、cAMP形成を刺激するGタンパク質共役型バソプレッシン-2受容体（V2R）に結合する。このシグナリングカスケードの開始は、プロテインキナーゼA（PKA）の活性化をもたらす。 PKAは、原形質膜への細胞内小胞からの再分配のための重要なトリガーである、256（S256）セリンでAQP2をリン酸化する。膜挿入は、浸透勾配に沿って水の再吸収と微調整の体内の水分の恒常性を容易にします。 原因AVP分泌またはAVP-活性化シグナリング原因かの収差AVP媒介水再吸収の調節不全は、深刻な病気に関連付けられています。 V2RまたはAQP2の突然変異によって引き起こさ減少水の再吸収はELEVのに対し、腎性尿崩症につながるated血漿AVPレベルは、慢性心不全および不適切な抗利尿ホルモンの分泌（SIADH）の症候群などの心血管疾患の過度の水再吸収に関連付けられています。 AVP媒介水再吸収の重要性だけではなく、病気でその意義に由来する。 AQP2有利子に小胞と形質膜と融合のAVP-誘発転座は、現在十分に理解されていない厳密にcAMP依存性エキソサイトーシス過程を表します。 cAMP依存性エキソサイトーシスのための他の例としては、腎臓とHにおけるレニン分泌+胃の中に分泌されています。したがって、腎主要細胞内AQP2-転座を支配する分子メカニズムの解明だけでなく、他の細胞型で同様の分子プロセスを理解するのに役立つだけでなく、AVP-媒介水再吸収の障害に関連する疾患の治療のための新しい治療法に道を開くことが。 EAQP2を制御lucidatingメカニズムは、集合管主な細胞モデルを必要とします。このため、異なる哺乳類の腎臓細胞株の数が用意されています。しかしながら、これらのモデルはいくつかの欠点を有する。多くの細胞系におけるAQP2のタンパク質レベルが低い（ 表1; MDCK M1、HEK293、COS-7、、LLC-PK1）1-10、異所性に過剰発現する他の人間（MCD4、WT10）11,12またはラット（CD8） 13 AQP2。 MCD4およびCOS-7細胞ではV2受容体が発現していない。我々の知る限りそこ腎髄質内層集合管、AQP2式が最も豊富である腎臓のその部分から派生して利用できるモデルなど恒久的な細胞株はありませんが、皮質集合管1,11,13-16から。このような細胞モデルは、広く使われている例不死mpkCCD（ 例えば 17）、または最近設立mTERT-CCD 14細胞株のためのものです。両方の細胞株内因的に発現AQP2とV2Rが、それらは由来しているので皮質集合ダクトは、最も可能性の高いダクト（IMCD）細胞を収集し、内側延髄に比べ異なるプロテオームが含まれています。彼らは、例えば別のNaを表現しなければならない+交通システム。 ここでは、V2RとAQP2内因を表現文化プライマリーIMCD細胞にプロトコルを提示します。このモデルは、したがって、最も近い腎集ダクト内の生理学的状況を示す。文化を確立したように、標準実験装置他の研究室は、簡単にこのアプローチを採用することができます必要があります。

<table><tbody><tr><td>コラーゲンIV型マウス</td>BD<td>バイオサイエンス</td><td>356233</td><td></td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ</td><td>SIGMA</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼCLS-II型</td><td>Biochrom AG</td><td>C2-22</td><td></td></tr><tr><td>DMEM + GlutMAX</td><td>Invitrogen GIBCO</td><td>21885108</td><td></td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>SIGMA</td><td>N4014</td><td></td></tr><tr><td>Ultroser G</td><td>Cytogen</td><td>15950-017</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸(NEA)</td><td>Biochrom AG</td><td>K0293</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Invitrogen GIBCO</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>DBcAMP</td><td>BIOLOG</td><td>D009</td><td></td></tr></tbody></table>

管細胞の収集培養初代ラットインナー髄

Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

アルギニン·バソプレシン（AVP）はダクト校長細胞とそれによって微調整の体水分ホメオスタシスを集めることにより、水腎再吸収を促進します。 AVPは、細胞の表面上バソプレシンV2受容体（V2R）に結合し、それによって、cAMPの合成を誘導する。これは、水路アクアポリン2（AQP2）のリン酸化の変化をもたらす細胞内シグナル伝達プロセスを刺激する。プロテインキナーゼは、AQP2をphoshorylates、それによって主要な尿からの水の再吸収を促進する形質膜に細胞内の小胞からAQP2の転座をトリガします。主要細胞内の下垂体またはAVP-活性化シグナリングからAVP放出の収差はそれぞれ、中央または腎性尿崩症を引き起こす可能性があり、血中血漿AVPレベルは、慢性心不全および抗利尿ホルモン不適合分泌症候群などの心血管疾患に関連付けられています。 ここでは、cultivati​​ためのプロトコルを提示する急行V2RとAQP2内因ダクト（IMCD）細胞を収集初代ラット内側の延髄の上。細胞は、AQP2の制御の根底にある分子メカニズムを解明するのに適しているので、AVP媒介性の水再吸収の調節不全に関連する疾患の治療のための新規薬剤標的を発見する。 IMCDネズミ腎細胞は、内側髄質から得られ、六から八日播種後の実験のために使用される。 IMCD細胞は規則的な細胞培養ディッシュ、フラスコ、異なる形式のマイクロタイタープレートで培養することができ、手順は数時間を必要とし、標準的な細胞培養実験室に適している。

初代ラットIMCD細胞の正常な栽培は6-8日播種後コンフルエントな単層（ 図2）になります。 60ミリメートル培養皿あたり約6×10 6個の細胞があります。これらはIV型コラーゲン、基底膜成分を18でコーティングしたような細胞がしっかりと、培養皿に付着する。したがって、IMCD細胞はいくつかの徹底した洗浄手順の中でも切り離すことはありません。最大培養細胞の80％は、内因V2RとAQP2を表明。 AQP2を欠いた細胞がインターカレート細胞、ヘンレ、直細血管または内側髄質間質細胞のループの細い手足由来非IMCD細胞と考えられているのに対し、これらは、主要な細胞である。我々は先に示したように、600ミリオスモルの培地浸透圧はAQP2 19のダウンレギュレーションを防ぎます。また、AQP2発現は膜透過性のcAMPアナログ非添加で媒体を補充することによって維持される。 AQP2プラズマMEMBを低減するために、RANE表現したがって、その細胞内局在IMCD細胞を支持するためには、実験前に非添加約24時間せずに維持する必要があります。 AQP2のほと...

アルギニン·バソプレシン（AVP）は腎校長細胞による水の再吸収を促進を通じて体内の水分の恒常性の微調整を制御します。ここでは、AVP-媒介水再吸収の根底にある分子機構の解明に適した管細胞を集め初代ラット内側の延髄の栽培のためのプロトコルを提示します。

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP ...

この手順の全体的な目的は、VP介在性水再吸収の研究に適したラット内髄質集合管細胞（IMCD細胞）を作製することです。まず、ラットの腎臓を摘出します。次に、周囲の外髄質および皮質から内髄質を単離します。次に、単一細胞を遊離させるため、内層のmeliを酵素的に消化します。最終ステップとして、主細胞を懸濁して選択し、培養皿に播種します。最終的に、播種から6〜8日後には、細胞を実験に使用できる状態になります。この細胞培養システムは、VPが介在する水再吸収の根底にある分子メカニズムや、おそらく他のCAP依存的なTICプロセスの解明に適しています。さらに、本システムは、VP介在性水再吸収の調節不全に関連する疾患の治療に向けた、新規候補薬剤および薬剤標的の探索に利用可能です。本手順は、当研究室の博士課程学生と、当研究室の技術者であるBeata EmanおよびAndrea Gillerによって実演されます。こちらのタイムラインシーンに従い、培養皿をコラーゲンIVでコーティングします。翌日の処置の前日に、まず培地と酵素溶液を調製します。新しく調製したDMEM培地にサプリメントを添加してください。酵素溶液を調製するには、1 mg/mLのヒアルロニダーゼと2.2 mg/mLのコラゲナーゼをDPBSに添加します。溶液を滅菌し、50 mLのFalconチューブに保存します。腎臓内髄を2個消化させるごとに、1 mLの酵素溶液を調製します。このプロトコルで最も困難なステップは内髄の解剖です。成功させるために、安楽死後に動物から血液を抜いて解剖を行います。これにより、内髄と外髄の間の光沢のある境界線を検出しやすくなります。腎臓を取り出し、あらかじめ準備した滅菌DPBSに保存します。滅菌条件下で作業を行い、Gentamicin Nystatinを添加したDPBS溶液から腎臓を滅菌ガーゼに移し、余分な液体を取り除きます。次に、滅菌したメスを用いて、ガーゼに固定したまま脂肪質の腎被膜を除去します。外側または皮質側の長軸に沿って切開します。完全に切り離さないように注意し、腎盂の部分で繋がったままの状態にしておきます。次に、光沢のあるローズ色の外髄質と、白色の内髄質を確認します。湾曲した剪刀を用いて、周囲の外髄質から内髄質を慎重に切り離します。切り出した組織を、あらかじめ準備しておいたDPBS溶液に入れます。すべてのMeliを分離して氷上で回収した後、GentamicinおよびNystatinを添加したDPBS溶液の量を、Meliがバッファーでちょうど浸る程度のレベルまで減らします。滅菌済みのカミソリ刃を使用して、Meliを約5 mm³の立方体に切断します。次に、滅菌済みのパステールピペットの鋭い先端を、短時間火に当てることで溶かして丸くします。冷却後、このピペットを使用して、組織懸濁液を、あらかじめ調製しておいた新鮮な滅菌酵素溶液を含む50 milliliterのFalconチューブに移します。チューブをウォーターバスに入れ、絶えず撹拌しながら37 degrees Celsiusで1.5〜2時間インキュベートします。この時間後、懸濁液が均一に濁るまで、ピペットチップの先端を混ぜながらピペッティングを数回繰り返します。十分に均質化した後、懸濁液を5分間遠心分離します。次に、上清を除去します。ペレットを懸濁し、再び遠心分離します。この洗浄工程をもう一度繰り返します。細胞を完全補充培地で再懸濁し、培養皿またはマイクロタイターウェルプレートに播種します。分離したIMCD細胞を播種した後、赤血球や細胞残渣が顕微鏡下で評価できるかを確認してください。これにより、24時間後に分離された細胞数について、初期段階での把握が可能になります。600 mOsmのDMEMで細胞を洗浄し、新鮮な培地を添加します。翌週にかけて、細胞を2〜3回洗浄してください。IMCD細胞は、ここで見られるようにコンフルエントに増殖した播種後6〜8日で実験に使用可能になります。実験を開始する前に、DBC MPおよびINEを含まない培地で細胞を24時間インキュベートすることを忘れないでください。そうしないと、aquaporin twoが主に細胞膜に局在することになります。ラットIMCD一次細胞の培養に成功すると、播種後6〜8日でコンフルエントな単層が形成されます。アルギニン、バゾプレシン、またはフォルスコリンで刺激すると、ここで示されているように、AQP2が細胞内小胞から細胞膜へと移行します。さらに、このウェスタンブロットに示されているように、VPまたはフォルスコリンによる30分間の刺激により、IMCD細胞におけるAQP2の発現が増加します。この手順に続いて、DNA/RNA抽出、RT-PCR、および免疫沈降実験を行います。インナー Collecting duct 細胞の遺伝子および遺伝子産物を解析するために、ウェスタンブロット解析および免疫蛍光顕微鏡観察を行うことができます。内因性タンパク質を発現するこの細胞培養システムは、バイアスのないスクリーニング手法への利用に特に適しています。

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Biology

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管細胞の収集培養初代ラットインナー髄

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