蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析その場でハイブリダイゼーションサッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）

次の実験の全体的な目標は、単一酵母細胞における単一分子特異性を持つmRNA分子の存在を検出することです。まず、酵母細胞とホルムアルデヒドをリアーゼ含有緩衝液を用いて固定します。ほとんどの細胞が明るく位相が整わなくなるまで細胞を透過します。

次に、蛍光タグ付き一本鎖DNA分子でパーミ細胞をインキュベートし、血漿洗浄したカバースリップに細胞をマウントします。最終的に、蛍光顕微鏡法によって得られた結果により、単一細胞におけるmRNA分子の存在と局在を詳細に把握することができます。この手法は、遺伝子発現、マイクロアレイ、ノーザンブロットなどの既存の方法よりも優れている点として、個々のmRNAを単一細胞で可視化できる点が

この方法は、文字起こしフィールドの主要な質問に答えるのに役立ちます。これには、集団内の細胞あたりのアームRNAの数を定量化することが含まれ、プロモーターレベルでの調節モデルに情報を提供できます。また、細胞周期中の転写産物の局在化と半減期を決定するためにも使用できます。

プラズマプリーン真空チャンバーの位置では、カバーがスライド上を滑ります。次に、真空チャンバーを電子レンジに入れ、密閉されていることを確認します。ポンプが始動したら、ポンプのスイッチを入れます。

真空をオンにし、電子レンジの電源を入れ、プラズマが見えてから5秒後に停止します。次に、掃除機をオフにし、次にポンプをオフにします。真空チャンバーを引き出します。

次に、カバースリップを清掃した面を上にして12に移します。ウェルプレートは酵母を約0.1〜0.2のA600に成長させます。最小培地では、10ミルの細胞で約10回のハイブリダイゼーションに十分な収量が得られます。

10 容量目の 37% ホルムアルデヒドを増殖培地に直接加え、室温で 45 分間インキュベートします。細胞を3000Gで5分間遠心分離します。ペレットを1ミリリットルのバッファーBに懸濁し、マイクロ遠心チューブに移します。

マイクロ遠心チューブで1ミリリットルの氷冷バッファーBで2回洗浄します。13, 000 RPMで1分間遠心分離します。次に、1ミリリットルのスフェロメッキを加え、緩衝液を緩衝し、摂氏37度で15分間インキュベートします。

ほとんどの細胞が黒くなるまで、数分ごとに細胞を顕微鏡で監視します。その後、氷冷バッファーで2回洗います。B. 3, 500 RPM の低速で回転します。

70%エタノールresusの1ミリリットルを追加します。ペレットを静かに吊り下げ、摂氏4度で一晩置くか、摂氏マイナス20度で無期限に保管します。ハイブリダイゼーション溶液を調製するために、100マイクロリットルのハイブリダイゼーションバッファーに1〜3マイクロリットルのプローブを添加する。

次に、ボルテックスと遠心分離機。私たちは、3つの異なるプローブセットを使用して、3つの異なる遺伝子を同時にイメージングしました。次に、固定された酵母サンプルを遠心分離し、洗浄バッファーを吸引します。

ハイブリダイゼーション溶液を加え、翌日37°Cで一晩穏やかに振とうしながら、暗闇でインキュベートします。清潔なカバーリップを150マイクロリットルの0.01%ポリリジンで5分間処理します。その後、アスピと自然乾燥します。

スライドを蒸留水で3回洗浄し、1回のXSSC Resusで1回の洗浄後に風乾し、細胞を0.1マイクログラム/ミリリットルの150マイクロリットルに懸濁します。新たに調製したダッピーを、ポリリジン処理したカバースリップに細胞懸濁液をアリコートで染色し、30分間インキュベートします。次に、長めの金埋込用培地を室温まで解凍します。

3マイクロリットルをスライドに置きます。次に、カバースリップに約0.5ミリリットルのエタノールを追加します。12ウェルプレートでカバースリップを取り外し、ピンセットで保持しながら風乾します。

カバースリップセルを下にして封入用剤に置き、暗闇で数時間または一晩硬化させます。マニキュアで端を密封し、イメージングに進みます。合計距離が 5 マイクロメートル、0.2 マイクロメートルのサイズである基準点の周りの画像のザックを撮ります。

各プローブセットに対応する各色素チャネルに対してイメージングを繰り返します。その後、添付のテキストに詳述されているように進めます。流域セグメンテーションによって細胞を同定するには、放射状勾配を使用してスポットを同定し、ガウス近似を使用してスポットを測定します。

通常、ヒストグラムは魚の画像から計算され、単一細胞に存在するmRNAの数を決定するために使用されます。顕微鏡法によるRNA定量の重要な利点は、転写産物の局在に関する情報を取得できることです。例えば、この魚は、単一のプローブを使用して、誘導可能なCCB CBF1対立遺伝子を持つ単一細胞のmRNAを同定します。

転写部位には多くのmRNA分子が存在するため、核内の転写部位の存在と位置を簡単に特定できます。異なる色素を使用して異なる遺伝子のmRNAを標識することで、同じ細胞内の複数のmRNA種の定量が容易になります。この実験では、酵母細胞をアルファ因子とソルビトールの存在下でインキュベートしました Stelara プローブを持つ魚を使用すると、データは 1 つの細胞が赤い FUS 1 開始部位で示されるフェロモンにのみ応答することを示しています。

同時に、別の細胞は主にソルビトールに応答しており、S TLの1つの開始部位は緑色とラベル付けされています。このビデオを見れば、酵母の単一mRNA分子を標識し、視覚化する方法を十分に理解できるはずです。この手法は2日で適切に実行できます。

細胞の濃度が十分に密集していることを忘れないでください。希薄なサンプルは、画像化して保存するためにより多くのフィールドを必要とします。