蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析その場でハイブリダイゼーションサッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）
June 14th, 2013
このプロトコルは、蛍光を実行するための実験手順を説明その場でハイブリダイゼーション（FISH）。
次の実験の全体的な目標は、単一酵母細胞における単一分子特異性を持つmRNA分子の存在を検出することです。まず、酵母細胞とホルムアルデヒドをリアーゼ含有緩衝液を用いて固定します。ほとんどの細胞が明るく位相が整わなくなるまで細胞を透過します。
次に、蛍光タグ付き一本鎖DNA分子でパーミ細胞をインキュベートし、血漿洗浄したカバースリップに細胞をマウントします。最終的に、蛍光顕微鏡法によって得られた結果により、単一細胞におけるmRNA分子の存在と局在を詳細に把握することができます。この手法は、遺伝子発現、マイクロアレイ、ノーザンブロットなどの既存の方法よりも優れている点として、個々のmRNAを単一細胞で可視化できる点が
挙げられます。この方法は、文字起こしフィールドの主要な質問に答えるのに役立ちます。これには、集団内の細胞あたりのアームRNAの数を定量化することが含まれ、プロモーターレベルでの調節モデルに情報を提供できます。また、細胞周期中の転写産物の局在化と半減期を決定するためにも使用できます。
プラズマプリーン真空チャンバーの位置では、カバーがスライド上を滑ります。次に、真空チャンバーを電子レンジに入れ、密閉されていることを確認します。ポンプが始動したら、ポンプのスイッチを入れます。
真空をオンにし、電子レンジの電源を入れ、プラズマが見えてから5秒後に停止します。次に、掃除機をオフにし、次にポンプをオフにします。真空チャンバーを引き出します。
次に、カバースリップを清掃した面を上にして12に移します。ウェルプレートは酵母を約0.1〜0.2のA600に成長させます。最小培地では、10ミルの細胞で約10回のハイブリダイゼーションに十分な収量が得られます。
10 容量目の 37% ホルムアルデヒドを増殖培地に直接加え、室温で 45 分間インキュベートします。細胞を3000Gで5分間遠心分離します。ペレットを1ミリリットルのバッファーBに懸濁し、マイクロ遠心チューブに移します。
マイクロ遠心チューブで1ミリリットルの氷冷バッファーBで2回洗浄します。13, 000 RPMで1分間遠心分離します。次に、1ミリリットルのスフェロメッキを加え、緩衝液を緩衝し、摂氏37度で15分間インキュベートします。
ほとんどの細胞が黒くなるまで、数分ごとに細胞を顕微鏡で監視します。その後、氷冷バッファーで2回洗います。B. 3, 500 RPM の低速で回転します。
70%エタノールresusの1ミリリットルを追加します。ペレットを静かに吊り下げ、摂氏4度で一晩置くか、摂氏マイナス20度で無期限に保管します。ハイブリダイゼーション溶液を調製するために、100マイクロリットルのハイブリダイゼーションバッファーに1〜3マイクロリットルのプローブを添加する。
次に、ボルテックスと遠心分離機。私たちは、3つの異なるプローブセットを使用して、3つの異なる遺伝子を同時にイメージングしました。次に、固定された酵母サンプルを遠心分離し、洗浄バッファーを吸引します。
ハイブリダイゼーション溶液を加え、翌日37°Cで一晩穏やかに振とうしながら、暗闇でインキュベートします。清潔なカバーリップを150マイクロリットルの0.01%ポリリジンで5分間処理します。その後、アスピと自然乾燥します。
スライドを蒸留水で3回洗浄し、1回のXSSC Resusで1回の洗浄後に風乾し、細胞を0.1マイクログラム/ミリリットルの150マイクロリットルに懸濁します。新たに調製したダッピーを、ポリリジン処理したカバースリップに細胞懸濁液をアリコートで染色し、30分間インキュベートします。次に、長めの金埋込用培地を室温まで解凍します。
3マイクロリットルをスライドに置きます。次に、カバースリップに約0.5ミリリットルのエタノールを追加します。12ウェルプレートでカバースリップを取り外し、ピンセットで保持しながら風乾します。
カバースリップセルを下にして封入用剤に置き、暗闇で数時間または一晩硬化させます。マニキュアで端を密封し、イメージングに進みます。合計距離が 5 マイクロメートル、0.2 マイクロメートルのサイズである基準点の周りの画像のザックを撮ります。
各プローブセットに対応する各色素チャネルに対してイメージングを繰り返します。その後、添付のテキストに詳述されているように進めます。流域セグメンテーションによって細胞を同定するには、放射状勾配を使用してスポットを同定し、ガウス近似を使用してスポットを測定します。
通常、ヒストグラムは魚の画像から計算され、単一細胞に存在するmRNAの数を決定するために使用されます。顕微鏡法によるRNA定量の重要な利点は、転写産物の局在に関する情報を取得できることです。例えば、この魚は、単一のプローブを使用して、誘導可能なCCB CBF1対立遺伝子を持つ単一細胞のmRNAを同定します。
転写部位には多くのmRNA分子が存在するため、核内の転写部位の存在と位置を簡単に特定できます。異なる色素を使用して異なる遺伝子のmRNAを標識することで、同じ細胞内の複数のmRNA種の定量が容易になります。この実験では、酵母細胞をアルファ因子とソルビトールの存在下でインキュベートしました Stelara プローブを持つ魚を使用すると、データは 1 つの細胞が赤い FUS 1 開始部位で示されるフェロモンにのみ応答することを示しています。
同時に、別の細胞は主にソルビトールに応答しており、S TLの1つの開始部位は緑色とラベル付けされています。このビデオを見れば、酵母の単一mRNA分子を標識し、視覚化する方法を十分に理解できるはずです。この手法は2日で適切に実行できます。
細胞の濃度が十分に密集していることを忘れないでください。希薄なサンプルは、画像化して保存するためにより多くのフィールドを必要とします。
概要
このプロトコルは、単一のmRNAを単分子分解能で数えるための蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）の実験的手順を説明しています。この方法により、酵母細胞内の個々のmRNA分子を可視化し、転写調節と転写物の局在化に関する洞察を提供します。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 遺伝子発現
背景
- 蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）は、単分子分解能でmRNAを検出することを可能にします。
- この技術は、個々のmRNAを可視化することで、マイクロアレイや北部ブロットなどの従来の方法を上回ります。
- mRNAの局在化と定量化の理解は、転写ダイナミクスを研究する上で重要です。
- 酵母細胞はこれらの実験のモデル生物として使用されます。
研究の目的
- 単一の酵母細胞内のmRNA分子を検出し定量化する。
- 細胞周期中の転写物の局在化と半減期を調査する。
- プロモーターのレベルでの転写調節の理解を深める。
使用された方法
- ホルムアルデヒドとリアーゼバッファーを用いた酵母細胞の固定。
- プローブへのアクセスのための細胞の通過性化。
- 蛍光標識されたDNAプローブとのハイブリダイゼーション。
- mRNA局在化の可視化と定量化のための顕微鏡イメージング。
主要な結果
- 酵母細胞内の個々のmRNA分子の成功した可視化。
- 異なる刺激に対するmRNA種の定量化。
- 核内の転写部位の同定。
- 複数のmRNA種を同時に分析する技術の能力の証明。
結論
- FISHは単一細胞内のmRNAダイナミクスを研究するための強力なツールを提供します。
- 適切な技術を使用すれば、2日間でこの方法を完了できます。
- mRNAの局在化と量の理解は遺伝子調節のモデルに情報を提供できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Single-molecule mRNA visualization enables precise quantification and spatial mapping of transcript dynamics, addressing limitations of bulk population assays in target validation. This approach supports mechanistic de-risking by revealing heterogeneity in gene expression that informs predictive confidence in early discovery. Application in yeast models provides a scalable, genetically tractable system for assay development and pathway interrogation prior to mammalian translation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional heterogeneity and promoter-level regulation in single cells.
- Operational Value: Provides direct visualization of mRNA molecules to clarify functional target engagement.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by linking transcript localization to cellular phenotype and pathway activity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, spatially resolved mRNA counts per cell for assay standardization.
- Operational Value: Facilitates multiplexed detection of multiple mRNA species using distinct fluorescent probes.
- Scientific Value: Enables preparation of validated biological systems for downstream compound screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects mRNA localization and half-life measurements to transcript stability and cell cycle regulation.
- Operational Value: Supports continuity from discovery through preclinical validation via conserved transcriptional mechanisms.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by linking single-cell transcript dynamics to functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions within early discovery to support hypothesis testing and pathway clarification before lead identification, leveraging yeast as a disease-relevant system for mechanistic insight.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of transcriptional regulation and pathway clarification at single-molecule resolution.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible quantitative outputs for compound effect evaluation.
- Analytics: Provides spot-detection and Gaussian fit measurements to quantify and compare mRNA abundance across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through conserved mRNA localization and half-life principles in eukaryotic systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for multiplexed transcript analysis across diverse experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through direct observation of mRNA dynamics and reduction of mechanistic ambiguity in gene regulation models.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via fixed-cell permeabilization and standardized probe hybridization.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by linking single-cell transcript counts to phenotypic responses in screening campaigns.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative, spatially resolved mRNA data from isogenic yeast populations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, fixation protocols, and nucleic acid hybridization.
- Depends on confocal or widefield imaging systems with spot-detection algorithms for single-molecule quantification.
- Necessitates cross-team standardization of probe design, hybridization conditions, and image analysis pipelines.
- Involves adaptation considerations for different yeast strains, growth conditions, and target mRNA abundance levels.
- Includes practical limitations related to transcript accessibility, probe penetration efficiency, and background signal in fixed cells.
